中i ij 人學碩士學位論文 摘要 碳納米管對植物細胞影響的細胞生物學分析 專業 植物學 碩士生 申聰香 指導教師 姚楠教授 碳納米管 c a r b o nn a n o t u b e s c n t s 是一種具有獨特結構和物理性質的新型 納米材料 近年來隨著研究的不斷深入 其廣闊的應用前景特別是在生物醫藥上的 潛在優勢開始展現 同時該類材料對生態環境 人類健康的影響目前也逐漸引起科 學家的注意 在農業生產中 納米技術在增強植物吸收養分能力 增加農藥和除草 劑的功效 降低農藥和除草劑的劑量等方面有著可觀的應用前景 然而當前納米材 料對植物影響的研究幾乎還是空白 探討納米材料對植物及其環境的影響 正確評 估碳納米管的生物學效應 是具有重要意義的前瞻性研究 本文利用擬南芥和水稻 原生質體系統 結合光鏡 電子顯微鏡觀察 以及e m t u n e l r t p c r 等檢測手 段 從多方面探討了單壁碳納米管 s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s 對植 物細胞的影響 我們用s w c n t s 處理原生質體和植物組織后 檢測了細胞活性 形態變化 d n a 損傷 活性氧 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s 產生和相關基因表達 結果表 明 s w c n t s 在一定程度上能影響原生質體的活性 并且這種影響呈現濃度依賴性 關系 但和處理時間關系不大 此外 單壁碳納米管還能引起原生質體聚集 植株 葉肉細胞染色質凝縮 t u n e l 的陽性反應和h 2 0 2 積累 我們發現s w c n t s 處理 后葉肉細胞細胞壁和細胞膜上有氯化鈰的沉積和類似內吞的膜結構 提出了碳納米 管穿過細胞膜的可能途徑 本研究說明 盡管碳納米管具有許多特異的性質 但是 在農業生產上應用時要對其毒性作出充分的評價 關鍵詞 擬南芥 納米材料 原生質體 水稻 單壁碳納米管 中山大學碩士學位論文 c e l lb i o l o g ya n a l y s i so fe f f e c t so fc a r b o nn a n o t u b e so n p l a n tc e l l s a b s t r a c t m a j o r b o t a n y n a m e c o n g x i a n gs h e n s u p e r v i s o r p r o f n a ny a o a sn e wm e m b e r so fn a n o m a t e r i a lf a m i l y c a r b o nn a n o t u b e s c n t s h a v em a n y u n i q u es t r u c t u r a la n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s t h e i rp o t e n t i a la p p l i c a t i o n se s p e c i a l l yi n b i o m e d i c i n eh a v ei n c r e a s i n gi nr e c e n ty e a r s t h ee f f e c t so fc n t so nt h ee c o l o g i c a l e n v k o n m e n ta n dh u m a nh e a i t ha r ea l s og r a d u a l l yc a u s e dt h es c i e n t i s t sa t t e n t i o n i nt h e a g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n n a n o t e c h n o l o g yh a sac o n s i d e r a b l ea p p l i c a t i o np r o s p e c ti n e n h a n c i n gt h ea b i l i t yo fp l a n t st oa b s o r bn u t r i e n t s i n c r e a s i n gt h ee f f i c i e n c yo fp e s t i c i d e s a n dh e r b i c i d e s a l l o w i n gl o w e rd o s e st ob eu s e de t c h o w e v e r t h et o x i c o l o g i c a li m p a c t o fn a n o p a r t i c l e sh a s r a r e l yb e e ns t u d i e di np l a n t s i ti sa ni m p o r t a n tp r o s p e c t i v er e s e a r c h t os t u d yt h ee f f e c t so fn a n o m a t e r i a lo np l a n t sa n de n v i r o n m e n t a n de v a l u a t ec a r b o n n a n o t u b e sb i o c o m p a t i b i l i t ye x a c t l y u s i n gap r o t o p l a s ts y s t e mf r o ma r a b i d o p s i so rr i c e l e a v e s c o m b i n e dw i t hl i g h tm i c r o s c o p e e l e c t r o nm i c r o s c o p e e m t u n e la n dr t p c r w et e s t e df o rt h ee f f e c t so fs i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s o np l a n tc e l l s f r o mm a n ya s p e c t s w ee x p o s e dl e a fp r o t o p l a s tc e l l sa n dp l a n tt i s s u e st os w c n t sa n de x a m i n e dc e l l v i a b i l i t y c e l lm o r p h o l o g y d n ad a m a g e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s g e n e r a t i o na n d m o l e c u l a rs i g n a l i n ga l t e r a t i o n s w ef o u n dt h a tt h ee f f e c to fs w c n t so nt h es u r v i v a lo f c e u sw a sd o s ed e p e n d e n t b u tn o tt i m ed e p e n d e n t w ea l s of o u n ds w c n t sc a nc a u s e a d v e r s ec e l l u l a rr e s p o n s e si n c l u d i n gc e l la g g r e g a t i o n c h r o m a t i nc o n d e n s a t i o nw i t ha 中山大學碩士學位論文 t u n e l p o s i t i v er e a c t i o n p l a s m am e m b r a n ed e p o s i t i o n a n dh 2 0 2a c c u m u l a t i o n m o r e o v e r w ef o u n de n d o c y t o s i s q i k es t r u c t u r ew i t hc e r i u mc h l o r i d ed e p o s i t sa r e r s w c n t t r e a t m e n t s u g g e s t i n gap o s s i b l ep a t h w a yf o rn a n o p a r t i c l e st ot r a v e r s et h ec e l l m e m b r a n e c o n s e q u e n t l y a r h o u g hn a n o m a t e r i a l sh a v eg r e a ta d v a n t a g e si nm a n y r e s p e c t s t h e i rc y t o t o x i c i t yn e e d st ob ee v a l u a t e dw h e nt h e ya r eu s e di nt h ea g r i c u l t u r a l p r o d u c t i o n k e y w o r d s a r a b i d o p s i s n a n o p a r t i c l e s p r o t o p l a s t s r i c e s i n g l e w a l l e d c a r b o n n a n o t u b e s s w c n t s 中山大學碩十學位論文 簡稱 a c c m h 2 d c f d a d a p i e m f d a g a m o p s p c d p f a r o s t u n e l 縮略詞 英文全稱 a c t i v a t e dc a r b o n 5 a n d 6 c h l o r o m e t h y l 2 7 一 d i c h l o r o d i h y d r o f l u o r e s c e i n d i a c e t a t e a c e t y le s t e r 4 6 d i a m i d i n e 2 p h e n y l i n d o l e d i h y d r o c h l o r i d e e l e c t r o nm i c r o s c o p e f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e g l u t a r a l d e h y d e 3 n m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i ca c i d p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p a r a f o r m a l d e h y d e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a g em e d i a t e dd u t pn i c k e n d l a b e l l i n g 中文全稱 活性碳 氯甲基二氯二氫熒光 素二乙酯 4 6 一聯脒 2 一苯基吲哚 二鹽酸鹽 電子顯微鏡 熒光素二乙酸酯 戊二醛 3 n 一嗎啡啉 2 一羥基 丙磺酸 程序性細胞死亡 多聚甲醛 活性氧 單壁碳納米管 脫氧核苷酸末端轉移 酶介導的d u t p 缺口末 端標記 中山大學碩士學位論文 論文原創性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學位論文 是本人在導師的指導下 獨立 進行研究工作所取得的成果 除文中已經注明引用的內容外 本論文不 包含任何其他個人或集體已經發表或撰寫過的作品成果 對本文的研究 作出重要貢獻的個人和集體 均已在文中以明確方式標明 本人完全意 識到本聲明的法律結果由本人承擔 學位論文作者簽名 可磋商 日期 刀年莎月7 曰 學位論文使用授權聲明 本人完全了解中山大學有關保留 使用學位論文的規定 即 學校 有權保留學位論文并向國家主管部門或其指定機構送交論文的電子版 和紙質版 有權將學位論文用于非贏利目的的少量復制并允許論文進入 學校圖書館 院系資料室被查閱 有權將學位論文的內容編入有關數據 庫進行檢索 可以采用復印 縮印或其他方法保存學位論文 保密論文保密期滿后 適用本聲明 學位論文作者簽名 嗍 日期 沙f 口年6 月j 7 r 日 導師簽名 m 相 日期 知1 年石月7 日 中i i j 人學碩士學位論文 1 1 納米材料概述 第一章前言 納米材料是近年來科學上的一項重大發現 己經成為當今許多學科研究的熱 點 納米材料是一種介于分子和宏觀常規材料之間的介觀態材料 是指在三維空間 中至少有一維處于納米尺度范圍 1 1 0 0n m 或由它們作為基本單元構成的材料1 1 1 包括納米顆粒 n a n o p a r t i c l e s 納米纖維 n a n o f i b e r s 納米管 n a n o t u b e s 復合材 料 c o m p o s i t em a t e r i a l s 和表面具有納米結構的物質 n a n o s t r u c t u r es u r f a c e s 1 2 1 納米 材料的尺寸很小 結構特殊 由于諸如表面效應 小尺寸效應 量子尺寸效應和宏 觀量子隧道效應等因素 納米材料具有許多獨特的性質 納米材料最主要的特點是尺寸小 處于單個原子或分子與宏觀粒子交界的過渡 區域 3 1 當直徑小于1 0 0n m 時 納米顆粒表面原子數與總原子數之比隨著直徑變小 而急劇增大 直徑為3 0a m 時 有大概1 0 的原子分布在表面 然而直徑降至3n n l 時 顆粒表面原子數已經占總原子數的5 0 表面對體積之比決定了潛在的活性基 團的數目 根據使用目的的不同這種高表面活性可以是有益的 例如抗氧化 藥物 運載能力 增強吸收能力和與生物組織間的相互作用 或者有害的 有毒性 不穩 定 誘導氧脅迫等 4 5 1 除尺寸小之外 納米材料還表現出許多機械 光學 物理 化學及超導等方面 的特性 因此被廣泛應用于填充劑 遮光劑 催化劑 半導體 化妝品 微電子和 生物醫學等各個領圳4 1 例如將納米二氧化鈦 t i 0 2 按照一定比例添加到化妝品 中 不但可以吸收紫外線 而且可以散射紫外線 可同時屏蔽c 型紫外線 b 型紫 外線和部分a 型紫外線 目前 日本等國已有部分含納米二氧化鈦的化妝品問世 6 隨著納米技術的產業化 各種形式的納米尺度的物質已經以各種不同的途徑進 入我們的日常生活當中 人們在工作和生活中接觸到他們的機會越來越多 從2 0 0 6 年發生在德國的魔術納米氣溶膠玻璃危害人體健康事件 7 到美國環境保護局公布發 現防曬霜中的納米二氧化鈦可能導致小鼠腦損傷的研究結果后導致的防曬霜爭議 中山人學碩士學位論文 引 越來越多的人開始關注納米材料是否對環境和人類健康帶來不利影響 從2 0 0 3 年起 n a t u r e 和s c i e n c e 等權威雜志已相繼發表論文 開始討論納米尺度材料的生 物效應以及對環境和健康的影響問題 3 5 9 1 2 1 科學界不僅看到納米材料在各個領域巾的巨大作用 同時也認識到納米技術可 能帶來的危害 2 0 0 3 年以后 美國 歐盟 德國 日本等發達國家相繼制定了國家 研究計劃 資助納米科技生物安全性的研究 例如2 0 0 4 年美國國家環保局撥款4 0 0 萬美元委托1 2 所大學開展納米材料對環境和人體可能產生危害的研究 研究課題 包括 皮膚對納米材料的吸附及其毒性 納米材料對飲水的影響 納米粒子對操作 者肺組織的影響 在海洋和淡水水域沉積的納米材料對環境的影響等 1 3 1 我國的國 家自然科學基金委 國家科技部也相繼啟動和資助了一些重大課題 總體來講 國 內外納米生物安全性的研究從起點 水平看相差不大 1 4 1 1 2 碳納米管及其細胞毒理學研究現狀 1 2 1 碳納米管簡介 碳納米管 c a r b o nn a n o t u b e s c n t s 是日本電子顯微鏡專家i i j i m a 在1 9 9 1 年 意外發現的一 種碳結構 1 由片層結構的石墨卷成的無縫中空的納米級同軸圓柱 體 兩端由富勒烯半球封帽而成 1 6 l 根據石墨片層的數目碳納米管可以分為單壁碳 納米管 s i n g l e w a u e dc a r b o nn a n o t u b e s s w c n t s 和多壁碳納米管 m u l t i w a l l e d c a r b o nn a n o t u b e s m w c n r s 單壁碳納米管的的直徑在0 7 5n m 3n m 之間 長度 為1 5 0p m 多壁碳納米管的直徑在2 3 0n m 之間 長度為0 1 5 0 m 層間距約為 0 3 4r i m 17 1 碳納米管具有許多獨特的性質 如重量輕 強度高 具有很好的熱穩定性 化 學穩定性和導電性 1 2 例如碳納米管的抗拉強度是鋼的1 0 0 倍 彈性模量與金剛石 相當 約為鋼的5 倍 硬度與金剛石相當 卻擁有良好的柔韌性 除本身具有許多 特異性質之外 碳納米管還可以通過物理吸附 靜電作用和共價連接等手段進行表 面修飾 近些年來隨著碳納米管及納米材料研究的不斷深入其廣闊的應用前景也不 2 中山大學碩十學位論文 斷展現出來 在生物 醫藥上也開始嶄露頭腳 有研究發現 碳納米管在運輸載體 生物傳感器 檢測病原體 治療癌癥等方面具有良好的應用前景 1 8 2 5 1 1 2 2 碳納米管毒理學研究現狀 隨著碳納米管在生物醫學方面應用的可能性不斷增加 關于碳納米管對細胞安 全性的研究也越來越多 碳納米管是否具有細胞毒性目前在不同的研究系統巾有不 同的結論 具有一定的爭議性 有研究顯示 碳納米管能夠抑制細胞增殖 并且呈 劑量和時間依賴性關系 2 6 2 7 碳納米管能誘導活性氧產生1 2 7 3 0 引起細胞聚集 2 6 3 誘導細胞發生凋亡 2 6 3 2 3 4 1 和激活核岡子k b n f k b 2 7 2 9 3 0 除此之外 c u i 等 2 0 0 5 用單壁碳納米管處理人體胚胎腎細胞l 5 天后 發現單壁碳納米管能降低細胞黏附 能力 流式細胞儀分析顯示單壁碳納米管還能改變細胞周期 細胞被阻滯在g 0 g 1 期 s 期細胞顯著減少f 2 6 1 同樣d i n g 等 2 0 0 5 用多壁碳納米管處理人皮膚成纖 維細胞時發現細胞被阻滯在g 2 m 期 3 3 1 n i c o l a 等 2 0 0 8 用單壁碳納米管 多壁 碳納米管和兩者的混合物處理j u r k a t 細胞2 4 小時 流式細胞儀分析顯示碳納米管 能引起質膜超極化 并且這種影響呈現濃度依賴性關系 3 2 1 另外單壁碳納米管能促 使細胞因子白介素8 i l 8 的釋放 3 0 3 5 p a c u r a r i 等 2 0 0 8 用未修飾的單壁碳納 米管處理人體正常和惡性問皮細胞2 4 小時后發現單壁碳納米管造成細胞d n a 損傷 2 9 1 o 雖然上述研究報道表明碳納米管可能具有細胞毒性的作用 但也有研究發現其 毒性作用不大 f l a h a u t 等 2 0 0 6 用相同的催化化學氣相沉積法 c c a d 制備了 三種不同的碳納米管 所用的金屬催化劑和量不同 處理人靜脈血管內皮細胞后 同時用中性紅染色法和m t t 檢驗法檢驗細胞活性 研究結果表明任何一種碳納米 管都沒有細胞毒性 3 6 除了體外細胞水平的實驗之外 碳納米管在模式動物體內中的生物學效應也開 始得到重視 2 0 0 4 年w a r h e i t 等將5m g k g 單壁碳納米管緩慢灌入小鼠的氣管中 發現小鼠的肺發生短暫的炎癥反應 處理1 個月后組織切片顯示小鼠的肺中發生多 發性肉芽腫 3 7 類似實驗也表明碳納米管能誘導小鼠肺部發生肉芽腫 3 8 枷 此外 有研究證實碳納米管進入小鼠腹腔后能引起炎癥和肉芽腫的形成 4 1 1 然而 與此相 中山大學碩士學位論文 反 有報道顯示小鼠靜脈注射單壁碳納米管后在體內沒有發現明顯的副作用 4 2 剞 1 2 3 碳納米管細胞毒性影響因素 在研究和爭論碳納米管是否具有細胞毒性的同時 近年來科學家們對于碳納米 管的生物學效應及其影響因素進行了深入探討 除了劑量這個關鍵岡素之外 j i a 等用直徑1 4n m 長度l m 純化的單壁碳納米管和直徑1 0 2 0h i l l 長度0 5 4 0 m 的多壁碳納米管處理小泡巨噬細胞 發現單壁碳納米管的細胞毒性遠遠大于多壁碳 納米管f 3 4 1 k a n g 等研究發現在抗菌方面單壁碳納米管比多壁碳納米管效果更好 而且證明碳納米管的大小是決定抗菌效果的一個關鍵岡剝4 5 1 些研究發現將碳納米管表面修飾或者高度純化的碳納米管能降低其毒性 k a m 等用流式細胞儀分析了暴露于連接羧基 生物素和熒光素的單壁碳納米管1 小時后的h l 6 0 和t u r k a tt 細胞 結果顯示表面功能化的單壁碳納米管并無明顯毒 性作用1 4 6 1 s a y e s 等 2 0 0 6 探討了不同程度功能化單壁碳納米管的細胞毒性 發 現碳納米管的細胞毒性與功能化密度有判4 7 1 f i o r i t o 等用高度純化的單壁碳納米管 處理人巨噬細胞4 8 小時后觀察統計凋亡或壞死細胞 p i 染色 發現純化的單壁碳 納米管只引起大約4 的細胞死亡 4 引 c h l o p e k 等 2 0 0 6 將高純度的多壁碳納米 管處理纖維原細胞和造骨細胞后檢測細胞活性及反應 研究結果表明細胞的骨鈣 素 細胞因子白介素 6 i l 6 和氧自由基的水平沒有明顯變化 因此該小組認為 多壁碳納米管和檢測的兩種細胞具有良好的生物適應性 4 9 1 也有人認為聚合程度是影響納米顆粒細胞毒性的因子之一 w i c k 等為了確定 團聚狀態如何影響單壁碳納米管細胞毒性 測試了四種不同的單壁碳納米管溶液 碳納米管生產過程中的原材料 合成后的塊狀碳納米管 由塊狀碳納米管離心過濾 得到的束狀碳管和球狀碳管 5 除了分散得很好的束狀單壁碳納米管 其余的碳管 都是聚集成塊狀的 結果發現塊狀的碳納米管細胞毒性比分散性較好的碳管的細胞 毒性大 該研究推測團聚的單壁碳納米管具有較大的剛性和尺寸 使碳納米管具有 類似石棉纖維的毒性 因此毒性相對較大 然而 與此相反t i a n 等研究了未純化單 壁碳納米管和已經除去金屬催化刺的單壁碳納米管 發現未純化的單壁碳納米管的 細胞毒性較低 5 該研究認為未純化的單壁碳納米管細胞毒性較低是岡為其聚集程 4 中i lj 大學碩士學位論文 度大 岡此毒性較低 這與w i c k 等提出的假設相悖 可能是由于使用了兩種不同 的細胞系 石棉誘導的肺癌細胞和角質形成細胞 從而得出不同的結論 碳納米管在生產過程中會使用一些金屬催化劑 如鐵 鎳等 k a n g a n 等探究 了單壁碳納米管巾鐵在細胞毒性方面的作用 他們選擇含有2 6 鐵催化劑的未純化 碳納米管和儀含0 2 3 鐵催化劑的純化碳納米管處理鼠巨噬細胞系r a w 2 6 4 7 與 純化的碳納米管相比 未純化富含鐵的單壁碳納米管誘導細胞產生更多的羥自由 基 氧自由基并顯著降低了細胞內谷胱甘 肽 g s h 的含量 積累脂質過氧化物 因此他們推斷碳管中鐵的存在可能是決定巨噬細胞中氧化還原產生的重要原因 5 2 1 s h v e d o v a 等報道了未純化的單壁碳納米管 含鐵雜質 對人表皮角質形成細胞具有 劑量和時間依賴性的細胞毒性 2 8 1 用較高濃度單壁碳納米管處理較長時間后 發現 細胞會產生自由基和過氧化物 谷胱甘肽 g s h 水平減少以及核和線粒體的形態 發生變化 但是加入金屬螯合劑后能降低毒性 這表明單壁碳納米管中剩余的鐵催 化劑可能參與了細胞毒性作用 此外 j i a 等發現使用低濃度的單壁碳納米管 1 1 4 m g c m 2 能抑制2 0 以上的細胞生長p 4 1 由于單壁碳納米管的純度為9 0 推測是金屬催化劑導致的細胞毒性 碳納米管的分散性一直是 4 個難以解決的問題 岡此有時候加入一定濃度的表 面活性劑以分散碳管 d o n g 等研究了不同的表面活性劑對碳納米管細胞毒性的影 響 5 3 l 實驗表明分散在十二烷基硫酸鈉 s d s 和鈉十二烷基苯磺酸鈉 s d b s 中單壁碳納米管對1 3 2 1 n 1 人星細胞瘤細胞的毒性是由于碳納米管表面的s d s 和 s d b s 產生的 而分散在膽酸鈉 s o 和單鏈d n a 中的單壁碳納米管對細胞的增 殖和存活率沒有影響 因此研究者呼吁在探討碳納米管的細胞毒性時應注意其分散 劑的毒性效應 除了上述因素之外 碳納米管的尺寸 比表面積 處理時間等也是影響細胞毒 性的重要因素 5 1 1 因此在探討碳納米管的細胞毒性時 對其表征進行全面的考慮是 非常必要的 1 2 4 碳納米管細胞毒性產生機制 目前 對碳納米管引起細胞毒性的機制研究還很少 一些假說被提出來用來解 5 中山人學碩七學位論文 釋碳納米管的細胞毒性 其中一種被廣泛認可并得到實驗證明的的機制是碳納米管 誘導細胞產生活性氧 r o s 導致細胞發生氧脅迫從而產生毒性 2 7 2 9 3 0 5 4 實驗表 明碳納米管刺激細胞產生的活性氧能激活核因子k b n f l c b 信號轉導途徑 r o s 激活i k b 激酶 i k k 使i r b a 磷酸化 于是被磷酸化的i k b a 與n f l c b 分離 n f k b 從胞質轉移至核內 與d n a 結合后啟動轉錄 與此同時活性氧釋放到細胞外 刺 激細胞分泌炎癥因子 t m h 和i l 8 進入細胞凋亡通路 導致細胞死亡 此外 t a n g 等用富勒烯 f u l l e r e n e 研究對微生物的影響時提出納米材料跟微 生物的物理接觸導致細胞損傷是納米材料的主要致死機制 5 5 1 k a n g 等用不同濃度 高度純化的單壁碳納米管處理大腸桿菌k 1 2 e c o l ik 1 2 后也提出了相同的猜想 5 剮 k a n g 等研究結果表明只有直接跟碳納米管接觸的大腸桿菌失去活性 且大腸桿菌 的活性并不隨碳納米管的濃度增加而變化 掃描電鏡觀察結果顯示大腸桿菌的細胞 膜已經嚴重受損 失去了細胞完整性 同時檢測了大腸桿菌培養液中細胞內含物質 粒d n a 和r n a 的含量 發現單壁碳納米管處理的菌液中質粒d n a r n a 的含量 比對照組中的含量分別高出5 倍和2 倍 證明細胞內含物已經外泄 因此 該研究 小組認為碳納米管對細菌的毒性是碳納米管跟細菌之間的物理接觸導致細菌細胞 膜受損而引起的 1 2 5 碳納米管對植物細胞影響研究現狀 碳納米管細胞毒性的研究大部分圍繞著動物或人體細胞 很少有關于納米材料 對植物細胞影響的報道 l i n 等 2 0 0 9 首次利用多壁碳納米管研究了對擬南芥 a r a b i d o p s i st h a l i a n a 懸浮細胞系t 8 7 的細胞毒性1 5 7 1 用不同濃度 1 0i l l 雩幾6 0n l g 幾 1 0 0m v l6 0 0m g 1 多壁碳納米管 有兩種不同聚集程度的碳納米管 處理擬南芥 懸浮細胞2 7 天后 檢測了細胞干重 活性 細胞葉綠素含量和過氧化物歧化酶 s o d 的酶活 研究結果表明多壁碳納米管處理細胞后 細胞干重減少 活性下 降 葉綠素含量減少 s o d 酶活性降低 并且聚集程度小的碳納米管對細胞的影響 更明顯 植物細胞壁是植物細胞區別于動物細胞的主要特征之一 主要由相交聯的多糖 組成 由于有細胞壁和細胞膜組成的雙重屏障 外界分子很難進入植物細胞 碳納 6 中山大學碩士學位論文 米管具有許多獨特的性質 已經有研究報道碳納米管能運輸生物大分子進入動物細 胞中阢5 8 5 9 1 在植物中也有研究報道硅納米顆粒能運輸d n a 和化學藥品進入去掉 細胞壁的原生質體當中l 刪 l i u 等的研究發現單壁碳納米管能穿過完整植物細胞的 細胞壁和細胞膜進入到細胞內部 并且能運輸單鏈d n a 分子進入植物細胞中 6 1 1 而且該研究還推測碳納米管能運輸生物大分子至特定的細胞器 由此可見 單壁碳 納米管作為運輸載體應用到植物細胞中是很有可能的 1 3 植物程序性細胞死亡簡介 細胞死亡是生物體的一種常見生命現象 根據死亡的形式一般可分為兩種 細 胞壞死 n e c r o s i s 和程序性細胞死亡 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p c d 細胞壞死是 細胞在遭受環境中的強熱 冰凍 強烈機械損傷等因素時出現的一 種非生理性細胞 死亡 這種死亡以原生質膜的破裂為特征 6 2 1 造成細胞內含物的外泄 引起周闈組 織發生炎癥反應 故對生物體的生長發育很不利 程序性細胞死亡是生物體在發育 過程中或環境影響下 通過自身內部機制啟動并調節的細胞生理性自然死亡的過程 6 3 1 是一種主動的 生理性的細胞死亡過程 這種死亡是由基因啟動和調控的 在 高等生物體內廣泛存在 對生物體生長發育具有積極意義 程序性細胞死亡的研究最先開始于動物細胞 1 9 5 1 年 g l u c k m a n n 首先提出了 細胞程序化死亡的概念 證明在脊椎動物和無脊椎動物中都存在該現象 6 4 1 1 9 6 1 年 k a r l 發表文章闡述程序化細胞死亡的形式及對植物正常生理活動的重要性 1 9 7 2 年 k e r r 等在生物體發育過程中發現了一種與細胞壞死形態特征完全不同的 細胞死亡方式 將其命名為細胞凋亡 a p o p t o s i s 6 5 1 并認為細胞凋亡是程序性死 亡一 種的組織形式 植物p c d 的研究起步較晚 1 9 8 5 年 尤瑞麟研究了正常小麥珠心細胞衰退過 程中超微結構的變化 引用了p c d 的概念慚l 二十世紀9 0 年代初 g r e e n b e r g 等 發現在植物對病原菌的防御反應中存在程序性死亡的現象 6 7 1 此后 眾多研究者從 形態學觀察 超微結構 細胞化學 生物化學 基岡調控 酶學和信號傳導等方面 對植物p c d 進行了研究 近年來研究證實p c d 廣泛存在于植物生長發育的各個階 段和抵抗病原菌 外界脅迫的防御反應中 如胚柄形成 6 8 1 糊粉層降解 6 9 1 導管的 7 中i ij 人學碩士學位論文 分化形成 7 0 1 和葉片形態的正常形成 7 1 l 珠心細胞的退化口2 1 通氣組織的形成1 7 3 1 根皮層細胞的死亡f 7 4 1 植物病原微生物互作引發的過敏反應 h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e h r 7 5 7 8 1 等 j o n e s 認為植物p c d 的研究主要集中在三個方面 終端分化 t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n 植物衰老 環境脅迫和病害抵抗 7 9 1 目前國際上主要研究是以病 原菌引起的植物p c d f 8 0 8 3 1 在p c d 發生過程當中 一般伴隨著特定的形態 生理 生化特征出現1 8 4 1 3 1 植物程序性細胞死亡特征 發生p c d 的植物細胞有其獨特的形態學特征 主要表現為 細胞體積縮小 密度增大 細胞質和細胞核發生凝縮 染色質凝集并邊緣化 細胞器發生有序解體 消失 部分細胞質和細胞核碎片由細胞膜包被形成凋亡小體 a p o p t o t i cb o d y 細 胞膜保持完整性 沒有細胞內含物溢出 髓1 但也有研究認為植物細胞由于細胞壁的 存在不會產生凋亡小體 細胞死亡后并不被臨近細胞吞噬 在程序性死亡過程中液 泡參與降解細胞器 在一些情況下構成利于自身發展的特殊結構 如皮層細胞死亡 形成通氣組織 導管細胞死亡后形成輸導組織 7 0 7 3 8 6 植物程序性細胞死亡在生物化學上的特征主要表現為細胞核內d n a 的變化 在內源性核酸內切酶的作用下 細胞內d n a 在核小體連接區被切開降解成以1 8 0 b p 為基數的寡聚核小體片段 在瓊脂糖凝膠電泳上呈現特異性的 梯狀 條帶 d n a 斷裂會形成3 o h 端 6 7 1 1 3 2 植物程序性細胞死亡檢測方法 研究p c d 的方法有很多 目前主要采用的是形態觀察法和生化檢測法 發生 p c d 的植物細胞與壞死的細胞形態存在明顯差別 根據其典型的形態學特征 應用 光學顯微鏡和電子顯微鏡可以觀察并區分細胞是否發生p c d 電子顯微鏡是觀察細 胞形態變化的最佳方法 樣品制成超薄切片后 經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色 在電鏡下可以清楚得觀察到細胞核和細胞器的超微結構變化 并且可以觀察到p c d 不同時期的細胞結構變化 可對細胞程序性死亡提供確切的證據 8 p c d 發生時 內源性核酸內切酶激活 導致d n a 非隨機性斷裂成1 8 0 b p 整倍 中山大學碩士學位論文 數的寡核苷酸片段 形成d n al a d d e r l 6 7 1 而壞死細胞的d n a 降解隨機發生 電泳 時表現為連續分布的d n a 條帶 但有研究表明并非所有發生p c d 的細胞都能產生 d n a 特異片段f 鵝 根據細胞發生p c d 時d n a 斷裂成不同長度的片段 還可以采 用彗星電泳法 c o m e ta s s a y 檢測 在電流作用下d n a 片段會移出細胞核 d a p i 染色后可觀測到彗星狀的核d n a 的遷移 彗星電泳法敏感度高 所需細胞用量少 可較精確地反映細胞的凋亡 但是不能直接檢測帶壁植物細胞的凋亡f 黔1 t u n e l t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s em e d i a t e dd u t pn i c ke n d l a b e l l i n g 是指脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的d u t p 缺口末端標記法 是原位檢測細胞凋 亡最為敏感 快速 特異的方法 該法最早是由g a v r i e l i 等建立即1 利用細胞凋亡 中染色體d n a 雙鏈斷裂或一條鏈上出現缺口產生的y o h 端 在脫氧核糖核苷酸 末端轉移酶 t d t 的作用下 將脫氧核糖核苷酸和熒光素 過氧化物酶 磷酸化 酶或生物素形成的衍生物標記到d n a 的3 末端 從而進行凋亡細胞的檢測 t u n e l 法實際上是分子生物學和形態相結合的方法 對完整的凋亡細胞核或凋亡小體進行 原位染色 能準確地反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征 6 3 1 1 9 9 9 年g o p i n g 等將該技術改良后應用到電鏡上 9 1 1 證明該技術在電鏡上也能準確地檢測細胞凋 亡 由于其可靠性 t u n e l 檢測成為目前植物細胞程序性死亡檢測的首選手段 同時應用l m t u n e l 和e m t u n e l 檢測 y a o 等證明毒素v i c t o r i n 能誘導燕麥葉 片發生程序性細胞死亡 并且該實驗首次在植物中運用e m t u n e l 技術檢測程序 性細胞死亡 9 2 1 1 3 3 活性氧與植物程序性細胞死亡 活性氧 r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s 是 類具有超氧化能力 能持續進行反 應的物質 如超氧陰離子 0 2 過氧化氫 h 2 0 2 羥自由基 o h 等 在植 物中可以在多個部位通過多條途徑生成 如葉綠體可通過m e h l e r 反應產生0 2 和 h 2 0 2 線粒體在消耗n a d h 的同時產生0 2 i 和h 2 0 2 過氧化物酶體通過乙醇酸氧 化產生h 2 0 2 9 3 r o s 最初被認為是細胞代謝的有毒的副產物 植物細胞具有多種清除r o s 的 酶 如超氧化物歧化酶 s o d 抗壞血酸過氧化物酶 a p x 過氧化氫酶 c a t 9 中 1 1 人學碩士學位論文 等 使細胞免受r o s 的毒害 l e v i n e 等研究大豆懸浮細胞時證實h 2 0 2 在植物抵御 環境脅迫中充當了信號分子 誘導細胞發生過敏反應 h y p e r s e n s i t i v er e s i s t a n c e h r 9 4 1 近年來越來越多的證據表明 r o s 在植物細胞程序性死亡過程巾具有調節信號 轉導的作用 在植物抵御病原菌侵染以及誘導細胞死亡的過程中 r o s 大量產生于 細胞壁 細胞膜 線粒體 葉綠體等不同部位 y a o 等利用電鏡氯化鈰 c e c l 3 染 色法 研究毒素v i c t o r i n 誘導燕麥葉片發生p c d 時發現 h 2 0 2 首先在線粒體上產 生和積累 之后才發生染色質凝縮和d n a 斷裂 并且阻止線粒體r o s 迸發也能阻 止p c d 發生 因此推測源于線粒體的r o s 是調節植物p c d 的一個重要因素 9 列 目前 人們普遍認為 在植物的p c d 過程中r o s 可能起到三個方面的作用 一是 低濃度時作為信號分子傳導環境脅迫信號 二是中等濃度時能誘導細胞發生p c d 三是高濃度時細胞發生壞死 9 6 1 1 4 本課題的研究意義及創新性 根據j o s e p h 和m o r r i s o n 報道 在農業和糧食產業 納米技術很可能應用于分 子治療疾病 快速疾病診斷 增強植物吸收養分能力等方面 微型傳感器和微型傳 輸系統能幫助農業作物抵抗病毒及其他病原菌 在癥狀可見之前確定植物的健康狀 態 在不久的將來很可能利用納米級別的催化劑增加農藥和除草劑的功效 降低農 藥和除草劑的劑量 以減少對環境的污染 納米技術也可以通過使用納米級催化劑 減少農藥污染或清除已存在的污染來間接保護環境 97 1 碳納米管具備許多特異的力學 電學和化學性能 近些年來隨著研究的深入其 廣闊的應用前景也不斷展現出來 l i u 等的研究發現單壁碳納米管能運輸單鏈d n a 分子穿過完整植物細胞的細胞壁和細胞膜進入到細胞內部 6 1 1 由此可見 單壁碳納 米管作為運輸載體應用到植物細胞中是極有可能的 然而 碳納米管進入環境或生物體內是否存在風險仍不確定 目前已有大量碳 納米管的細胞毒理學研究 但絕大多數都集中在動物細胞和組織中 且已公開的研 究結果也存在極大的爭議 碳納米管對植物細胞的影響鮮有報道 正確評估碳納米 管的生物學效應 探討納米對植物及其環境的影響 是具有重要意義的前瞻性研究 1 0 中i i j 入學碩十學位論文 本文利用擬南芥和水稻原生質體系統 結合光鏡 電子顯微鏡觀察 以及 e m t u n e l r t p c r 等檢測手段 從多方面探討了商業化單壁碳納米管對植物細 胞的影響 本研究為進一步研究碳納米管作用于植物細胞的分子機理打好了基礎 給碳納米管在植物中的應用提供了一些科學依據 中i i j 人學碩士學位論文 2 1 實驗材料 第二章實驗材料和方法 擬南芥野生型 c o l u m b i a c 0 1 水稻 日本晴 n i p p o n b a r e 植物培養土 丹麥進口品氏水蘚泥炭土 納米材料 單壁碳納米管 s w c n t s 購于中國科學院成都有機化學有限公司 直徑為1 2n n l 長度約為3 0 m 碳納米管的純度大于9 5 其中單壁 碳納米管的含量大于9 0 比表面積大于3 8 0m 2 g 2 2 實驗試劑 c m i 1 2 d c f d a 購自m o l e c u l a rp r o b e s e u g e n e o r u s a d a p i 購自r o c h e s h a n g h a i c h i n a f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f d a 和t r y p a nb l u e 購自s i g m a s i g m a a l d r i c h c h i n a t h ea p o p t a gp l u sf l u o r e s c e i ni ns i t ua p o p t o s i sd e t e c t i o nk i t 購自c h e m i c o n c a l i f o r n i a u s a c e l l u l a s er 1 0 和m a c e r o z y m er 1 0 購自北京 普博欣新生物技術發展有限公司 y a k u l t j a p a n 進口分裝 t a qd n a 聚合酶購自 t a k a r a 公司 c d n a 一鏈反轉錄酶試劑盒購自f e r m a n t a s 公司 r n a 提取試劑t r i z o l 購自i n v i t r o g e n 活性碳 a c t i v a t e dc a r b o n a c 購白天津市福晨化學試劑廠 其他 常用試劑均為廣州化學試劑廠分析純試劑 試劑配制 5m g n l lf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f d a i na c e t o n e 1m g r n id a p i i nd d h 2 0 1 0 0 mc m h 2 d c f d a i nd m s o 5 0m mm o p s i nh 2 0 1 2 中山大學碩士學位論文 1 0m m c e c h i n5 0n 1 mm o p s 0 1mc b s i n d h 2 0 p h 7 4 5m m p p i x i n d m s o 5 0m m c 2 c e r a m i d e i ne t h a n 0 1 s w c n b 配制方法 稱取適量s w c n t s 加入w 5 培養液配制成1m g n 1 l 的母液 e l m a s o n i cs 3 0 h 超聲清洗器超聲處理3 0 秒獲得分散