PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有53校對能力，擴增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長的可互補的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5端加入一段某種限制酶的識別序列。如果兩個引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR產(chǎn)物3端帶有一個凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70或72下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時（也有人報道處理12小時能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)會更徹底）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加T反應(yīng)。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP，效果會更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50100倍。一、PCR產(chǎn)物的TA克隆 1. TA克隆構(gòu)建原理：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。2.操作步驟 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。 10l體積反應(yīng)體系如下：取T載體1l (50ng)，加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物 。加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O 補足至10l 。 稍加離心，通常為14-16水浴連接8-14hr，或4過夜。 轉(zhuǎn)染，藍(lán)白斑篩選同前。二、注意事項1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過純化。3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來DNA污染。通過PCR的方法擴增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T-載體中，通過序列測定清楚DNA序列。由于在PCR過程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：（1）使用不同的Taq酶，在PCR擴增循環(huán)結(jié)束后，加上7210分鐘一個過程，Taq酶可以在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進(jìn)行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。pMD 18-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning)的專用載體。它是TaKaRa獨自研究開發(fā)，由pUC18載體改建而成的。在pUC18載體的多克隆位點處的Xba I 和Sal I識別位點之間插入了EcoR V 識別位點，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3末端添加一個“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。本制品是以最為常用的pUC18載體為基礎(chǔ)研制而成，所以它具有同pUC18載體完全相同的功能。此外，本制品中的高效連接液Ligation Solution I 可以在極短的時間內(nèi) (30分鐘-1小時)完成連接反應(yīng)，大大地方便了實驗操作。另外，本制品中還含有Control Insert (500 bp)，可用于Control反應(yīng)。用途：克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后的PCR產(chǎn)物用M13 Primers進(jìn)行DNA測序。互補和藍(lán)白篩選的原理：許多載體（包括pMD18-T）都具有一段大腸桿菌半乳糖苷酶的啟動子和編碼其N端氨基酸（肽鏈）的片斷基因。宿主具有編碼半乳糖苷酶的C端基因。當(dāng)二者產(chǎn)物組合在一起，就具有活性酶的產(chǎn)生，此現(xiàn)象稱為互補。由互補形成的具有功能活性的半乳糖苷酶,可以用X-gal顯色測定出來，它能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和藍(lán)色底物。當(dāng)外源DNA片斷插入到多克隆位點后，就會破壞肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的半乳糖苷酶相互補的活性肽鏈，而導(dǎo)致不能形成功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的，而沒有插入外源片斷的則是藍(lán)色的。實驗內(nèi)容：試劑 pMD 18-T Vector試劑盒，或自己PCR擴增回收純化的片段，T4DNA鏈接酶。IPTG，X-gal，LB培養(yǎng)基等。 200mg/ml的IPTG 過濾除菌 20mg/ml的Xgal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。操作步驟1. 在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液，全量為10 ml。 pMD 18-T Vector 1ml* control insert DNA 1ml* H20 3ml ligation solution I 5ull進(jìn)行實驗也可得到滿意的結(jié)果。實際操作時，可按實驗需要使用適量的T載體。m* 取0.5 2. 16反應(yīng)30分鐘 (過夜反應(yīng)也不影響連接效率)。l)中。m3. 全量 (10ml) 轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞 (100 4. 在含有40ml 20mg/ml的X-Gal、4ml 200mg/ml 的IPTG、50-100mg/ml Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍(lán)色菌落。5. 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長度大小。注意事項：1. Ligation Solution I 請于冰中融解。2. 在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.15pmol。3. 克隆時使用的Insert DNA片段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。4. 按照本實驗操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時的連接液不要超過20 ml。當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA用量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5. 連接反應(yīng)請在16下進(jìn)行，溫度升高 (26) 較難形成環(huán)狀DNA。6. 連接效率偏低時，可適當(dāng)延長連接時間至數(shù)小時。7. 感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH5a等。相關(guān)問題怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?1. 純化PCR產(chǎn)物。切膠回收的PCR片段最好2. 除去殘存的引物等雜質(zhì)。3. DNA片段的立體結(jié)構(gòu)、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，建議采用電轉(zhuǎn)化方法。PCR產(chǎn)物難以插入載體，為什么?1. 確認(rèn)PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3端是否附加了A。有些DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等擴增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克隆；PCR產(chǎn)物保存時間不要過長, 長時間保存的PCR產(chǎn)物會脫去末端的A堿基。2. PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時應(yīng)切膠回收純化DNA片段，回收時PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時間過長。3. 確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。4. 確認(rèn)Ligation Solution I 的連接效率是否降低，多次反復(fù)凍融會降低的Ligation Solution I 連接效率。5. 確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。6. 最好使用新配制的平板培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍(lán)色 (或淡藍(lán)色)，為什么?插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色。插入的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序時，可使用何種引物?本制品的載體來源于pUC18載體。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。一） 重組T質(zhì)粒的構(gòu)建一原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進(jìn)行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會自環(huán)。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5端就能與載體進(jìn)行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。連接反應(yīng)的溫度在37時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。二材料與方法1 材料外源DNA片斷2 儀器、用具移液槍、碎冰3 試劑pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP4 方法連接體系如下：16連接過夜。（二） 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定1 材料E.coli JM109菌株2 儀器、用具超凈工作臺、離心機、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑(1) CaCl2、LB平板（見附錄）；SOC培養(yǎng)基（見附錄）；SOB培養(yǎng)基(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無水乙醇的Buffer W2a(3) 1電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）有毒，小心；瓊脂糖；6加樣緩沖液(4) 酚；氯仿；異戊醇(5) ddH2O；10PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1) 取大腸桿菌JM109保存液50l，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取50l 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)3h至OD600=0.350.4，在無菌操作臺上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。(2) 4，5000rpm離心2min，去上清液。(3) 加入750l預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。(4) 4，5000rpm離心2min，棄上清液。(5) 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4保存?zhèn)溆谩?. 重組DNA的轉(zhuǎn)化(1) 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37預(yù)熱。(2) 于100l感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物，冰浴30min。(3) 將離心管轉(zhuǎn)入42水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2min。(4) 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300l，槍頭混勻，37、150rpm溫和搖振60min。(5) 將200l 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。注意事項： 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。 42熱處理時很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。 菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。3 重組質(zhì)粒的鑒定方案一 菌落PCR(1) 制備PCR混合液：(2) 用經(jīng)滅菌的10l槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。(4) 將步驟 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5) 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94變性1min，57退火1min，72 延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。(6) 取5l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。方案二 質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。(2) 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(3) 加入250l Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過5min。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。(4) 加入400l Buffer S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。*若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。(5) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。(6) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500l Buffer W1，5500rpm離心1min。(7) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700l已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700l已加無水乙醇的BufferW2洗