代謝組學在中醫證候本質研究中的應用概況代謝組學是一門對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系，揭示機體生命活動代謝本質的科學，其研究對象大都是相對分子質量1000以內的小分子物質。中醫證候是通過中醫四診獲取的基本信息，概括人體在病程中某一時間段的病理狀態。因此，通過祖國醫學對人體所處證候的分類研究，用代謝組學方法對生理病理信息進行分析，認識人體的狀態特征，從更深層次溝通中西醫兩種醫學體系，是實現中醫學證候現代化的有效途徑之一。現將代謝組學在中醫證候本質研究中的應用概況論述如下。1代謝組學1.1概況國際“代謝組學之父”、英國帝國理工大學JeremyK.Nicholson教授基于長期對生物體液的研究，于1999年提出了代謝組學的概念：定量測量生物系統對病生理刺激和基因修改所做的與時間相關的多參數代謝應答1。從健康到病理改變，從體質到證候，人體的代謝產物會隨之發生動態變化。所以，利用代謝組學研究人體代謝物組，可以用于疾病的診斷和中醫證候的判斷。1.2研究方法代謝組學的研究一般包括代謝組數據的采集、數據預處理、多變量數據分析、標記物識別和途徑分析等步驟。生物樣品(如尿液、血液和培養液等)采集后進行生物反應滅活、預處理。運用核磁共振、質譜或色譜等檢測其中代謝物的種類、含量、狀態及其變化，得到代謝譜或代謝指紋，再使用多變量數據分析方法對獲得的多維復雜數據進行降維和信息挖掘，并研究相關代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規律，以闡述生物體對相應刺激的響應機制、發現生物標記物2。1.2.1生物樣本采集血漿或血清、尿液、糞便提取物、舌苔液、唾液，以及生物組織樣品等各種生物體液，都是代謝組學的生物樣本。王全軍等3研究Z24染毒大鼠血漿的代謝表型改變，及其與組織病理、血液生化指標的相關性，探討代謝組學在藥物毒性早期篩選中的應用。雷榮輝等4運用代謝組學檢測納米銅染毒大鼠的血清代謝成分變化，結合常規血液生化和組織病理學檢查，尋找損害早期的代謝標記物，揭示血液代謝表型變化與納米銅靶器官損害間的關系。王勇等5研究三聚氰胺對兒童尿液代謝的影響，闡明代謝組學能應用于三聚氰胺導致的代謝異常研究，以及三聚氰胺導致腎損傷的無創檢測。1.2.2測定方法完成生物樣本采集后，需要對代謝產物進行測定。縱觀諸多文獻，色譜、質譜（MS）、核磁共振譜（NMR）、紅外光譜、電化學檢測等都被廣泛應用于代謝組學的研究中。其中，色譜-質譜聯用、NMR成為最主要的測定方法。黃強等6概括了色譜-質譜聯用技術在代謝組學中的廣泛應用，分別介紹了氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、毛細管電泳-質譜聯(CE-MS)，以及基于色譜-質譜聯用技術的代謝組學數據處理。危陽洋等7基于核磁共振(NMR)代謝組學方法，研究甲亢患者和健康人群的血清和尿液特征代謝物。1.2.3多變量數據分析方法基于代謝組學得到的海量信息，主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、非線性映射（NLM）、聚類分析（HCA）、人工神經元網絡(ANN)等模式識別技術成為數據分析的主要應用手段。其中，PCA和PLS-DA是代謝組學研究中常用的分析方法。2代謝組學在中醫證候本質研究中的應用中醫證候是一個復雜的生命現象。近年來孕育而生的代謝組學，能整體反映生物體功能水平，還能精細測量代謝產物。融入當前系統生物學的學術內涵對于中醫證候的本質研究將是必然的趨勢。后基因組時代的到來，分子生物學作為現代生命科學的前沿學科，為中醫證候的本質研究提供了新的研究思路和技術平臺。運用代謝組學這一現代最新技術探討中醫證候的本質內涵，為從微觀解讀中醫證候的本質提供了可能，更為中醫證候現代研究開辟嶄新的研究領域。因此，查閱了近10年來的相關文獻，總結了以下代謝組學在中醫證候本質研究中的應用概況。2.1腎陽虛證董飛俠等8選擇慢性腎病期患者60例(腎陽虛者、非腎陽虛者各30例)和體檢健康志愿者30例，運用尿液代謝組學指紋譜方法進行研究。結果觀察到慢性腎病期與正常樣本代謝模式差異非常顯著，建立的預測能力也很強。25個差異代謝物排序后，經過標準品鑒定差異性物質的關鍵代謝成分分別是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯等物質，并且明確變化方向和代謝途徑，能很好區分腎陽虛證與非腎陽虛證的差異性。楊麗萍等9采用代謝組學研究發現腎陽虛模型動物的代謝網絡明顯偏離正常組動物，而用溫陽中藥干預后，模型動物的代謝譜回歸至正常范圍，呈現網絡修復的結果。2.2虛寒證徐斌等10觀察大鼠灌胃給予龍膽水煎劑(RGD)后其尿液代謝譜變化及其與龍膽寒性作用的相關性。測定大鼠尿樣的核磁共振氫譜(1HNMR)數據表明，RGD組與對照組在主成分分析得分圖中呈聚類型分布，兩組間未見重疊。RGD組尿樣中葡萄糖、氨基酸等明顯增加，牛磺酸、氮氧三甲胺等明顯減少。長時間給予較大劑量RGD可使大鼠出現虛寒證體征，給藥后尿液1HNMR譜變化與龍膽寒性作用相關。2.3寒證與熱證汪江山等11采用基于超高效液相色譜-時間飛行質譜(UPLC-Q-TOF)的血漿代謝組學方法，分析類風濕性關節炎(RA)的疾病分型。結果可明顯區分RA的不同病程(穩定期與活動期)和中醫特定證候(寒證與熱證)等疾病亞型。因此，代謝組學在闡明傳統中醫理論，促進中醫與現代醫學的交流上有著廣泛的應用前景。2.4血熱證劉衛紅等12采用核磁共振譜儀技術，分析53例銀屑病血熱證治療前后及31例健康志愿者血漿代謝產物譜的差異。結果顯示銀屑病血熱證患者與健康對照組能被明顯區分，銀屑病血熱證治療前后也能較好分開。涼血解毒湯能調節銀屑病血熱證患者的糖脂類代謝，使其代謝網絡呈現向正常狀態修復的趨勢。所以，代謝組學方法能較全面反映生物體的生理病理及代謝狀態，并可應用于藥效評價研究。2.5肝火亢盛證、痰濕雍盛證及陰虛陽亢證陸益紅等13探討原發性高血壓辨證分型與基于GC/MS血清代謝組學的關系。應用GC/MS測定健康人及原發性高血壓病人血清內源性代謝物，分析他們的代謝譜后表明健康人與高血壓病人血清代謝譜有明顯差異，上述三種證型的高血壓可被清晰區分，高血壓的發展過程也可顯示。可見，基于GC/MS和模式識別的代謝組學技術在揭示傳統中醫理論本質上有著廣泛的應用前景，不失為探尋證候物質基礎的較適宜手段。2.6肝郁脾虛證等14探討慢性束縛應激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿代謝表型改變。經過對慢性束縛應激大鼠血漿1HNMR譜的分析，表明各組大鼠血漿1HNMR代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學分析中找出特異的標志性代謝產物，闡釋中醫肝郁脾虛證候的生物學本質，探討代謝組學在中醫證候學研究中的應用。因此，代謝組學分析是一種有良好發展前景的中醫證候學研究方法。2.7痰瘀證劉衛紅等15探討痰瘀證候的動態演變、時相特點和由痰致瘀在代謝方面的變化。分析高脂血癥模型大鼠血漿1HNMR譜，顯示各組大鼠代謝譜各不相同。隨著造模時間的延長，不同時點模型組大鼠的代謝譜亦各不相同，表明高脂血癥前期以脂質代謝紊亂為特點，隨著病程進展，參與血液凝固過程的乙酰糖蛋白出現，說明凝血機制出現異常，同時酮體及乳酸的升高說明脂質代謝紊亂進一步加重。所以，可能從代謝組學分析中找出痰瘀演變過程特異的標志性代謝產物，以闡釋中醫痰瘀證候的生物學本質。2.8痰阻心脈證、氣陰兩虛證王廣基等16基于GC-TOF/MS代謝組學方法，對痰阻心脈和氣陰兩虛型冠心病患者血漿中小分子化合物進行全面檢測，以探索血漿內源性化合物的差異。結果表明代謝組學方法可區別這兩證型冠心病，還可以與健康組明顯區分。而且，這兩證型間多個內源性代謝物的含量存在明顯差異，并與能量、氨基酸和核苷酸代謝異常相關。可見，代謝組學的整體數據和標志物信息均顯示出痰阻心脈和氣陰兩虛型冠心病的差異，提示代謝組學所研究的體內小分子化合物可能正是中醫分型的物質基礎。2.9氣虛血瘀證李林等17利用核磁共振氫譜方法研究氣虛血瘀證大鼠對比于正常大鼠尿液的組成變化，發現病變大鼠尿液中甲酸、肌氨酸酐、-酮戊二酸、檸檬酸等成分含量發生了變化，為進一步提示氣虛血瘀證的產生機制和病癥治療提供了證據。此外，用GC-MS方法研究慢性心肌缺血屬于氣虛血瘀證的小型豬血漿樣本發現18，脂質代謝物如甘油、醋酸等，肌醇，氨基酸和脯氨酸的代謝水平明顯提高，而葡萄糖、氨基酸和脂質代謝物的含量大幅下降。可見，這個代謝模式可用于臨床診斷和治療慢性心肌缺血，也可為中醫氣虛血瘀證的研究提供新思路。2.10濕證本課題組中醫濕證的代謝研究，如：慢性腎衰中醫濕證的尿液代謝組學研究、慢性胃炎中醫濕證的舌苔液代謝組學研究等都是采用了色譜-質譜聯用方法進行了研究，并得出了相應的代謝產物。基于以上各種代謝組學方法對于中醫證候的本質研究，總結其優缺點如下。核磁共振譜（NMR）和色譜-質譜聯用是中醫證候本質研究的兩種常用方法。核磁共振譜方法，很適合研究代謝產物中的復雜成分，核磁共振氫譜(1HNMR譜)最為常用。NMR法極具實用性，對生物樣品的預處理快速又簡便；可檢測整體動物或人體特定器官細胞內的代謝物組而無損傷性。但其缺點是靈敏度較低。色譜-質譜聯用，如GC-MS、超高效液相色譜-時間飛行質譜(UPLC-Q-TOF)、GC-TOF/MS等都被應用于中醫證候的本質研究。對生物樣本內復雜代謝物中的多種成分進行定性和定量分析，無偏性、高效快速、靈敏度高。不過，每種色譜-質譜聯用技術都有其不足之處。GC-MS預處理過程較繁瑣，衍生化方法復雜，GC分離效率不高；LC-MS缺少譜圖數據庫，難以鑒定化合物的結構；GC-TOF/MS的數據處理甚為復雜，不易靈活運用。3目前存在的問題代謝組學在中醫證候本質研究中的應用廣泛，并取得了一定的研究成果。目前，基于代謝組學技術在中醫證候本質研究方面依然存在一些不足之處。中醫證候本質的代謝組學研究平臺尚不完備。由于代謝組學研究的儀器設備成本較大，研究單位難以有足夠的資金加以引進來研究。中醫證候的臨床研究病例數偏少，代謝組學結果難以與臨床病證相銜接，不能很好進行數據分析。代謝組學研究中醫證候本質的背景資料積累很少，難以建立數學模型。要進行有意義的中醫證候代謝組學研究，必須有大量正常生理狀態的研究基礎作為背景資料，從而運用生物信息學技術解決數學建模。代謝組學研究的影響因素很多，各項中醫證候臨床質量控制標準(如飲食、年齡等)不均衡，不能保證研究結果的可重復性。各種組學數據的不對接，得出的結果會有片面性，不能全面說明中醫證候的本質。4未來展望和思考運用代謝組學研究中醫證候的本質，有著無限發展的空間。完善代謝組學的研究平臺；臨床研究中要進一步擴大樣本量，以加大說服力；注重代謝組學背景資料的積累，為數學建模做鋪墊；盡量控制中醫臨床數據采集的影響因素；綜合分析基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等系統生物學的共同數據，加強多學科交叉融合，降低研究成本強調中醫基礎理論的支撐作用，完善代謝組學的研究技術，避免理論研究與臨床實踐脫節，提高中醫證候研究的可操作性和數據分析的針對性。采用代謝組學相關技術與方法進行中醫證候研究，有望在中醫藥領域取得突破性進展。結合中醫基礎理論和臨床實踐，充分借助現代技術，采用現代語言闡釋中醫獨特的思維方式和治療方法，這是實現中醫證候本質研究的必由之路。相信隨著人力和物力的不斷投入，以及應用范圍的不斷擴大，基于代謝組學的中醫證候本質研究必將在未來實現質的飛躍。代謝組學實質上是采用系統生物學思路進行研究代謝小分子組的一種高通量分析方法，通過比較不同條件下的小分子代謝譜的異同，在醫學上用于診斷、毒理和藥理研究，并且通過對小分子代謝譜的全面定性、定量分析19，可有效找到生物標志物或生物標志模式。運用代謝組學進行中醫證候的本質研究，為中醫證候客觀化研究提供了新的思路和線索，更為中醫藥的現代化和國際化開辟新的方向。隨著當代生物科學技術的飛速發展，中醫證候本質的現代化研究正面臨借鑒新觀念和新技術，尋找合適的切入點，來促進自身發展的機遇。代謝組學將為中醫藥現代化研究提供一種非常有用的技術手段。總之，代謝組學是一門前沿性科學，研究方法多種多樣。中醫證候的本質研究，有無限的挖掘空間。基于代謝組學來研究中醫的諸多證候本質，已初步顯現出了明顯的優勢。雖然目前還存在一些地方需要改進，但隨著現代科學技術的不斷進步，代謝組學勢必將對