光合細菌的分離及初步鑒定【摘要】利用從西南大學北校區崇德湖的邊泥，富集分離得到兩種光合細菌，該菌株厭氧培養后呈現出紅色和綠色，革蘭氏染色呈陰性，通過形態學觀察及文獻資料查詢鑒定，初步鑒定為該菌株屬于紅假單胞菌屬和藍細菌。【關鍵詞】光合細菌 富集 分離 鑒定目的初步了解無氧操作，學會無菌操作和革蘭氏染色，掌握微生物實驗的基本技能，學習分離厭氧光合細菌及初步鑒定的方法。原理 光合細菌在有光照缺氧的環境中能進行光合作用，利用光能進行光合作用，利用光能同化二氧化碳，與綠色植物不同的是，它們的光合作用是不產氧的。光合細菌在自身的同化代謝過程中，又完成了產氫、固氮、分解有機物三個自然界物質循環中極為重要的化學過程。從厭氧且能得到光照的環境采樣，選用特定的富集和分離培養基，在厭氧并有光照的條件下進行培養，可分離到不同的光合細菌。材料與用具1、材料 崇德湖池塘邊透光處采取淤泥2、培養基及試劑 光合細菌液體富集培養基（以下配方為500ml所用）：CH3COONa 1.5 g；CH3CH2COONa 0.15 g；NaCl 0.5 g；(NH4)2SO4 0.15 g；MnSO4 12.5 mg；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaCl2 0.025 g；MgSO47H2O 0.1 g；FeSO47H2O 0.0025 g；酵母膏0.05 g；蛋白胨0.005 g；蒸餾水500 ml；pH 70光合細菌分離培養基（以下配方為500ml用）：CH3COONa 1.5g；CH3CH2COONa 0.15g；NaC1 0.25 g；NH4CI 0.5 g；MgSO47H2O 0.1g；K2HPO4 0.15g；KH2PO4 0.25 g；CaC12 0.025g；MnC124H2O 00015 g；FeSO4-7H2O 0.0025 g；酵母膏0.05g；蛋白胨0.005 g；谷氨酸0.0001 g；蒸餾水500 ml；瓊脂10 g；pH 7.27.4無菌水、無菌液體石蠟3、儀器及用具 光照培養箱、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、酒精燈、三角瓶、培養皿、試管、接種環、接種針、玻璃珠等。操作步驟（一）采集含菌樣品 從崇德湖湖邊某向陽處挖取淤泥。（二）培養基的制作 按照給出的配方配制培養基。（二）富集培養 取已經滅菌的200ml的光合細菌液體富集培養基，加入少許玻璃珠，同時接入泥樣10g，振蕩混勻，液面注入0.5cm 高滅菌液體石蠟，棉塞封口，造成厭氧環境。在溫度28、光照5000lx的生化培養箱中培養至培養液呈紅棕色，并且在瓶底淤泥表面有深紅色沉積物，使欲要分離的光合細菌成為優勢種。（三）多次富集 取適量經初步富集的菌液于試管液體富集培養基中，再次富集，重復兩次，使光合細菌進一步繁殖增多，成為絕對優勢種。 （四）光合細菌的分離 采用混菌法，在無菌培養皿上滴加1ml富集培養液，然后倒入一層厚厚的分離培養基 (融化后的培養基應冷卻至50后再覆蓋)，混勻后置于光照培養箱中繼續培養分離，直至得到純的單個菌落。采用雙層平板劃線法和雙層平板涂布發，即先在無菌培養皿上倒一層培養基，然后涂布和劃線菌液，再在其表面倒一層培養基，形成無氧環境。繼續培養至出現單菌落。待單菌落長出后，用穿刺法繼續純化目的菌，即用接種針在平板中挑取菌落為紅色和綠色的菌落，插入培養基底部，繼續培養后進行菌種鑒定。（五）光合細菌的初步鑒定 首先觀察分離平板上生長的菌落形態及特征，對不同菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態特征。五、實驗結果在富集培養基中，培養液剛開始逐漸成為紅褐色，持續一段時間后變為綠色，并能看到明顯的綠色藻狀物。分離培養基底部得到了兩種厭氧菌落，一種為紅色菌落，菌落表面微光滑、突起、濕潤、有光澤、不透明，菌落邊緣整齊，革蘭氏染色表明該菌株為革蘭氏陰性菌，光學顯微鏡下細菌形態為桿狀，長明顯大于寬。另一種菌落呈綠色，表面光滑濕潤，不透明，邊緣整齊，革蘭氏染色表明該菌株也為革蘭氏陰性菌，光學顯微鏡下細菌形態為球狀或鏈狀。實驗結果分析1、根據兩種厭氧菌的形態觀察和革蘭氏染色結果，查文獻初步判定紅色菌落為紅假單胞菌屬，綠色菌落為藍細菌，當然這只是初步的判斷，還得經過系列實驗才能得出具體結論，但由于實驗條件有限，不能進一步鑒定其生理生化特征。2、鑒于光合細菌能進行光合作用自養，因此所用培養基含碳源和氮源甚少，不利于大多數微生物生長，所以培養基中雜菌很少，只在分離平板表面上出現一種乳白色、濕潤、凸起、呈漿狀的雜菌。3、在配置培養基的過程中遇到了麻煩，首次所配的液體培養基滅菌后出現了很多沉淀，猜想可能由于PH值未嚴格控制，或藥品加入順序不對，或各藥品間會發生化學反應沉淀所造成，于是重配培養基，按要求調PH，查藥品加入順序，各藥品先各自溶解再混合，但結果仍有沉淀，前后共配三次也未改變。不知原因出現在何處。由于觀察發現光合細菌一開始是從瓶體的沉淀中長出（沉淀中出現紅褐色），猜想可能光合細菌需要附著于類似泥的物體上才能生長。4、在目的菌未進行富集之前，做了一次雙層平板劃線，即先在平板上倒一層富集培養基，然后用接種環劃線，最后再在上面倒一層培養基，結果底層無目的菌，表面長出了雜菌。富集后進行混菌法分離，即現在培養皿中加入菌液，然后倒入培養基，結果在培養基底部長出很多目的菌，說明所取材料中光合細菌含量不多，不經富集難以成為優勢種，或說明在該實驗中混菌法分離比雙層平板法有效。6、穿刺分離法的效果很好，采用此法得到了非常干凈的紅色目的菌落，穿刺路徑呈紅色，為光合細菌，下面分布很多小菌落，無任何雜菌長出。5、整個操作過程中都要在無菌條件下進行，要么在酒精燈旁操作，要么在超凈工作臺中進行，且每次接菌前都應將灼燒接種環或接種針，避免雜菌污染，這是實驗成功的關鍵之一。【參考文獻】【1】 董艷珍，陳碧華，肖文淵. 一株光合細菌分離與初步鑒定【J】. 西昌學院學報自然科學版，2010 年9 月第24 卷第3 期.【2】 席寅峰, 張孟婧, 黃小帥, 郝燕佳. 1株光合細菌的分離鑒定及其脫氮能力研究【J】. 安徽農業科學, 2010, 38( 27) : 14847- 14849, 14875.【