編號 內蒙古大學生命科學學院生物系基因工程實驗室本科基因工程實驗論文開題報告論文題目：堿性磷酸酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達學生姓名： 年 級： 專 業： 指導教師： 二一三年八月十二日學生姓名論文題目開題時間項目來源本科生基因工程大實驗課一、立論依據項目的研究意義，國內外研究現狀及發展趨勢分析，主要參考文獻及出處：堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP, ALKP) (EC 3.1.3.1)屬磷酸單脂酶族，底物專一性較低，廣泛應用于表位連鎖圖譜，探針標記測序和免疫組織化學等領域。分子生物學中，ALP分解寡聚核甘酸的末端單酯化磷酸，是常用的遺傳工程酶。1產堿性磷酸酶的生物有很多，從細菌到高等哺乳動物均有分布。人血液中的堿性磷酸酶含量是重要的指標之一，其檢驗結果及異位表達對癌癥等許多疾病有著指導意義。2，3目前商業堿性磷酸酶主要來源于動物（小牛腸堿性磷酸酶）、植物（麥芽）和微生物（細菌堿性磷酸酶）(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)。在革蘭氏陰性細菌中，BAP表達于細胞膜外的周質空間。相比表達于胞內使其更機動和高效。BAP的功能已基本揭示，簡單來說BAP是細菌產生攝取應用的自由磷酸基團的一種方式，4被大量的實驗證據所支持。然而，缺乏BAP的E. coli 仍然能夠存活，所以應該還存在相關的替代機制。5目前，對BAP的研究熱點主要由于其海洋有機磷利用的酶特性等集中于海洋微生物領域。海洋細菌堿性磷酸酶的亞細胞研究揭示了其相關合成基因及表達特性對于海洋有機磷循環及海洋生物多樣性的貢獻。研究人員證實了3733種BAP序列(包括 PhoA, PhoD, and PhoX )，包含胞質分泌及胞外位于不同支載結構。大量的實驗數據支持了細菌于海洋表面部分光耦合的磷攝取機制。6鑒于磷對于海洋維持初級產能的重要性，并且考慮到其最主要的來源之一有機磷分解，海洋生物BAP的分子生物學研究也是熱點之一。相關的酶動力學研究表明，與藻青菌相關的堿性磷酸酶來說，鈣對于維持其基本活性是必須的。有假說稱其與浮游植物可能是鋅-P共限制的，一些海洋細菌的BAP可選形式即PhoX是于此相關的。7此外，分子研究表明，移除BAP的3磷酸集團能夠促進碰撞誘導解離時RNase消化產物分析對的寡核苷酸覆蓋。8另外，ALP于哺乳動物的分子酶動力學研究與海洋BAP也取得了相應的結果。外生堿性磷酸酶處理補充了結腸炎的內生酶保護機制以及抑制了細菌對大鼠的轉座。為AP抵制細菌轉座作用補充了證據。9本研究對BAP進行克隆及表達研究，能夠為進一步的科研研究提供原料，具有一定的經濟價值，并無較大科研價值。參考文獻： 1.Tams, L., Huttov, J., Mistrk, I., Kogan, G. (2002) Eect of Carboxymethyl Chitin-Glucan on the Activity of Some Hydrolytic Enzymes in Maize Plants. Chem. Pap. 56 (5): 326-329.2.Stolbach, L. L., Krant, M. J., Fishman, W. H. (1969) Ectopic Production of an Alkaline Phosphatase Isoenzyme in Patients with Cancer. N Engl J Med. 281:757-762.3.Diener, H.C., Bogousslavsky, J., Brass, L. M. (2004) Aspirin and clopidogrel com- pared with clopidogrel alone after recent ischaemic stroke or transient ischaemic attack in high-risk patients (MATCH): ran- domised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 364:331-733.4.Horiuchi, T., Horiuchi, S., Mizuno, D. (1959). A Possible Negative Feedback Phenomenon controlling Formation of Alkaline Phosphomonoesterase in Escherichia coli. Nature. 183:1529-1530.5.Wanner, B. L., Patrick L. (1980). Mutants Affected in Alkaline Phosphatase Expression: Evidence for Multiple Positive Regulators of the Phosphate Regulon in Escherzchza Coli. Genetics 96 (2): 353-366.6.Luo, H.W., Bennera, R., Long, R.A., and Hu, J.J. (2009) Subcellular localization of marine bacterial alkaline phosphatases. Proc Natl Acad Sci 106: 21219-21223.7.Kathuria, S., Martiny, A. C. (2012) Prevalence of a calcium-based alkaline phosphatase associated with the marine cyanobacterium Prochlorococcus and other ocean bacteria. Env Microbiol. 13:4-83.8. Krivos, K. L., Addepalli, B., Limbach, P. A. (2011) Removal of 3-phosphate group by bacterial alkaline phosphatase improves oligonucleotide sequence coverage of RNase digestion products analyzed by collision-induced dissociation mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 25:3609-3616.9. Martinez-Moya, P., Ortega-Gonzalez, M., Gonzalez, R., Anzola, A., Ocon, B., Hernandez-Chirlaque, C., et al. (2012). Exogenous alkaline phosphatase treatment complements endogenous enzyme protection in colonic inflammation and reduces bacterial translocation in rats. Pharmacol Res. 66:144-153.二、實驗方案1 實驗內容和實驗目標，擬解決的關鍵問題： 實驗內容：包括質粒提取、PCR擴增、轉化大腸桿菌、凝膠回收、感受態制備、IPTG誘導、SDS-PAGE鑒定等。 關鍵問題：IPTG誘導量及誘導時間的優化； 超聲破碎的方案優化。2. 實驗思路、方法、技術路線、實驗方案及可行性分析： 實驗思路：依據技術路線完成試驗。 實驗方法： 實驗室常用技術。 技術路線： 實驗方案：詳細方案已于講義給出。 可行性分析：實驗室相關技術成熟，實驗人員熟悉相關的實驗內容以及方法，實驗的可行性很高。3. 實驗進度（10天之內）： 前一夜搖菌。 第一天： 1 提取pET-His, pCDNA-BAP； 2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定pET-His, pCDNA-BAP； 3 以pCDNA-BAP為模版擴增目的基因片段。 4 酶切pET-His。 第二天 1 凝膠回收酶切片段； 2 PCR產物連接； 3 轉化E. coli； 4 搖菌。 第三天 1 IPTG誘導表達； 2 提BAP蛋白； 3 SDS-PAGE鑒定。4. 預期實驗成果： 1 獲得目的產物BAP； 2 成功構建BAP表達載體； 3 撰寫實驗報告。5. 曾參與與本實驗有關的學習和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學過基因工程課程、讀過相關的文獻、寫過有關的綜述、參加過相關的實驗設計或研究課題、獲得學術獎勵情況等）1學習基因工程，期末測評93；讀過分子克隆，GENE IX等文獻； 2于 生物技術通報(C) 發表綜述 蛋白質組學在研究細胞信號轉導中的應用，第一作者；于 J. Anim. Sci. (SCI) 接收論文 Molecular Characterization and Expression Analysis of ELOVL1 Gene in the Cashmere Goat (Capra hircus) ，第一作者；于 Dna Cell Bio.l接收改稿 Connecting mTORC1 signaling to SREBP1 activation thorough lipids synthesis in mammals，第三作者；3按時間排序：參與國家創新基金 絨山羊成纖維細胞中超表達轉錄因子Krox20對IGFBP5啟動子活性的影響 完成3種細胞組成型表達檢測；參與內蒙古自然科學基金項目No. 2011MS0521完成免疫組化工作；主