第一章 體外試驗與生物新技術 在毒理學中的應用第一節 體外試驗 毒性試驗的目的在于獲取一定的數據，為社會需要的外源化學物的安全使用做出判斷。過去利用整體實驗動物模型或稱體內試驗(in vivo test)模型所提供的資料，判斷外源化學物及其制品和混合物等對人類健康是否具有損害作用。體外試驗模型(in vitro test)在上述過程中也起著重要的作用，尤其是機理研究方面。但是，在毒理學研究中整體試驗研究的觀點仍占主導地位。目前，此種觀點已發生變化，因為：全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進入人類的環境。而且在現有的化合物中，還有相當數量沒有進行必要的毒理學評價。在此種情況下，利用經典的整體動物試驗取得完整的毒理學資料極為困難。解決此種問題的重要方向是體外試驗。現有的整體動物毒性試驗方法需消耗大量的時間和昂貴的經費，而體外試驗則可節省時間和經費。動物保護主義運動的興起，要求盡量減少動物的使用，而且應當盡量減少痛苦地處理動物。更重要的是由于生物技術的巨大進步，不僅表現在細胞組織及器官培養領域，而且在生物分子技術方面，也為毒性試驗和研究提供了新的方法和工具。所以體外試驗在毒理學研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導地位的趨勢。但也需指出，體外試驗的發展，并不排斥體內試驗本身的重要性，兩者必須相互補充、相互驗證才能為毒理學研究提供堅實的科學基礎。 一、概述 (一) 分類 毒性試驗的目的是提供一些適當的資料，以便確定有關化學物的毒理學性質。在有些情況下，是要決定一種化學物在所預期的條件下使用是否安全，如新藥物開發即需要這一評價。在有些情況下，例如新工業品或日用化學品的開發，必須決定一種新化學物的接觸安全限量。了解體外毒性試驗在上述毒理學決策過程中有何意義，對于評價體外毒性試驗在毒理學中的地位極有幫助。可依據體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：篩選試驗。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進行更權威的試驗，無論是整體還是體外試驗。附加試驗。它可為協作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。替代試驗。它是在大量實驗的基礎上，使體外毒性試驗能替代整體動物試驗，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學效應均是毒物和或反應活性代謝產物在敏感性細胞上或敏感細胞內某一分子靶部位作用的結果。如將敏感細胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學物對其的影響，即將毒理學中毒物中毒的啟動階段，在體外條件下，觀察其對外源化合物的反應和外源化學物對它的作用。基于上述原理，體外試驗模型取材范圍很寬，可取哺乳動物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細胞培養、亞細胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。 (三) 體外試驗的優缺點 體外毒性試驗的優點可歸納在表121。表12-1 體外毒性試驗系統的優點能控制環境因素可排除相互作用的系統如免疫系統、神經內分泌系統的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等試驗間的誤差較少可同時和或反復多次取樣可做成復雜的互相作用的試驗系統，如復合細胞培養等較為快速和經濟需要較小量的受試化合物產生較小量的有毒廢物可以利用人體細胞減少整體動物的使用 其中特別值得一提的優點是體外試驗的簡便和易于利用人體細胞。體外毒性試驗結果可迅速得出，將減少了解新化學物毒理學資料所需的時間，最終可以縮短從新化學物的合成到產品進人市場的時間過程。此外，對鑒定毒理學資料有問題的新化學物，可及時終止開發，減少由資源到產品的投入。在毒理學整體試驗中禁止直接進行人體試驗。但毒理學試驗的目的是關心人類健康，目前主要是將動物試驗結果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。在體外試驗中，利用人體細胞組織進行試驗，可較好地解決物種差異的問題。 體外毒性試驗系統的利用在目前尚有不足之處：體外到體內外推的問題。體外試驗是依據毒性作用的始發階段及繼續發生的分子與細胞反應，其與整體系統有差異，如何將產生體外毒性的體外濃度與相應體內劑量聯系的問題是最終未解決的難題。它需要更好的工具預測性毒物代謝動力學來解決，其關鍵在于發展有生理學基礎的毒物代謝動力學模型。另一方面，體外毒性試驗中缺乏毒理學反應的調控因素，如細胞與組織的修復過程和免疫系統的不同類型細胞間的相互影響等。假如有了更全面的毒理學過程的基礎知識，可設計更符合整體動物模型的體外系統。但現階段毒理學作為一個學科的發展尚缺少許多重要的資料。體外毒性試驗難以預測慢性毒性。因為，慢性毒性病理過程的機理所知甚少，缺乏發展體外試驗的理論依據，再者，某些體外系統仍難以達到長期維持生理狀態的要求。 二、體外試驗系統 (一) 臟器灌流 1. 肝臟灌流 是毒理學中研究外源化合物對肝臟損傷及代謝的常見方法。在灌流液中加入外源化學物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。一般是以下腔靜脈和門靜脈為插管灌流通路，為此應結扎肝動脈、上腔靜脈，在恒溫條件下灌流。有報道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氫取代衍生物三氯甲烷與二氯甲烷對肝臟毒性，結果發現隨著灌流時間延長(在4h之內)，灌流液的上清液中K+、谷丙轉氨酶(SCPT)、山梨醇脫氫酶(SDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)增加，說明三種化合物對肝細胞均有損傷，而以四氯化碳為最，且依氯原子被氫取代肝毒減低。需指出肝灌流時間不能過久，以4h之內為宜，否則肝細胞的功能與生存不能維持。 2. 腸灌流 利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動力學過程。如用大鼠，則在麻醉下切腹分離一段小腸，在保持原有血液循環體系下，將腸兩端插管，清洗凈腸中內容物，在恒溫環境中灌入灌流液。例如有人研究鋅的吸收及其影響因素，以大鼠回腸段為標本，證實鋅吸收呈二室模型(腸腔為室、腸粘膜為室)，苯丙氨酸能增加腸腔與腸粘膜之間鋅的交換，且加速向血流的清除過程。 3. 膈肌-膈神經標本 取完整的大鼠膈肌-膈神經置于恒溫灌流液中，在幾小時之內可維持基本正常的神經肌肉傳導。這種標本可用在研究神經毒物對神經傳導功能的損傷及強度。 (二) 臟器切片 肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。例如，腦片和心肌條等是將組織片置于恒溫的孵育液中進行有關試驗研究，但需注意切片中的細胞需保持完好的細胞基質和細胞之間的交流。切片厚度一般在250m。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP-450不應超過8h，腦切片一般在6h左右。此系統的優點是保持了細胞之間的結構，其操作也比臟器灌流容易。不足之處是切片內的細胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達細胞內。 (三) 原代細胞培養 1. 肝細胞原代培養 肝細胞尚未建成傳代的細胞株系，多用原代培養。肝細胞原代培養期間細胞不分裂、不增殖，但發現基因轉錄是存在的(培養初期24h在1或以上)。細胞原代培養維持生存期12周，但是CytP-450卻在2428h活性減少50左右。據報道人肝細胞中CytP-450活性穩定性比大鼠強。 利用原代培養的肝細胞可以進行多種毒理學研究。如研究化學物的肝臟毒性，一般認為，用原代肝細胞培養篩檢與鑒定是否化學物具有肝臟毒性較為可靠，與體內試驗相符合。有報道以肝細胞損傷后某些酶釋放為指征，研究30個化學物，結果除少數化學物在肝細胞培養中表現毒性比體內試驗低之外，多數化學物內外毒性符合一致。在體外試驗表現毒性較低的化學物有環已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和長春新堿(vincristine)等。 2. 巨噬細胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細胞，甚至人也可通過肺灌洗得到。巨噬細胞可以用于多種體外試驗，例如利用巨噬細胞的免疫功能檢測外源化學物的免疫毒性，又如利用巨噬細胞檢測以肺臟為毒理學終點的外源化學物的中毒毒性和機理。關于后者，有人利用豚鼠肺巨噬細胞原代培養純化后，研究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的機理。 3. 淋巴細胞 多用小動脈脾臟分離淋巴細胞或進一步分離T、B淋巴細胞進行免疫毒理研究。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細胞轉化和抑制白細胞介素-2的產生，且在一定條件下使淋巴細胞內游離鈣濃度增加及鈣調素(CaM)活性降低，此為鎘的免疫毒性機理研究提供了線索。 4. 腦細胞 分離的新鮮腦細胞有助于研究外源化學物對神經系統損傷的評價與探討其機理如用小鼠大腦皮質分離、溫育后，研究二價陽離子鈣、鎂、鋅、鎘等對皮層神經細胞的損傷，發現這些離子隨著濃度的增加，腦神經細胞的電泳遷移率逐漸減慢。 隨著腦細胞技術的發展，還可在溫育體系中存在外源化學物情況下，用微電極插入腦細胞，通過電信號的變化，更深入地研究外源化學物對神經細胞的功能損傷。 5. 心肌細胞 心肌細胞用于毒理學研究的報道目前還較少。用新生12日齡大鼠心室肌分離心肌細胞，原代培養4天后，將微電極(直徑0.5um)插入細胞內，研究鎘對心肌的影響。經記錄、分析各心肌細胞動作電位參數，結果鎘在520molL濃度下，可使心肌細胞動作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對心肌有直接的毒性效應。 此外，將分離的心肌細胞于培養的2448h期間，利用膜片鉗的連細胞電壓鉗法，描記心肌細胞上的B型、L型及T型3種Ca2通道的單通道活動。當在培養液中加入10molL氯化鎘之后，B型通道開放時間縮短13、關閉時間延長45.1、通道開放概率下降55，L型通道開放時間縮短40.7、關閉時間延長23.1、通道開放概率下降50，而對T型通道無影響。進一步證實鎘對心肌有毒性效應。 (四) 細胞培養 有些臟器細胞建立了傳代培養技術，建成有穩定遺傳特征的細胞株系。有的利用細胞培養技術建立了特殊的試驗方法。 1. 腎細胞 由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經建立了幾種腎近曲管細胞株系用于毒理學研究。例如1926年Hull等人選育傳代培養的LLC-PK1細胞是來源于Hampshire豬。據報道此株系細胞的各種生物學特征已進行了相當深入的研究(包括激素應答反應、物質轉運特征、細胞的代謝功能和標志等)。此后又建立了從鼬(opossum)獲得的OK株系、從兔獲得的RC-SVI株系。 近年國內利用300次傳代培養的LLCPKl細胞系對鉛的腎毒進行了研究，包括鉛對細胞的損傷、對細胞膜脂流動性的影響、對細胞膜相變溫度的影響、脂質過氧化效應、胞內鈣濃度變化及形態學改變等，這對鉛的腎臟毒性機理提供了依據。 2. 胚胎細胞 利用胚胎細胞體外培養，篩檢和研究外源化學物的毒性效應。例如我國用人胚肺纖維母細胞傳代培養人胚肺二倍體細胞，已建立了以2BS為代表的株系。此株系在用于篩檢致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍體細胞在10-710-8molL苯并(a)芘長達2838代傳代培養下，電鏡鏡檢發現細胞核外形不規則、核膜深陷、出現細橋(tiny bridge)伴分葉核形成、核內胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細胞癌變特征。 此外，人胚主動脈平滑肌細胞也可作為標本傳代培養研究金屬的毒理。 近十年來，毒理學相繼引入嚙齒類動物的著床前全胚胎培養技術(pre-implantatation whole embryo culture)、著床后全胚胎培養技術(post-implantation whole embryo culture)，以及器官培養如腭板培養、胚胎枝芽體外培養等篩檢致畸化學物均取得一些成果。 (五) 組織勻漿 取臟器除血污制備組織勻漿，是用物理學方法使細胞壁破壞，細胞組成成分與細胞間質混合形成混懸液。利用勻漿為標本主要是研究外源化學物對細胞酶系統的毒理作用。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結締組織或肌細胞不易破碎影響勻漿的質量。 文獻中有機磷化合物對神經系統Ache抑制的強度及特征，大量工作是通過以腦勻漿為標本，主要是以哺乳動物、嚙齒類和昆蟲的腦完成的。不少外源化學物的代謝和以肝臟為靶器官的外源化學物的毒性效應特征與機理是通過肝勻漿進行的。現雖然不少工作已為其它技術所取代，但是應用勻漿作為過篩與初步研究還是有用的，主要因其制備方法簡單、制備周期很短，且不需復雜的設備。 (六) 亞細胞組分 將細胞中各亞細胞組分分離和純化，對于深入研究外源化學物的靶位點、探討化學物毒性效應的機理均十分重要。它較組織勻漿優越，排除了勻漿中其它因素的影響。現代毒理學中使用最多的亞細胞組分是細胞膜、微粒體及線粒體。 1. 細胞膜 人與動物紅細胞分離后低滲溶血，高速低溫離心可制得紅細胞膜(或稱血影，ghost)。血影為常用的細胞膜標本。此外肺巨噬細胞、肺細胞、突觸小體等均可制備膜標本(先將細胞勻漿破膜，低溫差速離心、梯度離心制備)。使用細胞膜可以進行很多的毒理試驗，尤其是在探討化學物中毒機理方面。 以紅細胞膜為例，用人工細胞為標本與0.1mmolL鉛作用僅5min，紅細胞膜遠紫外色譜就出現改變，表明膜蛋白的構象發生了變化。 神經末梢斷裂脫落的突觸體(synaptosome)具有類似完整細胞的功能，除可利用突觸體作為標本外，還可進一步制備突觸體膜(synaptosome membrane)。實驗表明對硫磷在510-9molL水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動性下降。 近年來為純化實驗條件，以利于從分子水平研究外源化學物的毒效應機理，已將人工膜引入毒理學研究。所謂人工膜，即是以正常細胞膜的膜脂組分，人工合成后用之在定介質中形成人工膜。 2. 微粒體(microsome) 尤其是肝細胞制備的微粒體常作為毒理學研究的標本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細胞內質網，即肝細胞的亞細胞組分分離后的微粒體中。 有報道TNT在無氧而加人NADPH環境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測出硝基陰離子自由基(Ar-NO2)；而在有氧環境中能迅速與分子氧反應生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。 3. 線粒體(mitochondria) 它是細胞中進行呼吸作用的主要場所。據報道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗中，對線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。又據報道鎘對大鼠肝細胞線粒體Ca2+-ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動性下降。 (七) 酶 外源化學物對機體的毒性效應，往往表現某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標志酶活性的變化反映化學物所損傷的靶器官。 在體外毒理學中則主要是定量研究外源化學物對靶酶作用的特征、性質和機理。此類研究的基礎工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對純化酶作用的體征、性質和機理進行研究，如細胞色素P-450重組系統。由于酶的提純技術復雜，故而在一般毒理學研究中多用臟器勻漿和亞細胞組分作為酶源。雖然這些酶源標本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結果。 有報道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對一些鈣調素依賴酶就具有雙向效應，即在低濃度時可以激活這些酶，而高濃度時又可抑制酶的活性。 文獻中早已證明有機磷化合物的主要靶酶是AChE。經酶動力學分析，有機磷化合物與AChE底物ACh呈競爭性；即有機磷化合物對AChE為競爭性的不可逆性抑制物。但是不同結構的有機磷化合物對AChE的親合力可有很大差別。 第二節 哺乳動物細胞制備和培養 一、概述 到目前為止，分離的細胞是毒理學中使用最廣泛和最深入的體外實驗系統。體外系統分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養細胞、細胞株、細胞系及復合培養的細胞。在毒理學中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實驗中使用動物數量的壓力；二是非整體動物實驗可顯著地減少常規整體動物實驗所需的高額費用；三是人們越來越不滿意實驗動物與人體結果之間相關性的缺乏。利用細胞，可更嚴格控制實驗條件，有效地研究毒性作用的生化機理。表12-2詳細列出細胞在毒理學中應用的優缺點。 表12-2 體外系統細胞在毒理學中應用的優、缺點 優點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細胞族的性狀 直接控制胞外基質、化學物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經系統或免疫系統的影響 可從同一實驗體系重復取樣 缺點 缺少整個器官的形態學觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調節影響因素如激素，神經系統或免疫系統， 一般為靜態系統，將導致營養物質的逐漸減少和代謝終產物的逐漸累積。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大表12-3 毒理學研究中常用細胞各種物種的成纖維細胞淋巴母細胞腹水瘤細胞淋巴細胞角質細胞肝 細 胞肝癌細胞腎臟髓質和皮質細胞肺的各種類型細胞培養的背根膠質細胞培養的睪丸細胞膀胱細胞心臟細胞脊髓微血管細胞脂肪細胞 由于哺乳細胞作為體外實驗系統的優越性，在毒理學中，已有許多不同類型細胞應用于毒理學實驗。表12-3為毒理學實驗中常用的細胞類型，其中有些細胞可來源于人體組織。利用哺乳動物細胞進行毒理學體外實驗有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細胞株，用以觀察受試物對整體細胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細胞，無論是原代培養或是特定的細胞株，研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用； 二、基本技術（一） 儀器與設備 1. 培養箱 一般來說，在5CO2，95空氣和99的相對濕度的條件下，許多細胞可存活。故細胞培養的關鍵設備是CO2培養箱。其基本要求：精確地溫度控制調節，一般在土0.5，箱內溫度的均衡可依賴風扇；CO2濃度調節，利用CO2傳感器監測箱內CO2濃度；使箱內大氣為5CO2，95空氣；箱內濕度，可用水盤來維持。有的細胞培養可以不控制CO2分壓。例如，原代肝細胞培養，可用LeibovitzL-5介質，不需CO2，而要求敞開培養瓶，以供給較高的O2分壓。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4)用于存放培養介質，冷柜(20)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養介質如谷氨酸和血清。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養中的細胞，以便依據細胞生長狀況，進行調整或對污染進行補救或處理。進行進一步的研究，則需要更高級的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺 在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風機，驅動空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩通過工作臺面，使工作部位構成無菌環境。它具有占地面積小，操作方便等優點，但它尚難絕對除去病毒類微生物，而且灰塵過多對凈化作用不利，故超凈工作臺最好安置在清潔無塵的房間。 5. 清洗和消毒設置：培養中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160以上，最好使用較大規格的干燥箱，如650500500mm。 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 6. 培養器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細胞生長的優點。主要的塑料瓶皿有；多孔培養板，其規格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；培養皿，規格有直徑30mm、60mm及l00mm，與玻璃培養皿相同，尤其有利于集落形成和細胞轉化等試驗；培養瓶，帶有螺旋蓋塞，規格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養箱中使用；其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規格有20010001和1l100l二種。 玻璃器皿在實驗室仍不能完全被塑料制品取代，除培養皿和培養瓶外，主要還有：吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規格有l0ml，5ml和lml；玻璃瓶，用于配制各種培養液的儲貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規格有500ml、250ml和l00ml； 離心管，規格有50ml、l0ml和5ml，用于細胞洗滌。 7. 液氮貯存器 貯存細胞多用液氮，液氮溫度在-196，具有經濟、省力和能較好保持細胞生物學特性的優點。液氮貯存器有25L和50L兩種規格，它與液氮運輸瓶，或稱杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每兩周需補充一次液氮。如有需要可配置貯存器和運輸瓶。 8. 水純化裝置 細胞培養對水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養液。對玻璃器皿也應用純水清洗。但是，在細胞培養中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。 實驗室應配備自動加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優點。外購蒸餾水或去離子，應在本實驗室重蒸后使用。對水質量應經常檢測，如pH和電導系數。同一實驗盡量使用同一水源，避免水質量造成結果的差異。 9. 濾過消毒裝置 培養介質不能經高壓蒸汽消毒，而需通過孔徑為0.22l的濾膜過濾消毒。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。10. 一般設備 離心機，用于對細胞懸液離心處理，以達到細胞洗滌、調節細胞濃度等。 天平，包括普通臺秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養液、酶消化液及生理鹽水等。 酸度計，用于準確調整各種介質及生理鹽水的pH。 電磁攪拌器，微量加樣器等。 (二) 培養用液 指細胞培養中所使用的溶液，如培養液、消化液、pH調整液、染液及細胞洗滌液等。培養液的選擇取決于細胞生長的要求，故它是維持細胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應細胞體外培養的各種溶液。 培養液在制備過程中應嚴格操作，避免混入雜質。應特別注意下列問題：容器，應仔細認真清洗，必要時須消毒；水，三次重蒸蒸餾水；嚴格選擇品質優良的藥品；制備好的培養介質要標明名稱、配制日期及配制者；貯存與消毒。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細胞生存所需的能量和無機鹽的成分。它是配制各種培養介質的基礎溶液，也是洗滌細胞的溶液。 2. 小牛血清 是細胞培養中最常見的天然培養基，它具有豐富的營養物質，對細胞附著和保護也有明顯的作用。但它有成分較為復雜、個體差異較大、來源也有一定的限制等不足。彌補個體差異的辦法是對血清進行無菌檢測和支持生長能力測定后，混合使用。天然培養基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 3. 合成培養基 系依據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成的。如最簡單的MEMEagle培養液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。 如進行無血清培養，除上述營養成分外，還應加入纖維連結素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進細胞貼壁。有時，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。 4. 消化液 進行傳代細胞培養時，為了使細胞脫離生長表面和細胞離散成單個細胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25或0.125)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)溶液(0.02)。 5. 其它 pH調整液，為了營養成分穩定和延長貯存時間，配制生理鹽溶液，和培養液時，均在臨用前加入NaHCO3溶液。常用濃度有3.7、5.6和7.4%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為1015mmolL。 染色液：常用的有蘇木精-伊紅染色液或稱H.E染色；Giemsa染色液。 固定液：常用的有中性緩沖福爾馬林，相當于10的福爾馬林；Bouin氏固定液；醋酸甲醇，臨用前配制，結合Giemsa染色效果較好；FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80酒精組成，用于蓋片單層培養的固定。 (三) 消毒技術 在細胞培養中，消毒是最基本的一項工作，它直接影響實驗的結果。消毒措施應在細胞培養的每個環節嚴格執行。細胞培養的微生物污染，包括細菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環境；培養液及培養器皿的滅菌不徹底或存放時間過久等。 對不同的細胞培養所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學滅菌法，即利用化學消毒劑。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養板等，使用方便，效果較好。應注意其可產生臭氧，影響健康。 2. 高壓蒸氣消毒 它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養液。一般要求15磅壓力下20min。或者更簡單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應到160，保持90-120min。 4. 濾過消毒 適于大多數培養用液。選擇孔徑為0.22m的微孔濾膜，過濾除菌效果較佳。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70酒精。 三、培養細胞的鑒定 對培養細胞的鑒定有兩個目的：一是觀察培養有無變化，以決定是否終止培養，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養細胞；二是培養條件(如培養液)變化，對培養細胞的影響。因為培養條件的一致性，對于實驗結果的可信性有極為重要的影響。對于培養細胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標及細胞性質(如細胞形態、生長特性、染色體數目及結構等)。 (一) 污染鑒定 細胞培養中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學物和非同一種細胞的污染。受到污染的細胞培養可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。污染常常表現為pH變化，培養液表面起泡或起膜，培養液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。 1. 鑒定方法 真菌或細菌的污染可用肉眼或低倍光學顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無法發現支原體的污染，在細胞培養過程中應經常定期檢查，例如每三個月。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。 2. 處理 基本的良好消毒技術并不一定能防止污染，還應注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護罩的消毒效果；經常檢查培養器皿；每個工作者有自己配制的培養用液，處理受污染的培養用具和環境。對于已污染或懷疑污染的培養用具均可用2.5高氯酸處理。用抗生素對預防或去除細菌污染較為有效。對支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動物體內接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養。 (二) 生存指標 1. 臺盼藍排斥試驗 是判定細胞損傷的快速試驗，它還可很方便進行細胞計數。具體方法如下： 取少量細胞混懸液，加人等量的0.5臺盼藍溶液。 放置1-5min后，將混合液滴入血細胞計數池內。 顯微鏡下，細胞顯藍色的為死亡細胞，尤其是核深染，而未染的細胞為存活細胞。統計出細胞總數后，可計算出細胞存活率。 2. 酶漏出的檢測 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測也與染料排斥試驗有同樣的靈敏度，同時，可更精確地進行定量，但操作時間較長。 (1) 儀器：分光光度計，最好配有溫育(37)的裝置。 (2) 試劑： 溶液 0.9NaCl，0.1TritorX-100和0.1牛血清白蛋白。 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和31.0mg丙酮酸鈉溶于450ml的蒸餾水。配好后，可貯存于-20的冰箱內。 NADH，稱42mg，溶于4.5ml的1NaHCO3，臨用前配制。 (3) 操作步驟：離心，以適當速度使所有細胞沉淀而不引起細胞損傷。例如肝細胞用50g2min。取出上清，放人干凈試管，并保持0以下備用，加入等量的溶液至細胞沉淀，用漩渦混合器混合。保持在0以下，備用。 取一比色杯，加3ml底物，50l的NADH和25200l的樣品(取決于培養細胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進行比色。整個過程應在37條件下完成。計算上清或沉淀(即溶液中細胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。 3. 其它方法 鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內，而死亡細胞則釋放51Cr3+。用r-計數器檢測無細胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養細胞的存活情況。還有貼壁效率和ATP含量等指標可鑒定培養細胞的存活情況。 (三) 細胞特性鑒定 在連續培養期間，細胞可能發生某些變化，如細胞與原始細胞的差異逐漸加大。但每一細胞株具有一系列細胞特性“正常”的參數，可供鑒定評價。例如，形態學參數、生長特性及染色體分析等皆為細胞特性鑒定的指標，其中形態學與生長特性的測定相對容易進行。 1. 形態學檢查 評價細胞正常與否的最簡單方法是形態學檢查；應在每次傳代時用倒置顯微鏡進行觀察，最好拍照記錄細胞的形態。要詳細地描述每一細胞系的形態。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細胞，即可描述所觀察的細胞。成纖維樣細胞系指在單層細胞培養時，細胞的長度要大于其寬度的兩倍的細胞，而上皮樣細胞系指呈多角形的細胞。 2. 生長特性的檢查 在培養細胞時，其生長特性的檢查較易進行，主要通過測定更換培養液的時間和傳代的時間來完成。雖然不同的細胞其傳代時間和更換培養液的時間不同，但對于每一細胞系應該較為固定，因為主要取決于細胞生長速率。 每個細胞系均有其自己的生長循環周期，這取決于接種進行培養的細胞數目。一般認為，在培養中的細胞，是處于不同的生長階段。進行生長分析，應觀察單個細胞的生長速率。在實際工作中，是測定克隆效率或者接種效率。克隆效率是測定由單個細胞生長的克隆。接種效率是測定植入小量細胞(250個cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時，經用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml25cm2)和清水沖洗后，計算克隆數。接種效率= 一般認為，傳代效率小于30表示生長不正常。此項指標可用于正常細胞生長的監測，貯存細胞的復蘇及鑒定每一批血清等。 在細胞培養試驗中，一般監測指標可采用形態學、生長模式及接種效率即可。 3. 其它檢查 除上述指標外，在細胞培養時，可進行染色體分析，包括染色體的數目和結構以及DNA、RNA和蛋白質的含量測定，來判斷培養細胞的特性。 七、細胞培養在食品毒理學中應用 利用培養的細胞，可進行多方面的毒理學研究，如表12-4中所列。表12-4 培養細胞用于毒理學體外實驗的實例 一般毒性：主要為急性細胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細胞類型如肝細胞、腎近曲小管細胞、神經細胞及心肌細胞等： 毒作用機理 生物轉化、毒性代謝產物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性 以下重點討論毒理學中應用細胞培養技術時應注意的幾個問題。 1. 細胞類型的選擇 細胞類型的選擇取決于實驗的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應選擇生長迅速且易于處理的細胞系。機理研究多不用細胞系，因為培養的細胞會逐漸喪失許多功能，如細胞色素P-450的活性。 細胞培養的優點之一是可選擇來源于人體的組織細胞，可減少試驗結果的物種差異。成纖維樣細胞和上皮樣細胞均可選用。常用的細胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。 2. 代謝活化 細胞經8-24h培養后，細胞色素P-450活性將迅速下降。而在CHO細胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養細胞對需代謝活化的化學物不能夠敏感。 解決這個問題有兩個方法，一是加S9，二是與原代肝細胞復合培養。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養液中應加有NADPH生成系統(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。與原代肝細胞進行復合培養時也可采用其它不同的細胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細胞和人成纖維細胞。 3. 受試物的給予許多 受試物由于水溶性較低，在加入培養液前，常需溶于有機溶劑有機溶劑對細胞有損害作用，故應限制有機溶劑濃度在1以下。在試驗中可設立適當的有機溶劑對照和培養液對照。例如，需用S9混合液；有機溶劑的濃度應限制在0.1，因為許多有機溶劑可抑制酶的活性。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養液時仍存在問題。一般是混懸于培養液或者先溶于溶劑，再加人培養液，但有時會產生不同的毒性結果。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時將有某些塑料培養皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 設立陽性對照組 實驗系統的重現性應該用陽性對照物來檢查。陽性對照物指采用經過研究或公認有特定作用的化學物。例如在代謝活化研究中常選擇環磷酰胺為陽性對照物，在細胞毒性篩檢時可選二甲基環己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對照物。 5. 毒性指標的選擇 依據不同的試驗目的和試驗條件，可選擇不同的觀察指標。下列指標在毒理學中經常采用： (1) IC50：即經3天培養后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細胞毒性的常規篩檢。此外，前述評價細胞特性的指標，如形態學和接種效率等，均可采用。 (2) 細胞膜損傷：可選擇臺盼藍攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標來評價細胞膜的損傷。 (3) 大分子物質合成與降解的改變：可選用14C亮氨酸蛋白試驗和3H尿嘧啶參入RNA試驗等指標，以判斷受試物對培養細胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADPNADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標外，還有毒物代謝酶的活性、細胞膜脂質過氧化作用及14C-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細胞的代謝能力。 (5) 形態學觀察：通過光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對培養細胞的形態改變情況。 第三節 亞細胞組分制備及其檢測方法 細胞由許多亞細胞組分組成，如核、線粒體、內質網膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們在維持細胞正常生理功能方面起著重要的作用。故許多外源化學物引起機體的損害作用，有可能與亞細胞組分的結構與功能損傷有關。在毒理學中，亞細胞組分作為遺傳毒性測定中的代謝活化系統，如S9已普遍運用。此外，亞細胞組分主要用于中毒機理的分子水平研究，因它們是從整體細胞上在自然環境下分離出來的，使毒理學家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學物在毒作用部位的作用機理。但它離開子整體細胞，也有其局限性；即它僅提供有關一些特殊作用能力的特定信息。對外源化學物毒作用機理研究，還應結合其它研究如整體試驗、細胞試驗等，綜合作出評價。現就微粒體和線粒體的制備及其檢測方法加以介紹。 一、基本技術 (一) 設備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。它是利用兩者的間隙將細胞破碎，其間隙一般在0.150.25nm。杵是由馬達傳動，其速度在2000rpm以內，且可調節。它較適合肝細胞、腎細胞及腦細胞的破碎，而對肺、甲狀腺等結締組織較多的組織效果不佳。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實驗需要加以選擇。使用本法破碎細胞應注意：在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實驗結果；馬達速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；勻漿上下次數，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細胞勻漿上下810次即可達到破碎目的。 2. 離心機 是亞細胞組分制備的關鍵設備，一般需要低溫高速離心機，最大轉速為18 00024000rpm，和超速離心機，最大轉速為5000075000rpm。離心機應配備各種類型的轉頭，以供亞細胞組分制備時差速離心選用。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。 (二) 勻漿介質和緩沖液 最常用的勻漿介質為等滲的蔗糖(0.25molL)和氯化鉀(0.154molL)。蔗糖為經典亞細胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測定的干擾。勻漿介質在使用前應將pH調至7.4左右。勻漿緩沖液可含有550mmolL的Tris或Hepes。 大多數研究中常用的勻漿緩沖液為含0.154molL KCl的50mmolL TrisHCI緩沖液，pH7.4。此緩沖液在4條件下，至少貯存12周不變質。 (三) 生物樣品 實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。對于大實驗動物，如狗等，應在適當的麻醉條件下，放血處死。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質中。為了減少實驗誤差，應參考動物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養環境等因素。此外，為避免晝夜節律影響，每次實驗應在相同時間處死動物。為避免肝糖原影響，大鼠應禁食過夜。 (四) 微粒體酶的誘導方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導劑之一。其方法是以小鼠80mg(kgd)，大鼠100mg(kgd)，經腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續35天即可誘導細胞色素P-450的活力。還可以將藥溶于飲水，1ngml，大約7天后，可達到誘導效果。主要誘導細胞色素P-450。 2. p-萘黃酮(-naphthoflavone) 它是多環芳烴類的誘導物，可誘導細胞色素P448，同類誘導物還有3-甲基膽葸(3-methylcholanthrene)。-萘黃酮的使用方法是小鼠40mg(kgd)，大鼠80mg(kgd)，經腹腔注射，連續34天，即可達到誘導作用。主要誘導細胞色素P448。 3. 多氯聯苯 常用多氯聯苯誘導物是Arochlorl254，它是混合型的誘導物，即同時誘導細胞色素P-450和細胞色素P-448，劑量依多氯聯苯種類不同而異，需做預試驗來確定。 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內質網在細胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨立的細胞器。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學中較常用的體外系統。 (一) 肝微粒體制備 1. 以斷頭方法處死動物，迅速取出肝臟，用預冷生理鹽水或勻漿介質洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。 2. 將肝轉入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當勻漿介質，一般為3mlg肝臟。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。 3. 按示意圖操作離心。 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質時，離心管上層漂浮有脂質層，應用吸管將其除去，再收集上清液。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。沉淀即微粒體，懸浮于10mmolL HepesHCl緩沖液，pH7.6，內含0.154molL KCl，l mmolLEDTA和20甘油，貯存于-2070或是液氮中。應強調的是貯存方式和時間對微粒體酶的活性或特征會有不同程度的影響。 4. 其它方法 除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點沉淀法也可以制得微粒體。凝膠過濾法不適于做多個樣品。鈣沉淀法適于沒有超速離心機的實驗室使用。其方法是在去線粒體的上清