轉基因生物和基因打靶 轉基因動物 用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內 并能穩(wěn)定傳代的一類動物 轉入的目的基因稱為轉基因 transgene 這種轉移目的基因的過程稱為轉基因作用 transgenesis 關于 轉基因 的概念 通常只限于動 植物中經基因工程技術進行的基因轉移 因此品種間不論有性或無性雜交獲得新基因的途徑都不屬此范疇 特點 分子及細胞水平的操作組織和整體水平的表達 分子及細胞水平的操作 組織和整體水平的表達 目的 從1982年轉基因鼠問世以來 轉基因動物研究在許多領域都取得了令人矚目的成就 根據不同的目的 轉基因動物操作可以簡單地劃分為四種類型 l 疾病型轉基因動物 2 利用轉基因動物制藥 3 動物改良型 4 基礎生物學研究 轉基因研究大事記 1974年 美國學者Jaenisch應用顯微鏡注射法把基因導入真核細胞 1981年 美國科學家將外源基因導入動物胚胎 創(chuàng)立了轉基因動物技術 1982年獲得轉基因小鼠 1987年 世界上第一只商業(yè)化轉基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生 這只轉基因母羊的乳汁中可以分泌 抗胰蛋白酶 1989年 意大利學者用精子作為載體 成功地獲得了純系轉基因小鼠 1997年2月 英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊 多利 培育成功 1997年10月 英國羅斯林研究所宣布已克隆出3只攜帶有人凝血因子 基因轉染綿羊 1999年2月 上海遺傳研究所宣布轉基因試管牛 滔滔 誕生 其體內被檢測到帶有人的血清白蛋白基因 這項成果被評為當年 中國十大科技進展 之一 2000年6月22日晚8時整 生物胚胎工程專家張涌教授在西北農林科技大學種羊場順利接生了一只雌性體細胞克隆山羊陽陽 由于轉基因動物體系打破了自然繁殖中的種間隔離 使基因能在種系關系很遠的機體間流動 它將對整個生命科學產生全局性影響 因此轉基因動物技術在1991年第一次國際基因定位會議上被公認是遺傳學中繼連鎖分析 體細胞遺傳和基因克隆之后的第四代技術 被列為生物學發(fā)展史上126年中第14個轉折點 待轉移的目的基因的獲得與設計動物遺傳背景及種系的選擇在進行轉基因動物研究時要考慮遺傳背景及種系的問題 轉基因動物建立流程 轉基因動物生產主要步驟包括 目的基因的選擇 這應視生產目的而定 將重組基因轉入受精卵 常使用的方法有顯微注射法 反轉錄病毒感染法 胚胎干細胞法 精子載體法 脂質體法等將轉入了外源基因的受精卵植入同期發(fā)情的受體動物 在植入前完成整合胚胎的檢測 篩選 建立ES細胞系 對出生后基因整合 表達情況進行檢測 對整合 表達的轉基因動物進行育種試驗 建立由成功轉基因個體或群體組建的轉基因系 轉基因的方法主要有4類 1 融合法包括細胞融合 微細胞介導融合等 2 化學法包括DNA 磷酸鈣沉淀法 DEAE 葡聚糖法 染色體介導法等 3 物理法包括顯微注射法 電脈沖法 細胞凍存法等 4 病毒感染法包括重組DNA病毒感染 重組RNA病毒感染等 主要有3種途徑可以產生轉基因動物 顯微注射法反轉錄病毒法胚胎干細胞法 轉基因動物技術 顯微注射法 常用的細胞1 受精卵 受精卵 基因操作 注射假孕動物子宮 胚胎 個體 2 胚胎干細胞 從著床前的動物胚胎中分離多功能胚胎干細胞 基因操作 注射入動物囊胚 形成嵌合體胚胎 嵌合個體 用顯微注射儀將外源基因直接注射入實驗動物受精卵中 利用外源基因整合到DNA中 從而得到轉基因動物 特點 導入速度快 操作簡單 對DNA大小無限制 不需要載體 整合效率較高 它可以直接獲得純系 缺點 需要貴重精密儀器 技術操作較難 并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制 易造成宿主動物基因組的插入突變 引起相應的性狀改變 重則致死 胚胎干細胞介導法 胚胎干細胞 embryonicstemcell ES 是指從哺乳動物胚胎囊胚期內的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞 這種細胞具有發(fā)育的多能性 能夠分化出各種組織 這個途徑是將外源基因直接導人ES細胞 經體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中 與其中的囊胚細胞聚集在一起 成為受體胚胎的一部分 參與其分化 由這種胚胎發(fā)育而成嵌合體的轉基因動物 即其中有一部分組織來源于整合有外源基因的供體ES細胞 在嵌合過程中 被轉化的ES細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將引人的外源基因傳遞下去 將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上 制成高濃度的病毒顆粒 人為感染著床前或著床后的胚胎 也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共孵育以達到感染的目的 通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去 特點 用于分裂后的早期胚胎 特別適于禽類的轉基因研究 單點單拷貝插入 外源基因的完整性不易被破壞 逆轉錄病毒感染法 經電穿孔等方法把外源基因導入精子 令其與卵子結合 受精 精子載體法 建立鼠系 轉基因動物中外源DNA的檢測 染色體和基因水平 分離基因組DNA 進行斑點雜交 Southern雜交和PCR分析 原位雜交等以評估外源基因的整合情況 轉錄水平 Northern雜交 RT PCR 蛋白質水平 Western印漬分析 動物轉基因技術面臨著一些問題 生產效率低基因整合效率不高生產周期長 成本高轉基因動物死亡率高常出現不育導致轉基因難以傳代無法大規(guī)模生產 轉基因克隆動物 動物克隆技術屬于無性繁殖范疇 能實現基因型復制 使少數優(yōu)秀個體迅速擴大成群 轉基因克隆技術是轉基因技術和動物克隆技術的有機結合 其研究意義和實用價值又超過了兩種技術 它以轉基因細胞為核供體 采用體細胞核移植技術產生轉基因克隆動物 實現種質創(chuàng)新 轉基因克隆動物技術顯示出現的優(yōu)勢1 生產效率高2 周期短 成本低3 可以決定后代性別 生產效率高顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可見性 外源基因的拷貝數和整合位點都是隨機的 還可能出現嵌合體 整合率極低 得到的轉基因動物數量更少 據統(tǒng)計有的醫(yī)療公司從1989年至1997年用顯微注射技術生產轉基因動物平均51 4個動物才得到一個轉基因后代 而得到一個轉基因克隆后代只需20 8個母體 周期短 成本低通過核移植克隆迅速產生大量同質的轉基因克隆動物 轉基因克隆技術在理論上 只需一代時間 就可以產生一個完整的轉基因克隆動物系 從而節(jié)約了時間和成本 由于植入代孕母畜的全是轉基因胚胎 因而提高生產效率 降低費用 可以決定后代性別以生物制藥為目的的轉基因克隆動物 生產中 性別是相當重要的 例如需要用雌性生產乳汁 第一代若為雄性 則要等到女兒成熟后才能生產 至少兩代 由于選擇體細胞作為供體 可以預先決定性別 還可以用PCR對性別檢測 只挑選性別合適的細胞作為核供體 轉基因動物的應用前景 轉基因動物是對多種生命現象本質深入了解的工具 如研究基因的結構與功能的關系 細胞發(fā)育的潛能性 細胞核與細胞質的相互關系 胚胎發(fā)育調控 腫瘤 神經與發(fā)育等 可以用來建立多種疾病的動物模型 進而研究這些疾病的發(fā)病機理及治療方法 能提高動物育種效率 轉基因動物技術可由于改造動物的基因組 使家畜 家禽的經濟性狀改良更加有效 如使生長速度加快 瘦肉率提高 肉質改善 飼料利用率提高 抗病力加強等 加上體細胞克隆技術能使優(yōu)良種畜迅速擴群 在短時間培育出新品種 對于動物遺傳資源保護的意義更加深遠 對瀕危物種挽救是必不可少的 轉基因動物可作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應器 通過家畜乳腺分泌大量安全 高效 廉價的人體藥用蛋白 一直是轉基因動物研究的熱點 從1987年Gordon等人在轉基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子 tPA 到現在已有數十種人體蛋白在家畜乳腺中表達 這些蛋白可以用于治療人類相關疾病 到1998年至少已有3種轉基因技術生產的重組蛋白用于臨床試驗 如從轉基因山羊獲得的抗凝血酶III 從轉基因綿羊得到的 1 抗胰蛋白酶 還有來自轉基因兔的 葡萄糖苷酶 但目前轉基因動物研究面臨的一個重要問題是傳代難 通過轉基因動物可以生產人體或動物進行器官或組織移植時所需的器官和組織 如人們發(fā)現人的胎兒神經細胞可用于帕金森癥治療 但由于倫理道德的原因 這種移植組織難以得到 研究表明 家畜胎兒神經細胞可以替代人類神經細胞用于帕金森癥的治療 人體移植器官短缺是一個世界性難題 不得不把目光移向動物以尋求可替代移植器官 豬器官的體積和形狀以及DNA基本與人類相似 是理想的腎 心 肝等器官供應者 但這種組織器官移植面臨的主要問題是免疫排斥 有兩種解決辦法 一是在移植前去除受體器官的抗體 但它能迅速再生成 另一種較長久的措施是通過轉基因技術 特別是基因打靶技術 向器官供體基因組敲入某種調節(jié)因子 抑制 半乳糖抗原決定基因的表達 或敲除 半乳糖抗原決定基因 再結合克隆技術 培育大量不含免疫排斥的轉基因克隆豬的器官 轉基因動物的研究發(fā)展很快 但仍有許多難題有待解決 除了技術問題以外還涉及倫理 法律 安全性及產品如何被消費者接受的問題 可以預見 以上問題將會得到解決 該領域的研究開發(fā)將成為國際生物工程領域實用化方向的競爭熱點 思考題 轉基因動物的制備應包括那些環(huán)節(jié) 制備轉基因動物可能會遇到哪些問題 你認為可采用哪些方法去解決 第二節(jié) 基因打靶genetargeting 一 概述 基因打靶是利用DNA同源重組原理 在基因組中的某一特定部位進行定點的基因重組 是研究基因的功能的有效手段 包括基因敲除 geneknockout 和基因敲入 geneknockin 同源重組的分子過程1 兩段較長的同源DNA或同源染色體彼此靠攏 在二條相同極性上斷裂2 產生交叉結構3 在交叉處橫斷內切 產生4種含有異源雙鏈的重組產物 二 基因敲除的基本程序 1 構建打靶載體1 同源序列2 打靶載體常含兩種篩選標志neor 新霉素抗性基因 陽性篩選標志 neor基因插入用于打靶的外源DNA中 當重組后 細胞能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長 neor HSV tk HSV tk 單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因 陰性篩選標志 該基因產物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產物 產生自殺效果 HSV tk基因插入外源基因外側的載體序列中 同源重組時 Tk 基因往往丟失 隨機整合時 Tk 基因連同打靶載體整合到核基因組上 而同時獲得neo和HSV tk兩個基因的打靶細胞 2 將載體導入ES細胞選取發(fā)育第4 5天的胚胎干細胞 ES 把外來基因轉入胚胎肝細胞 并篩選打靶成功的細胞 隨機整合 同源重組 3 將基因敲除ES細胞注射入胚泡 形成嵌合胚胎 4 將10 20個胚泡植入假孕小鼠子宮 5 獲得子代小鼠 篩選帶有靶基因的小鼠 常有的方法有 Southern印記 Northern印記 把胚胎注入假孕小鼠 Southern印記 把細胞注入胚泡 6 雜和小鼠 間雜交 獲得子二代小鼠 7 篩選的 子二代小鼠 三 基因打靶在醫(yī)學中的應用 1 采用基因打靶技術可建立基因缺陷型的疾病模型 用于研究遺傳疾病發(fā)生的分子機制 2 基因打靶與腫瘤的研究研究基因改變與腫瘤發(fā)生及治療的關系3 基因打靶可用于構建高效的動物反應器或植物反應器 用于藥物生產 小結 轉基