實驗八 培養基的制備與滅菌一、目的要求1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2. 掌握培養基的配置方法。3. 掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理 正確掌握培養基的配制方法是從事微生物學實驗工作的重要基礎。由于微生物種類及代謝類型的多樣性因而用于培養微生物的培養基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養基的配制程序卻大致相同例如器皿的準備，培養基的配制與分裝，棉塞的制作，培養基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養基的無菌檢查等基本環節大致相同。三、實驗材料1. 藥品：待配各種培養基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養皿、玻璃漏斗等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿的包裝（1） 培養皿的包扎：培養皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養皿包成一包，或者將幾套培養皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝后的培養皿須經滅菌之后才能使用。圖8-1 移液管的包扎（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進入管內，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約11.5cm。塞棉花時可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌。（二）液體及固體培養基的配制過程1液體培養基配制1) 稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養基所需的各種藥品，先按培養基配方計算出各成分的用量然后進行準確稱量。2) 溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動，加熱溶解。3) 定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養基中。4) 調pH：一般用pH試紙測定培養基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養基偏酸或偏堿時，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進行調節。調節pH時，應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達到所需pH為止。5) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養基。一般無特殊要求時，此步可省去。2固體培養基的配制 配制固體培養基時，應將已配好的液體培養基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.52)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發而失去水分。（三）培養基的分裝 根據不同需要，可將已配好培養基分裝入試管或三角瓶內，分裝時注意不要使培養基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，并將脫脂棉棄去。1試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養基直接流入試管內。裝入試管培養基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15150 mm時，液體培養基可分裝至試管高度14左有為宜；如分裝固體或半固體培養基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養基的分裝量為管高15(約34mI)，半固體培養基分裝量為管高的13為宜。2三角瓶的分裝圖8-2培養基的分裝 用于振蕩培養微生物時，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養基；若用于制作平板培養基用時，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養基，然后再加入3g瓊脂粉(按2計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 為了培養好氣性微生物，需提供優良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1試管棉塞的制作制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的23在試管內，13在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號筆注明培養基名稱及配制日期，滅菌待用。圖8-3 棉塞的制作圖8-4 正確與不正確的棉塞1.金屬塞 2正確 3、4不正確2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養基的滅菌培養基經分裝包扎后，應立即按配制方法規定的滅菌條件進行進行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當斜度，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度l2為宜。如制作半團體或固體深層培養基時，滅菌后則應垂直放置至凝固。2平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應在火旁進行，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1015mL培養基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉平皿，使培養基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養基的滅菌檢查滅菌后的培養基，一般需進行無菌檢查。最好取出12管(瓶)，置于37溫箱中培養12天，確定無菌后方可使用。（八）無菌水的制備在每個250mL的三角瓶內裝100mL的蒸餾水并塞上棉塞或硅膠塞。在每支試管內裝4.5mL蒸餾水，塞上棉塞或硅膠塞。再在棉塞上包上一張牛皮紙，高壓蒸汽滅菌。0.1MPa滅菌2030min。五、實驗內容1. 根據要求清洗各種玻璃器皿，并進行包扎。2. 根據要求配制各種培養基。3. 用電熱鼓風干燥箱對玻璃器皿進行干熱滅菌。4. 用高壓蒸汽滅菌鍋對所配各培養基滅菌。六、實驗報告1. 簡述移液管和培養皿的包扎注意事項。2. 簡述配制培養基的基本步驟及注意事項。3. 為什么微生物實驗室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用報紙包起來，經高壓蒸汽滅菌后才能使用?4. 為什么微生物實驗室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞（硅膠塞）才能使用？5. 配制培養基時為什么要調節pH？6. 高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時間短？附錄 滅菌技術一、目的要求了解消毒和滅菌的原理，并掌握各種滅菌方法的操作步驟。二、實驗材料1. 儀器或其他用具：上述包扎的培養皿、試管、移液管等，電熱鼓風干燥箱，高壓蒸汽滅菌鍋，微孔濾膜過濾器，0.22m濾膜，注射器，鑷子，玻璃涂棒。2. 培養基：上述配制的培養基及生理鹽水三、基本原理在微生物實驗中，需要進行純培養，不能有任何雜菌污染，因此必須對所用器材、培養基和工作場所進行滅菌和消毒。滅菌是指殺死一定環境中的所有微生物，包括微生物的營養體、芽孢和孢子。實驗室常用的滅菌方法包括直接灼燒、恒溫干燥箱滅菌、高壓蒸汽滅菌、間歇滅菌、煮沸滅菌等方法。這些方法的基本原理是通過加熱使微生物體內蛋白質凝固變性，從而達到滅菌的目的。四、操作步驟（一）干熱滅菌法干熱滅菌是在電熱干燥箱內利用高溫干燥空氣（160170）進行滅菌，它是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌目的。此法適用于玻璃器皿如移液管、試管和培養皿的滅菌。培養基、橡膠制品、塑料制品不能采用干熱滅菌。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160170），時間長（12h）。但干熱滅菌溫度不能超過180，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的是電熱干燥箱（干燥箱）。具體操作步驟如下：1. 裝入待滅菌物品：將包好的待滅菌物品放入電熱干燥箱內，關好箱門。堆積時要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱干燥箱內壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。2. 升溫：接通電源，打開開關，適當打開電熱干燥箱頂部的排氣孔，旋動恒溫調節器，使溫度逐步上升。當溫度升至100時，關閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱干燥箱內停止加溫，此時如果還未達到所需的160170，則需要轉動溫度調節器使紅燈亮，如此反復調節，直至達到所需的溫度。3. 恒溫：當溫度升到160170時，借助恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。干熱滅菌過程中，嚴防恒溫調節的自動控制失靈而造成安全事故。4. 降溫：切斷電源，自然降溫。5. 開箱取物：待電熱干燥箱內溫度降到60以下后，才能打開箱門，取出滅菌物品。同時，應將溫度調節旋鈕調到零點，并打開排氣孔。電熱干燥箱內溫度未降到60以前，切勿自行打開箱門，以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，在一定的壓力下保持1530分鐘進行滅菌。此法適用于培養基、無菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，獲得高于100的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌。有三點原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質容易凝固變性，蛋白質隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比干燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力。實驗室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結構和工作原理是相同的。本實驗介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說明書。具體操作步驟如下：1. 加水：首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發生燒干引起炸裂事故。2. 裝料：放回內層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認為當排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關閉排氣閥，繼續加熱，鍋內壓力開始上升。6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時，控制電源，開始計時并維持壓力至所需的時間。如本實驗中采用0.1Mpa，121.5，20分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內的冷空氣必須完全排盡后，才能關閉排氣閥，維持所需壓力。7. 降壓：達到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基或試劑由于內外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。8. 無菌檢查：將已滅菌的培養基放入37恒溫培養箱培養24h，檢查無雜菌生長后，即可使用。（三）過濾除菌有些物質，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等采用加熱滅菌法時，容易受熱分解而被破壞，因而要采用過濾除菌法。過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法，該方法最大的優點是不破壞溶液中各種物質的化學成分。過濾除菌法除實驗室用于溶液、試劑的除菌外，在微生物工作中使用的凈化工作臺也是根據過濾除菌的原理設計的，可根據不同的需要來選用不同的濾器和濾板材料。應用最廣泛的過濾器種類有：1. 微孔濾膜過濾器：是一種新型過濾器，它由上下二個分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當溶液從針筒注入濾器時，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質通過濾膜，從而達到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規格（如0.1m、0.22m、0.3m、0.45m等），實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22m。根據待除菌溶液量的多