電離輻射對人鼻咽癌細胞株CNE2Z體外表達血管內皮生長因子的影響【摘要】目的探討電離輻射對人鼻咽癌細胞體外表達血管內皮生長因子（VEGF）的影響。方法人鼻咽癌細胞株CNE2Z置RPMI1640培養液培養，實驗分為兩組，劑量梯度組分別給予2、4、6、8、12、16Gy電離輻射；時間梯度組給予6Gy照射；收集細胞上清液，雙抗體夾心ELISA法測定VEGF表達水平。結果與陰性處理細胞比較，人鼻咽癌細胞株CNE2Z體外接受不同劑量輻照后，VEGF表達明顯增高，且具有劑量依賴性和時程依賴性。結論電離輻射能誘導人鼻咽癌細胞VEGF高表達，這可能是臨床腫瘤抗輻射的機制之一。【關鍵詞】電離輻射；鼻咽癌細胞；血管內皮生長因子【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofionizingradiation(IR)onvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressioninnasopharygealcarcinomacells.MethodsCNE2ZnasopharygealcarcinomacellsweremaintainedinRPMI1640mediumandexposedtoIRinincrementaldosesof2,4,6,8,12,16Gy.Thesecellswerecultureddifferenttimeafterexposure,andthemediawereharvestedformeasurementofVEGFproteinlevelsbyELISA.ResultsExposureofCNE2ZcellstoIRinducedsignificantupregulationofVEGFexpression.VEGFlevelsexhibitedanIRandtimedependentincreaseincomparisonwiththecontrolunirradiationcells.ConclusionIRmediatedinductionofVEGFinnasopharyngealcarcinomacellsmaycontributetoclinicallytumourradioresistance.【Keywords】ionizingradiation,nasopharyngealcarcinoma,VEGF鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，放射治療是其首選的治療手段，局部復發和遠處轉移仍是治療失敗的主要原因。惡性腫瘤的生長和轉移依賴于血管生成，血管內皮細胞生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是最重要的與血管生成有關的因子。在放射治療過程中，有關VEGF表達變化的研究國內少有報道，對此，我們初步探討如下。1材料與方法1.1細胞培養及照射取對數生長期細胞制成1105/ml單細胞懸液，2ml/孔接種于六孔板中，待細胞貼壁后（約12h），采用Siemens直線加速器6MeVX射線，吸收劑量率2Gy/min，源皮距100cm，射野大小10cm20cm，從下向上照射。實驗分為兩組：劑量梯度組分別給予0、2、4、6、8、12、16Gy照射；時間梯度組給予6Gy照射。1.2條件培養液的收集劑量梯度組于照射后24h，時間梯度組于照射后0、12、24、36、48h時間點終止培養，收集細胞培養液，轉移至1.5mlEppendorf管，4，2000r/min離心5min，吸取上清液-20冷凍保存備用。1.3條件培養液VEGF濃度的測定采用雙抗體夾心ELISA法測定細胞上清液VEGF。人VEGFELISA試劑盒購自中杉生物工程公司，具體操作按說明書進行。1.4數據分析與統計實驗數據資料統計采用統計學軟件SPSS10.0進行單因素方差分析。2結果不同劑量射線照射24h后，CNE2Z細胞VEGF的表達均增高。4Gy時最高，后隨劑量的增加有所下降，與對照組0Gy比較，差異均有顯著性（P<；005），見表1。表1不同劑量照射24h后CNE2Z細胞培養液中VEGF濃度略6Gy照射后，各時間點條件培養液中VEGF的含量逐漸升高，36h時與0h比較，差異有顯著性（P<；0.01），到48h時達最高水平,與對照組0h時比較，差異有極顯著性（P<；001），見表2。表2照射后不同時間CNE2Z細胞培養液中VEGF濃度6Gy照射后時間（略）3討論放射治療失敗的主要原因有腫瘤細胞的放射抵抗性、腫瘤細胞的遠處轉移等。低氧是導致腫瘤放射抵抗的一個重要原因2，低氧能誘導腫瘤細胞表達VEGF，放射也可以誘導VEGF的高表達3，4。腫瘤細胞產生的VEGF不僅以旁分泌方式刺激血管生成，而且以自分泌方式刺激腫瘤細胞自身的生長。VEGF可能在腫瘤細胞以及腫瘤血管內皮細胞經過放射損傷后的修復過程中發揮一定的作用5。放射治療不僅對腫瘤細胞有直接或間接殺傷作用，還具有封閉腫瘤血管的作用，可使血管內皮細胞退化、變性。隨著腫瘤縮小，腫瘤微血管更加迂曲、變形、管腔縮小，血流緩慢，血栓形成，使腫瘤微血管進入封閉狀態6。然而，已有文獻報道，放射治療本身也可引起腫瘤血管生成活躍，VEGF分泌增加79。其機制可能是：腫瘤細胞受照射的應激保護性反應。電離輻射激活轉錄所需的PKC（蛋白激酶C）信號轉導系統，促進VEGF等多種細胞因子表達。放射治療還可以激活EGFR，通過MAPKS信號傳導通路，調節TGF、VEGF等生長因子表達增加。放射治療還直接激活MAPKS，應激相關蛋白激酶和ras相關激酶等改變細胞增殖狀態，使腫瘤細胞得以生存。放射治療促進VEGF表達和血管生成，無效的血管生成使乏氧細胞增加，乏氧細胞增加又促進血管生成，如此惡性循環，最終導致腫瘤對放射治療產生抗性。Gorski等10研究證實Lewis肺癌細胞體外接受電離輻射后，VEGF的表達明顯增高，移植瘤輻射后瘤體組織VEGF增加。本文結果顯示，與未受輻射細胞比較，人鼻咽癌細胞系CNE2Z體外接受不同劑量的輻射后，VEGF的表達也明顯增高，且隨輻射劑量的增加、輻射后時間的延長，效應越加顯著。提示電離輻射誘導腫瘤細胞VEGF高表達，可能是腫瘤治療過程中產生放射抵抗性的機制之一，推測放射治療聯合抗VEGF的抗血管生成治療可能會取得理想的抗腫瘤效應。雖然從理論上講抗血管生成治療導致血管的退行性變，引起腫瘤內的缺氧狀況，導致腫瘤細胞的放射抵抗性，但是大量的實驗證據已經駁斥了這種觀點11。放射治療聯合抗血管生成治療可以有協同作用并非僅僅是相加作用。隨著抗血管生成治療與放射敏感性機制的研究深入，以及抗血管生成方法和藥物不斷發現，可以樂觀地預計抗血管生成在腫瘤放射治療中會日益受到重視，并成為腫瘤綜合治療的重要措施之一?！緟⒖嘉墨I】1GuptaVK,JaskowiakNT,BeckettMA,etal.VascularendothelialgrowthfactorenhancesendothelialcellsurvivalandtumorradioresistanceJ.CancerJ,2002,8(1):4754.2BrizelDM,SibleyGS,ProsnitzLR,etal.TumorhypoxiaadverselyaffectstheprognosisofcarcinomaoftheheadandneckJ.IntJRadiatOncolBiolPhys,1997,38(2):285289.3MoellerBJ,CaoY,LiCY,etal.RadiationactivatesHIF1toregulatevascularradiosensitivityintumors:Roleofreoxygenation,freeradicals,andstressgranulesJ.CancerCell,2004,5(5):429441.4SemenzaGL.Intratumoralhypoxia,radiationresistance,andHIF1J.CancerCell,2004,5(5):405406.5GengL,DonnellyE,McMahonG,etal.InhibitionofvascularendothelialgrowthfactorreceptorsignalingleadstoreversaloftumorresistancetoradiotherapyJ.CancerRes,2001,61(6):24132419.6DenisF,ColasS,ChamiL,etal,Changesintumorvascularizationafterirradiation,anthracyclin,orantiangiogenictreatmentinnitrosomethylureasinducedratmammarytumorsJ.ClinCancerRes,2003,9(12):45464552.7ParkJS,QiaoL,SuZZ,etal,Ionizingradiationmodulatesvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressionthroughmultiplemitogenactivatedproteinkinasedependentpathwaysJ.Oncogene,2001,20(25):32663280.8WachsbergerP,BurdR,DickerAP.Tumorresponsetoionizingradiationcombinedwithantiangiogenesisorvasculartargetingagents:exploringmechanismsofinteractionJ.ClinCancerRes,2003,9(6):19571971.9BrownCK,KhodarevNN,YuJ,etal.GlioblastomacellsblockradiationinducedprogrammedcelldeathofendothelialcellsJ.FEBSLett,2004,565(13):167170.10GorskiDH,BeckettMA,JaskowiakNT,etal.Blockadeofthevascularendothelialgrowthfactorstressresponsein