概述細胞周期調控細胞周期相關的癌基因和抑癌基因細胞增殖異常與疾病細胞增殖活性的檢測方法 細胞增殖異常與疾病 1 概述 細胞是機體內最基本的結構和功能單位細胞的生長和增殖形成了生物體的生長繁衍細胞的異常增殖可能導致機體的疾病 2 細胞增殖 細胞分裂和生長的過程細胞通過分裂進行增殖 把遺傳信息傳給子代 保持物種的延續和數量增多細胞增殖 分化不良 組織器官發育不全細胞增殖 分化不全 低分化 去分化或逆分化 腫瘤發生 3 細胞增殖過程 4 細胞周期 Cellcycle Cellcycleisdefinedasaperiodfromtheendofonedivisiontothebeginningofnextdivisionofaproliferativecell 細胞周期分期G1 S G2 MG1期 DNA合成前期 RNA和蛋白質合成 InterphaseS期 DNA合成期 DNA復制 組蛋白和非組蛋白合成 G2期 分裂前期 微絲 微管蛋白 成熟因子等合成 MphaseM期 分裂期 5 6 三類細胞 持續分裂細胞 continuouslydividingcell 腫瘤細胞 表皮 呼吸 消化 生殖道粘膜上皮 淋巴造血細胞 間皮細胞不分裂細胞 nondividingcell 神經元 骨骼肌 心肌細胞靜止細胞 quiescentcell G0期 腺體或腺樣器官的實質細胞 間葉細胞 肝細胞等 7 細胞周期的調控 Regulationofthecellcycle Regulationofthecellcycle Regulationofthecellcyclebyintracellularsignals Regulationofthecellcyclebyextracellularsignals 8 細胞周期素 Cyclin 細胞周期素依賴性激酶 Cyclin dependentkinase CDK 細胞周期調控機制的核心細胞周期素依賴性激酶抑制劑 CDKinhibitor CKI 1 細胞周期自身調控機制 Keyspot Cyclin CDKs CKI Checkpointofcellcycle 9 Cyclin周期變化圖 CyclinCyclinA CyclinB CyclinC CyclinE CyclinD1 D2 D3 CyclinH 10 Cyclins主要通過泛素化降解泛素 由76個氨基酸組成 廣泛存在于真核細胞 共價結合泛素的蛋白質被蛋白酶體識別和降解 11 Cyclins的作用 激活CDK 決定CDK何時將何種底物磷酸化而推動細胞周期進行 12 CDK 一組絲氨酸 蘇氨酸蛋白激酶CDK1 CDK2 CDK3 CDK4 CDK5 CDK6 CDK7CDK與Cyclin結合形成復合物 磷酸化而激活控制G1期 CDK4 CDK6 CDK2控制S和G2期 CDK2控制M期 CDK1 13 Cdk1 14 CDK活化與調控細胞周期 CDK2與cyclinE結合 CDK4 CDK6與cyclinD1 D2 D3結合Rb磷酸化游離E2F釋放 啟動G1期 CDK2與cyclinE和A結合后識別染色體ARS促進S期 CDK1與cyclinA結合啟動G2期 CDK1與cyclinB1結合 MPF Mitosispromotingfactor 啟動M期 PRb 15 細胞在生長因子的刺激下 G1期cyclinD表達 并與CDK4 CDK6結合 使下游的蛋白質如Rb磷酸化 磷酸化的Rb釋放出轉錄因子E2F 促進許多基因的轉錄 如編碼cyclinE A和CDK2的基因 16 CDKs活化部位與抑制部位 活化部位 CDK1Thr161 磷酸化 CAK對CDK1活化部位磷酸化 抑制部位 CDK1Thr14 Tyr15 去磷酸化 依賴于P80cdc25酶作用 17 18 19 CKI可特異性抑制CDK的活性 Ink4 inhibitorofcdk4 P16INK4a P15INK4b P18INK4c和P19INK4d特異性抑制CDK4 CyclinD1 CDK6 CyclinD1復合物 Cip Kip cyclininhibitionprotein kinaseinhibitionprotein p21Cipl P27Kip1和P57Kip1抑制多數CDK活性 20 抑制途徑 CKIs通過直接結合CDK cyclin復合物的磷酸化活化部位 抑制CDK的激酶活性 P16INK4a通過結合CDK4單體 阻斷它與cyclins的結合 21 細胞周期校驗點 Checkpoint 細胞內存在監控機制 校驗點G1 S校驗點DNA損傷 外環境適宜 體積足夠 CheckpointS期校驗點DNA復制完成 G2 M校驗點DNA損傷 體積足夠 紡錘體組裝校驗點著絲點正確連接紡錘體 校驗點系統通過促進抑制通路或抑制激活通路使細胞周期停止 校驗點丟失可導致基因組的不穩定 正常細胞轉化為腫瘤細胞 22 Checkmechanism G1 S期 P53DNA損傷 P53水平上調 磷酸化P53上調p21Cipl基因轉錄 P21Cipl能與多種CDK cyclin復合物結合 抑制CDKs的激活 阻滯G1 S的過渡 為DNA修復提供足夠時間 23 G2期 Cdc25 P80 一個蛋白激酶結合在損傷的DNA上 激活Chk1 checkpointkinase Chk1使Cdc25失活 使其不能活化cdc2 導致細胞周期中斷 MPF mitosispromotingfactor CDC25為一種磷酸酶Cdc2基因的產物為CDK1 Cdc2為啟動有絲分裂所必須 24 2影響細胞周期的細胞外因素G1期存在一個 限定點 restrictionpoint 決定細胞是否進入周期 這 限定點 主要受細胞外信號的調控 刺激信號 生長因子 EGF IGF IL 生長因子通過ras途徑 激活MAPK MAPK進入細胞核內 促進細胞增殖相關基因的表達 如通過一種未知的途徑激活c myc myc作為轉錄因子促進cyclinD E2F等G1 S有關的許多基因表達 細胞進入G1期 25 TGF 可刺激纖維母細胞增殖可下調cyclinD1和CDK4的表達和促進P21wafl P27kipl和P15ink4b等產生 使其他類型細胞阻滯在G1期 細胞生長條件不具備P16INK4a和P15INK4b增加 并抑制CyclinD CDK4 6復合物的功能 細胞阻滯G1期 26 3細胞周期相關的癌基因和抑癌基因癌基因sis癌基因編碼PDGF 可刺激具有該受體的腫瘤細胞增殖fms癌基因編碼CSF 1受體中一條肽鏈CSF 1刺激骨髓細胞增殖 27 ras癌基因編碼細胞膜上單鏈鳥苷酸結合蛋白 小G蛋白當信號從細胞膜傳到ras蛋白 raf蛋白 具有絲氨酸 蘇氨酸蛋白激酶活性 活化 MAPK Mitogen activatedproteinkinase 磷酸化 促進細胞周期N Ras GTP激活下游信號分子Ras蛋白具GTPase活性 能水解結合的GTP 滅活Ras蛋白活性ras點突變 失去GTPase活性 使Ras蛋白活性長期保持 28 myc癌基因編碼一種核內DNA結合蛋白 起轉錄因子作用 促進一些細胞分裂所需基因的轉錄c jun和c fos癌基因編碼轉錄因子AP 1的亞基 AP 1能調節許多基因轉錄 參與細胞增殖調節N 只在有絲分裂元刺激后短暫表達 29 抑癌基因抑癌基因表達產物CDK抑制物 P15 P16 P21 P27等抑制細胞周期的蛋白 P53 Rb抑癌基因突變后 不表達或表達無功能的產物 失去對細胞增殖的抑制作用 使細胞出現過度增殖 30 細胞周期異常與疾病細胞過度增殖或不足的本質是細胞周期調控異常 細胞周期的驅動失控 Cyclin CDK和CKI表達異常 監控 檢查 機制受損 Theimpairmentofcheckpointsystem 31 細胞增殖異常與相關疾病增殖異常增殖分化異常再生障礙性貧血惡性腫瘤前列腺肥大畸胎瘤動脈粥樣硬化先天畸形家族性紅細胞增多癥X 連鎖 球蛋白缺乏癥高IgM血癥 32 惡性腫瘤細胞增殖異常機制 腫瘤細胞最顯著的特點生長失控和幼稚化 不分化 細胞不進入G0期 持續處于細胞周期 33 1 細胞周期驅動機制失控Cyclins過表達 Overexpressionofcyclins 多種腫瘤cyclinD1 cyclinE過表達 基因擴增CyclinD1 Bcl 1 過表達的主要原因乳腺癌 胃癌 食管癌存在CyclinD1基因擴增過度 34 染色體倒位 Chromosomeinversion CyclinD1基因倒位于甲狀旁腺啟動子控制下CyclinD1蛋白合成 甲狀旁腺腺癌 染色體易位 Chromosometranslocation Bcl 1t 11 14 q13 q32 易位CyclinD1受Ig重鏈基因增強子影響CyclinD1表達 35 基因突變CyclinD1T286突變CyclinD1泛素化受阻CyclinD1 CyclinD過表達致腫瘤機制 CyclinD過表達 生長因子CDKs瀑布效應 細胞增殖過度易發生細胞癌變 36 37 CKI表達不足和突變腫瘤細胞中常出現CKI表達不足或突變 p16InK4基因失活突變或缺失 染色體易位 p16InK4高度甲基化 38 39 2 細胞周期監控機制受損 Impairmentofcheckpointsystem 主要原因 G1 S G2 M檢查點異常失察結果 探測DNA損傷功能降低 如發現不了DNA損傷 會導致基因缺失 易位 染色體重排等 40 41 DNA病毒 SV40 HPV 腺病毒等P53蛋白失活 42 43 檢測細胞增殖活性的常用方法 核分裂計數高倍視野法 highpowerfields HPF 400倍放大 10 視野單位面積核分裂像更具可比性核分裂指數 mitoticindex MI 顯微鏡目鏡放置網格測微尺 計算機軟件輔助分析 44 45 46 免疫組織化學法Ki67抗體 所測抗原只表達于G1 G2 M和S期細胞 不表達于G0期細胞 47 PCNA抗體 proliferatingcellneuclearantigen 36KD高度保守分子 是DNA多聚酶 的輔助因子 不表達于G0期細胞周期素A B C D和E 周期素依賴性激酶CDK檢測細胞增殖的輔助標記 48 DNA含量測定 胸腺嘧啶標記 thymidinelabelling 溴脫氧鳥核甙摻入 bromodeoxyuridineincorporation 放射性核素3H或32P標記胸腺嘧啶或鳥核苷加入培養的細胞液一段時間后 檢測細胞的3H或32P的含量 從而了解細胞的DNA合成情況 49 流式細胞術 flowcytometry 碘化丙錠 PI 可使細胞DNA和RNA同時染色 細胞經PI染色后 FCM分析可獲得DNA直方圖 該直方圖可顯示細胞