實驗四 DNA片段的序列測定,現代分子生物學大實驗,了解Maxam-Gilbert 化學降解法基本原理 掌握Sanger雙脫氧終止法的原理 學習測定重組質粒中外源DNA片段序列的基本原理和技術方法 學習使用毛細管序列測定儀進行DNA序列測定的方法,實驗目的,實驗原理,DNA電泳 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠 Maxam-Gilbert 化學降解法 Sanger 酶學法（雙脫氧鏈終止法）,Maxam-Gilbert 化學降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的測定方法。 將DNA 片段的 5端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產生一系列長度不一而 5 端被標記的 DNA 片段，這些以特定堿基結尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。,實驗原理,Maxam-Gilbert 化學降解法測序原理,Maxam-Gilbert化學降解法測序的常用化學試劑,實驗原理,多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction) 簡稱PCR技術 體外擴增特異DNA片段 操作簡便，短時間, 數百萬個特異的目的DNA序列的拷貝 PCR反應成分 模板DNA(template) 引物(primer) 脫氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶(Taq) PCR反應步驟 變性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension ）,實驗原理,變性（解鏈） 退火 延伸,DNA模板 引物 Taq酶 單核苷酸（dNTP),在高溫（93-95）下，DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（3765）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸（dNTP)為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。 每一雙鏈的DNA模板，經過一次變性（解鏈）、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。 每一次循環所產生的DNA成為下一次循環的模板，PCR產物得以2n的指數形式迅速擴增，經過2530個循環后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106107倍。,脫氧核糖核酸（dNTPs）,Sanger 雙脫氧鏈終止法 引入了雙脫氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作為鏈終止劑 2,3-ddNTP與普通的dNTP不同之處在于前者的脫氧核糖的3位又少了個羥基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結果使得多核苷酸鏈的延伸終止。 在DNA的合成反應中，除了加入4種正常的dNTP外，再加入一種少量的ddNTP，反應產物是一系列的長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的DNA合成反應中，分別加入4種不同的ddNTP，結果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個A，每一個G，每一個C，每一個T的位置上。對這4組核苷酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。,實驗原理,Dr Fred Sanger, double Nobel laureate and developer of the dideoxy sequencing method, first published in December 1977,化學，1958年：測定胰島素分子的結構 化學，1980年：核酸DNA序列的確定方法,DNA測序,毛細管自動測序儀,測序儀的重大改進 熒光染料代替了放射性核素 聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作自動化 應用計算機軟件對測序結果進行收集和分析，測序之后可以直接從機器上讀出目的片段的序列。 從每次一個樣品（單毛細管）到96個或384個樣品（多組毛細管） 精確、規模、快速,毛細管自動測序儀,同手工測序一樣，DNA聚合酶延伸反應結束后，樣品經簡單變性處理就可以在測序凝膠中開始電泳。 熒光自動測序系統是以種熒光素分別標記種ddNTP，PCR延伸反應后產生的是4組由不同雙脫氧核苷酸終止的DNA片段，這四種熒光染料在激光激發下發出不同波長的熒光，因而每一種熒光代表一種堿基，這使得它們都具有“特征的顏色”。 當不同熒光標記的DNA片段電泳經過檢測窗口時，被激光激發出不同波長的光線，CCD相機記錄結果，可對多個樣品同時檢測。,MegaBACE 毛細管自動測序儀,實驗設備,PCR儀 Megabase毛細管自動測序儀 離心機,Dye Terminator Cycle Sequencing（熒光染料標記末端循環測序） 四種雙脫氧末端都分別用染料標記作為供體染料的熒光素和作為受體染料的四種不同的熒光染料。,實驗設備,測序儀,光源：波長488nm的氬離子激光,雙脫氧末端,熒光素 + 四種不同的熒光染料 （供體染料） (受體染料),實驗試劑,測序反應試劑（DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit） 酶、dNTP、ddNTP混合物 Loading buffer（70% formamide,1 mM EDTA) 測序反應緩沖液 測序膠 無菌水 測序引物：根據T-載體上的引物序列合成 7.5 mol/L NH4AC 無水乙醇 75%乙醇,實驗步驟,測序PCR反應 反應體系 H2O up till 10.0 L 10buffer 0.9 L DNA 200ng-1g primer(5M ) 1.0L 酶、dNTP 、ddNTP混合物 0.4 L 反應條件 95 20sec 50 20sec 60 1min30sec 30個循環,測序PCR反應后處理（純化、濃縮、緩沖液置換） PCR產物中加入1L的4 mol/L NH4AC ，混勻，加入27.5L的無水乙醇，混勻，室溫放置min。 12000rpm，4，離心15 min 。 棄上清，70%乙醇洗一次，12000rpm，4，離心5 min 。 棄上清，室溫干燥30 min 。 加入10L Loading buffer，充分混勻，即可進行序列測定。,實驗步驟,實驗步驟,按照操作手冊，利用毛細管自動測序儀進行序列的測定 開氮氣罐，打開測序儀，打開電腦。 設定參數。 沖洗毛細管。 灌膠，預電泳。 上樣，電泳。 電泳后處理分析數據。 沖洗毛細管，關機。,注意事項,準確估計PCR反應過程中質粒模板的濃度，濃度過低，測序信號弱，得不到好的測序結果；濃度過高，引物峰出現晚，影響測定的序列長度。 PCR反應后的處理過程應小心，不要丟棄沉淀。 NH4AC的加入是助沉作用，與PCR反應產物混勻后再加入室溫的無水乙醇，室溫放置片刻等PCR反應產物完全沉淀后再離心。 使用測序