登革熱 （一）登革病毒感染與機體免疫反應登革病毒感染后，潛伏期為314天，通常47天，潛伏期內采集的患者標本尚不能檢出登革病毒或相應的機體免疫反應。發病后，病毒在血液中存在的時間（病毒血癥期）約為7天，病毒NS1抗原在血液存在的時間略長。發病后45天內，可在病人的血清、血漿、白細胞、腦脊液和尸檢組織標本中分離到病毒，病毒核酸及NS1抗原在這個時期的檢出率高。病人血液中抗體水平，因個體免疫狀態不同而具有顯著差異。若以前沒有感染過登革病毒或其他黃病毒，或接種過黃病毒疫苗（如：乙腦、黃熱等），病人首次感染抗體免疫反應呈現為特異性抗體水平緩慢升高，IgM抗體出現最早，隨后出現的是IgA和IgG抗體。在發病后35天的患者中IgM抗體檢出率約為50%，發病后第5天的患者中檢出率約為80%，而在發病后第10天患者中，約99%的患者可檢出。IgM抗體水平在發病后2周達高峰，然后逐步下降，可保持23個月。IgA抗體出現略晚于IgM抗體，可保持約45天。在發病一周后，可在血液標本中檢出較低滴度的IgG抗體，之后抗體滴度緩慢升高，可持續存在多月甚至終生。如果病人屬于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染過登革病毒，有時可能是曾接種其他黃病毒疫苗或感染過其他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病毒產生反應。主要為高水平的IgG抗體，在急性期即可檢出，可持續存在10個月以上，甚至終生。IgA抗體也可在急性期標本中檢出。再次感染登革病毒的病人恢復期早期的IgM抗體滴度明顯低于首次感染，甚至無法檢出，通過計算IgM/IgG抗體比例，可以區分首次或再次登革病毒感染。IgA抗體檢測試劑在臨床診斷中的應用尚處于評價階段。登革病毒IgM/IgG抗體檢測規程【方法】膠體金法【預期用途】登革熱（Dengue Fever）是 一種由登革病毒引起的急性傳染病，主要流行于熱帶和亞熱帶國家和地區。登革病毒為單股正鏈RNA病毒，在分類學上屬于黃病毒科，黃病毒屬（flavivirus）。病毒核心為RNA與蛋白質組成的20面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，包膜含有型和群特異性抗原。病毒基因編碼3個結構蛋白（核衣殼蛋白C，膜蛋白M，包膜蛋白E）和7個非結構蛋白（NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5）。登革病毒感染可導致機體產生免疫應答，并產生病毒特異性的抗體。初次感染者，發病后35天可在血液中檢出病毒IgM抗體，發病2周后達到高峰，可維持23個月，發病1周后可檢出病毒IgG抗體，IgG抗體可維持數年甚至終生。檢測臨床登革熱癥狀的病人樣本中登革病毒抗體，有助于登革熱的輔助診斷?！緳z驗原理】采用膠體金免疫層析技術，在玻璃纖維上預包被膠體金標記的登革病毒抗原（Au-Dengue-Ag）和羊IgG(Au-羊IgG)，在硝酸纖維素膜上IgG檢測線，IgM檢測線和對照線處分別包被鼠抗人IgG單克隆抗體，鼠抗人IgM單克隆抗體和鼠抗羊IgG單克隆抗體。檢測陽性標本時，樣本中登革熱病毒IgG抗體（或IgM抗體）與Au-Dengue-Ag結合形成復合物，由于層析作用復合物沿紙條向前移動，經過IgG檢測線（或IgM檢測線）時與預包被的鼠抗人IgG單抗（或鼠抗人IgM單抗）形成“Au-Dengue-AgDengue病毒抗體鼠抗人IgG單抗（或鼠抗人IgM單抗）固相材料”夾心物而富集顯色，膠體金標記羊IgG則在對照線與鼠抗羊IgG單克隆抗體結合富集顯色，陰性標本則僅在對照線處顯色。【試劑組成成分】1，登革病毒IgM/IgG抗體試劑檢測線：鼠抗人IgM抗體、鼠抗人IgG抗體對照線：鼠抗羊IgG抗體結合墊：膠體金標記登革病毒抗原和膠體金標記羊IgG2，梓品稀釋液3，2uL吸管【樣本要求】1， 檢測樣本為血清或血漿，避免溶血。2， 血漿可用肝素、檸檬酸鈉或EDTA抗凝。3， 采集后的標本及時檢測，28C密封保存7天，長期保存需冷凍-20C，忌反復凍融。【檢驗方法】檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復至室溫1， 處理好樣本，取出試劑檢測卡，水平放置并作好標記。2， 用移液器吸取樣本2uL，或以試劑配置吸管吸取樣本至2uL刻線，滴加在檢測卡樣本孔（S1孔）。3， 在檢測卡稀釋液孔（S孔）滴加2滴（70-100uL）樣品稀釋液。4， 20分鐘同觀察記錄結果?！窘Y果報告】陽性：質控線（C）和檢測線（G）、檢測線（M）都出現紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgM/IgG抗體。質控線（C）和檢測線（G）都出現紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgG抗體。質控線（C）和檢測線（M）都出現紫紅色條帶，表示樣品中含有登革病毒IgM抗體。陰性：僅在質控線（C）出現紫紅色條帶，檢測區（M）、檢測區（G）未出現紫紅色條 帶，表示樣品中沒有登革病毒抗體或抗體濃度低于試劑的檢出水平。無效：質控線（C）未出現紫紅色條帶，表示操作不當或者試劑失效，應重新檢測。【報告方式】檢測線（G）、檢測線（M）都出現紫紅色條帶登革熱病毒IgM/IgG抗體測定：IgM陽性（+） IgG陽性（+）【注意事項】1， 檢測按照傳染病實驗管理規范和生物安全守則的規定操作，實驗后按傳染性廢物處理。2， 操作應嚴格按說明書進行。3， 保持良好的實驗室環境。4， 嚴格控制在20分鐘內觀察結果，20分鐘后觀察結果無效?！緜魅拘詮U物處理】1， 所有實驗室工作人員應熟知并遵守本制度；由專職清潔人員負責實驗廢棄物處理。實驗室放置裝有垃圾袋的有蓋污物桶，并貼有明顯標識。2， 每天實驗結束后，及時清理并妥善包裹廢棄物，送出實驗室并作好實驗室廢棄物處理記錄。3， 不具有傳染性的實驗室廢棄物（如產品包裝材料和廢紙等辦公垃圾），應與傳染性廢棄物區分開來，作為普通廢棄物單獨送醫療廢物集中處理中心統一處理。4， 血袋、裝血液的試管、離心管、吸頭等由科室洗滌人員用有效氯濃度0.3的愛爾施消毒液充分浸泡（60120分鐘），進行初步消毒處理。5， 進行初步消毒處理的血袋、試管和與受血液污染的棉球、紙片、一次性口罩、帽子等傳染性或可疑傳染性廢棄物一起放入黃色膠袋中，由廢物集中處理中心無害化處理中心封閉運輸至焚燒中心進行無害化焚燒處理。6， 每天實驗前，在清洗盆中加入半盆有效氯濃度0.3%的愛爾施消毒液，實驗中將玻片、離心管、吸管、吸頭等回收物品充分浸泡（60120分鐘），進行初步消毒處理。7， 收集一天的污染物品用流動水沖洗，然后進行高壓滅菌處理。登革熱NS1抗原檢測規程【方法】膠體金法【預期用途】本試劑采用免疫層析技術，定性檢測人血清、血漿或者全血中的登革熱NS1抗原。適用于登革病毒感染的早期輔助診斷和篩查。登革熱是由登革病毒（分4個血清型，DENV14）引起的，通過伊蚊傳播的急性傳染病，多見于熱帶和亞熱帶地區。臨床類型可分為登革熱、登革熱出血熱和登革休克綜合征三種，該病傳播迅速，主要臨床表現包括發熱、頭痛、全身肌肉關節疼痛、極度乏力、皮疹、淋巴結腫大、白細胞減少。初次感染登革熱病毒患者，一般臨床表現較輕，可表現為無癥狀隱性感染，或輕型、典型登革熱；再次感染異型登革病毒時，病情較為嚴重，臨床上出現登革出血熱和休克綜合征的概率增加，病死率高，是一種具有嚴重危害性的傳染病?！緳z驗原理】本試劑方法采用免疫層析法，應用雙抗體夾心法定性檢測登革熱NS1抗原。登革熱NS1抗原測試條的硝酸纖維素膜檢測區（T）上包被有抗登革熱病毒NS1蛋白單克隆抗體，質控區（C）上包被有抗鼠IgG多克隆抗體，當樣本中含有登革病毒NS1抗原且濃度高于最低檢出限時，標記有膠體金的抗登革病毒NS1蛋白單克隆抗體下血清、血漿或全血中的登革病毒NS1抗原結合形成反應復合物，在層析作用下復合物沒著硝酸纖維素膜向前移動，與硝酸纖維素膜上檢測區（T）預先包被的抗登革熱NS1抗原單克隆抗體結合形成復合物，并最終形成一條肉眼可見的紅色反應線，此時的結果為陽性。相反，當樣本中不含有登革病毒NS1抗原且濃度低于最低檢出限時，則檢測區（T）無紅色反應線出現，此時結果為陰性。無論樣本中是否有NSI抗原，在質控區（C）都會形成一條紅色反應線。 【主要組成成份】試劑盒由測試卡和吸管組成。測試條由硝酸纖維素膜、樣品墊、結合墊、吸水紙、PVC板等其他支持物組。硝酸纖維素膜包被有抗登革病毒NS1蛋白單克隆抗體和抗鼠IgG多克隆抗體，結合墊含 有膠體金標記的抗登革病毒NS1蛋白單克隆抗體?！緲颖疽蟆?， 血清、血槳、全血樣本均可用于測試。2， 全血樣本采集后盡可能立即使用，如不能立即檢測可蔣樣本放置于2-8C冷藏，全血樣本需在3天內完成檢測。3， 血清/血槳如不能及時測試應放置于2-8C冷藏，可保存兩周，如需長期保存應置-20C冷凍保存，測試前注意恢復至室溫。4， 注意高濃度的黃疸樣本、高度溶血樣本、或肉眼可見多絮狀沉積的乳糜血樣本，將對檢測結果的干擾，因此在使用樣本前注意樣本的外觀。【檢驗方法】檢測前先將冷藏的試劑和待測樣本恢復至室溫1， 取出測試卡平放于臺上，并做好標記2， 有吸管吸取樣本血清/血槳/全血樣本，垂直加入2-3滴（約60-80uL）于加樣孔中，3， 15-20分鐘觀察顯示結果，30分鐘后顯示結果無臨床意義。【結果報告】NS1抗原陽性：兩條紅色線，即在檢測區（T）及質控區（C）各出現一條紅色線。NS1抗原陽性：一條紅色線，即在質控區（C）出現一條紅色。無效：即在質控區（C）無紅色反應線出現。此時建義重測?！緳z驗方法局限性】1， 當測試樣本中登革病毒NS1抗原低于最低檢出限或在感染的某個階段不存在將會出現陰性