流式細胞儀 分析技術及應用,FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。,什么是流式細胞術(FCM)？,特點: 單細胞的流動的 活細胞的 定量的 多參數的 高統計學精度的 分選細胞,第一節 流式細胞儀的分析及分選原理 第二節 數據的顯示與分析 第三節 流式細胞儀分析的技術要求 第四節 流式細胞術在免疫學檢查中應用,一 工作原理： FCM是一種在計算機技術支持下的高度 自動化的細胞顯微熒光脈沖分光光度儀。,第一節 流式細胞儀的分析及分選原理,1、液流系統 樣品流和鞘流 2、光學系統 激光、透鏡組、 光電倍增管等。 3、數據處理系統,(一） 基本組成構,Injector Tip,熒光信號,激光束,Sheath fluid,樣品流和鞘流,1、液流系統,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,Flow cell,激光、透鏡組、光電倍增等。,2、光學系統,（二） 基本工作原理,單細胞流：流動室,單細胞照明：激光,488 nm laser,488 nm laser,單細胞檢測：信號處理,（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信號的強弱與細胞的大小相關 （二）側向散射光（side scatter)：SSC 信號的強弱與細胞內的顆粒多少相關,二 散射光的測定,Forward Angle Light Scatter,細胞對光的散色現象與細胞樣品制備無關.,90 Degree Light Scatter,細胞對光的散色現象與細胞樣品制備無關.,前向散色光FSC,側向散色光SSC,利用前向角和 測向角散射光可 以把外周血白細 胞分成三群，淋 巴細胞、單核 細胞和粒細胞。,散射光的測定,熒光檢測器檢測特定熒光的特定發射波長 （一）光信號測量 線性放大器 對數放大器,三 熒光測量,Ethidium,PE,cis-Parinaric acid,Texas Red,PE-TR Conj.,PI,FITC,Common Laser Lines,DNA,Excitation,Emisson,300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm,（二）熒光補償,利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰 熒光通道的信號加以扣除的技術稱“熒光補償”,（一）分選的基本原理,488 nm laser,-,Charged Plates,Single cells sorted into test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,四 細胞分選原理,陽性選擇,MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分離,陰性選擇,1 、分選速度：幾千個細胞/秒 2 、分選純度:99.5%左右 3 、分選收獲率:90-95% 4 、分選得率,（二）分選的技術要求,分選純度 是指分離后的樣品中該亞群細胞 所占的百分比。 分選收獲率 是指分離后所得的細胞亞群數占原 細胞樣品中該亞群細胞數的百分比。,第二節 數據的顯示和分析,一、參數 前向散射光FS: 反映顆粒的大小 側向散射光SS: 細胞內部結構復雜程度 熒光FL: 細胞被染上熒光部分數量的多少,二、數據的顯示方式,（一） 單參數直方圖,（二） 雙參數顯示,（三） 三參數顯示,以分布直方圖( distribution histogram ) 來顯示，橫軸為該參數測量強度相對值，單位是 道數。強度分布可以是線性的，也可以是對數的。 縱軸一般是細胞數或細胞出現的頻數。,(一) 單參數直方圖的顯示,Single-Parameter Histogram Displays,X軸表示綠熒光信號(CD3)強弱,Y軸則反應細胞的數量.,(二)雙參數數據的顯示 Two-Parameter Data Displays,細胞雙參數測定不僅能提供二個參數各自與細胞 數量的關系，更重要的是獲得了這二個參數之間的相關關系，其中包含了更多的生物學信息。雙參數數據顯示最常用的是二維的散點圖( Dot Plot )。在二維圖上，橫軸代表第一個測量參數，縱軸代表第二個測量參數。,縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量 參數,在圖中每一個點代表一個細胞,1 、點圖,用等高線來表示細胞數，在一條等高線上細胞數相 同，不同的等高線上細胞數不同。,2 、二維等高圖,縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數,Z軸為細胞數。,3 、假三維等高圖,三維坐標勻為參數（散射光或熒光）而非細胞數。,(三) 三參數直方圖,一般利用所得參數的兩兩組合并利用設門（Gate) 技術，來分析參數之間的相互關系。,（四）流式細胞儀的多參數分析,1 、Region設置,2 、 設置,Gate,樣品制備：單細胞懸液 特定熒光染料的選擇：光譜重疊 陰性對照的設置:檢測標本的重復性 質量控制,第三節 流式細胞儀免疫分析的技術要求,細胞碎片 細胞團塊 離心漂洗 固定劑,一、免疫檢測樣品制備,淋巴細胞分離液分離外周血中單個核細胞。 Ficoll,40kd，高密度，低滲透壓，無毒性。 （比重為1.01770.001的分層液).,（一）外周血淋巴細胞樣品的制備,利用紅細胞裂解液去除紅細胞后，得到外周血 中所有白細胞的流式細胞分析的二維散色光點圖,單層培養細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使細胞從培養皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養細胞，可不用酶消化，直接吹打制備 成單細胞懸液。,（二) 培養細胞的樣品制備,機械法：剪碎法、網搓法、研磨法。 酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學試劑處理法：EDTA、EGTA等。 表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。,(三)新鮮實體組織單細胞懸液的制備,機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是較低的細胞產量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網過濾團塊等， 也可利用電子學技術處理的方法排除團塊和碎片 的干擾。 酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成份的不良影響。FCM所測細胞是單個分散狀態；對細胞團塊，細胞碎片盡可能 少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光 染色處理不受影響。,防止細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。 2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但 細胞表面熒光染色分析不受影響。,(四）單細胞懸液的保存,染料的選擇和標記染色保證了熒光信號的產生 （一）免疫熒光標記最常用的熒光染料,熒光染料 激發波長（nm) 發射波長（nm) 顏色,FITC 488 525 深藍色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙紅色 PeCy-5 488 670 紅色 PeCy-7 488 755 深紅色 PI 488 620 橙紅色 APC 633 670 紅色,FITC 488 525 深藍色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙紅色 PeCy-5 488 670 紅色 PeCy-7 488 755 深紅色 PI 488 620 橙紅色 APC 633 670 紅色,二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色,用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在 488nm波長激發光激發后產生的發射波長激發另一熒光 染料產生的熒光信號。,PE,CY5,CY5,488nm,能量傳遞染料：,熒光染料與細胞成分的結合方式： 結構親和方式 嵌入結合方式 共價結合方式 熒光抗體特異性結合方式 1、直接免疫熒光染色 2、間接免疫熒光染色,（二）免疫熒光標記,3、雙或多參數熒光抗體的組合標記,FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色 FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色 FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色 FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色 F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色,熒光染料 激發波長（nm) 發射波長（nm) 顏色,FITC的激發 波長處于自發 熒光的光譜區 內，因此FITC 熒光易受自發 熒光的干擾。,(三) 細胞的自發熒光,（一）單細胞懸液制備的質量控制 （二）細胞懸液免疫熒光染色的質量控制 1、溫度對熒光染色的影響 2、pH對熒光發射強度的影響 3、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對熒光染色的影響 （三）儀器操作技術的質量控制,三、流式細胞免疫學技術的質量控制,1、同型對照：選用相同源性的未標記單抗作為 同型對照（陰性對照） 2、全程質控：在流式檢測中，樣品標記、溶血、 洗滌、儀器質量控制和上機檢測的過程都會直接影 響檢測結果。采用標準質控樣品來進行全程質控， 使得同類實驗室建立質控比對，數據可以互用。,（四）免疫檢測的質量控制,一、淋巴細胞及其亞群的分析 淋巴細胞是機體免疫系 統中的一群重要細胞群， 是參與免疫調節和執行細 胞免疫功能的免疫活性細 胞，T細胞、B細胞和NK 細胞，各自發揮不同的作 用。,第四節 流式細胞在免疫學檢查中的應用,三色標記 淋巴細胞,T、 B、,NK,1、Th 細胞： CD3+ CD4 + CD8- T細胞，能輔助B 細胞分化成熟生 成抗體產生細胞 （槳細胞），參 與促進細胞介導 的免疫應答。,（一）淋巴細胞及其亞群分析,2、Tc細胞： CD3+ CD4 - CD8 +T細胞， 能特異性直接殺傷 靶細胞，所有表達 MHC I類分子的靶 細胞。抗腫瘤免疫， 抗病毒感染，移植 排斥反應和自身免 疫疾病中均起了重 要作用。,B細胞約為5%-10%，標志 為BCR，膜表面免疫球蛋白 （Smlg）。表達CD19、 CD20、CD21、CD22分子。 B細胞也是免疫系統重要 的免疫細胞，主要功能是 介導體液免疫。抗原遞呈 細胞，能攝取、加工和遞 呈抗，同時還能分泌細胞 因子調節免疫應答。,(二）B淋巴細胞及其亞群,自然殺傷細胞（Natural killer cell,NK 細胞）為一 組大顆粒的淋巴細胞，5%-10% 左右，標志CD16、CD56、 CD2、CD11a/CD18。用三色熒光標記將CD3-CD16+CD56+淋巴 細胞定為NK細胞。主要功能是參與細胞免疫，在腫瘤免疫 抗病毒感染中均起重要作用。,（三）NK細胞分析,（一）細胞介導細胞毒性試驗 （二）細胞內細胞因子測定 小分子可溶性蛋白質 T細胞和巨噬細胞 參與細胞免疫、體液免疫、炎癥反應、造血調控、 細胞增殖和分化、損傷修復重要生理和病理過程。,二、淋巴細胞功能分析,流式細胞細胞因子分析圖,流式細胞細胞因子分析圖,三、淋巴造血系統分化抗原 及白血病免疫分型,用多參數 FCM測定白血病免疫表型可以把病人 血液中幼稚的白血病細胞和正常的白細胞區分開。 根據白血病細胞所表達相關細胞的種系抗原，將白血病細胞分為B細胞系(CD19,CD20),T細胞系(CD7,CD3)，髓細胞系(CD13,CD33)以及紅細胞系(glycophorin A)和巨噬細胞系(CD61)。,幼稚白血病細 胞的表型分析,在腫瘤病人使用化療藥物中，會產生藥物的耐受。當