,第6課時 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數,專題2 微生物的培養與應用,學習導航 1.通過分析具體培養基的配方，歸納選擇培養基的選擇作用，理解篩 選微生物的原理。 2.結合實驗設計，分析微生物數量測定實驗中產生偏差的原因及解決 措施，學會微生物的計數方法，并對培養結果進行分析和評價。 重難點擊 1.研究培養基對微生物的選擇作用，進行微生物數量的測定。 2.能利用選擇培養基分離細菌，運用相關技術解決生產生活中有關微 生物的計數問題。,一、研究培養基對微生物的選擇作用,當堂檢測,二、進行微生物數量的測定,內容索引,一、研究培養基對微生物的選擇作用,基礎梳理,1.篩選菌株 (1)自然界中目的菌株的篩選 原理：根據目的菌株對 的要求，到相應的環境中去尋找。 實例：能產生耐高溫的Taq DNA聚合酶的 就是從熱泉中篩選出來的。 (2)實驗室中目的菌株的篩選 原理：人為提供有利于 生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時 其他微生物生長。 實例：從土壤中篩選能分解尿素的細菌。 方法：利用 培養基進行微生物的篩選。,選擇,生存環境,Taq細菌,目的菌株,抑制或阻止,2.選擇培養基 (1)概念：允許 種類的微生物生長，同時 其他種類微生物生長的培養基。 (2)舉例：篩選土壤中分解尿素的細菌的選擇培養基是以 為唯一氮源，按物理性質歸類為固體培養基。,尿素,特定,抑制或阻止,1.篩選分解尿素的細菌的選擇培養基 下面是本課題使用的培養基的配方，請分析：,問題探究,答案 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。,(1)在培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質？,答案,答案 該選擇培養基的配方中，尿素是培養基中的唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。,(2)分離分解尿素的細菌的選擇培養基是如何進行選擇的？,答案 分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可將尿素分解成氨，從而為微生物提供氮源。,(3)為什么只有能分解尿素的微生物才能在該培養基上生長？,答案 增設牛肉膏蛋白胨基礎培養基并進行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落數明顯多于選擇培養基上的菌落數，則說明選擇培養基的確起到了篩選能分解尿素的細菌的作用。,2.設計對照實驗 (1)如何設計對照實驗驗證該選擇培養基的確篩選到了能分解尿素的細菌？,答案 設置一個未涂布平板的能篩選分解尿素的細菌的選擇培養基。,(2)如何設計對照實驗驗證所用的選擇培養基沒有受到污染？,答案,歸納總結,選擇培養基的分類 (1)利用營養缺陷型選擇培養基進行的選擇培養：通過控制培養基的營養成分，使營養缺陷型微生物不能正常生長。 (2)利用化學物質進行的選擇培養：在完全培養基中加入某些化學物質，利用加入的化學物質抑制某些微生物的生長，同時選擇所需的微生物。 (3)利用培養條件進行的選擇培養：改變微生物的培養條件(如高溫、特殊pH等)，篩選特定微生物。,拓展應用,1.下列有關微生物篩選的敘述中，不正確的是 A.用全營養牛肉膏蛋白胨培養基篩選大腸桿菌 B.用高NaCl的培養基篩選抗鹽突變菌株 C.含酚紅的尿素培養基篩選鑒別出分解尿素的菌株 D.利用高溫條件篩選耐熱的Taq細菌,答案,解析,解析 全營養牛肉膏蛋白胨培養基常用于大腸桿菌的培養，該培養基對微生物無選擇作用，A項錯誤。 抗鹽突變菌株具有耐高鹽的能力，因此可以利用高NaCl的選擇培養基進行選擇培養，B項正確。 分解尿素的菌株會分解尿素形成氨，使培養基pH升高，因此可以利用含酚紅的尿素培養基篩選鑒別出分解尿素的菌株，C項正確。 利用高溫條件可以篩選耐熱的Taq細菌，D項正確。,2.下表是微生物培養基的成分。下列有關說法錯誤的是,答案,解析,A.此培養基可用來培養自養型微生物 B.此表中的營養成分共有三類，即水、無機鹽、氮源 C.若除去，此培養基可培養圓褐固氮菌 D.培養基中若加入氨基酸，則它可充當碳源、氮源和生長因子,解析 由題知，該培養基成分中含有水、無機鹽、氮源，但不含含碳有機物，可用來培養自養型微生物，選項A、B均對； 圓褐固氮菌同化類型為異養型，培養基中必須存在含碳有機物，所以該培養基不能用來培養圓褐固氮菌，C錯。,選擇培養基的常見類型 (1)分離微生物所用的選擇培養基一定是固體培養基，因為菌落只能在固體培養基上形成。 (2)常見的選擇培養基 加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。 加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。 無氮源培養基可以分離固氮微生物。 以石油為唯一碳源的培養基，可以分離能消除石油污染的微生物。 將培養基放在高溫環境中培養，可以分離耐高溫的微生物。,二、進行微生物數量的測定,基礎梳理,1.統計菌落數目 (1)方法： 。 (2)統計依據：當樣品的 足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個 。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 (3)操作 設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。 為保證結果準確，一般選擇菌落數在 的平板進行計數。 統計的菌落數往往比活菌實際數目 。,活菌計數法、顯微鏡直接計數法,稀釋度,活菌,30300,低,(4)計算公式：每克樣品中的菌株數(CV)M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的 ，V代表涂布平板時所用的 ，M代表 。 2.設置對照 (1)對照實驗：是指除了 以外，其他條件都相同的實驗。 (2)主要目的：排除實驗組中 對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。例如，為了確認培養基是否被雜菌污染，需以不進行接種的培養基培養作為空白對照。,平均菌落數,稀釋液的體積(mL),稀釋倍數,被測試條件,非測試因素,3.實驗操作流程 (1)土壤取樣 取樣原因：土壤有“微生物的 ”之稱，同其他生物環境相比，土壤中的微生物數量 ，種類 。 土壤要求：富含 ，pH接近 且潮濕。 取樣部位：距地表約 的土壤層。 (2)樣品稀釋 稀釋原因：樣品的 直接影響平板上生長的 。 稀釋標準：選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數在 之間，便于計數。,天然培養基,最大,最多,有機質,中性,38 cm,稀釋程度,菌落數目,30300,(3)微生物的培養與觀察 培養：根據不同微生物的需要，控制適宜的培養 和培養時間。 觀察 a.觀察方法：每隔24 h統計一次菌落數目，最后選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。 b.菌落的特征：包括菌落的 、 、隆起程度和 等。 (4)菌種鑒定 原理：細菌合成的 將尿素分解成氨，使培養基的 增強。 方法：以尿素為唯一氮源的培養基中加入 指示劑，培養某種細菌后，若指示劑變 ，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。,溫度,形狀,大小,顏色,脲酶,堿性,酚紅,紅,4.操作提示 (1)無菌操作 取土樣的用具在使用前都需要 。 實驗操作均應在 進行。 (2)做好標記：本實驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前應標明培養基的 、 以及平板上培養樣品的 等。 (3)制定計劃：對于耗時較長的生物實驗，要事先制定計劃，以便提高_。,滅菌,火焰旁,種類,培養日期,稀釋度,工作效率,右面是土壤中尿素分解菌的分離與計數的實驗流程示意圖，請結合教材提供的資料分析回答下列問題。 1.試寫出分離土壤中分解尿素的細菌的實驗流程,問題探究,答案 土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物培養觀察并記錄結果細菌計數。,答案,答案 不真實。為增加實驗的說服力與準確性，應設置重復實驗，在同一稀釋度下涂布3個平板，統計結果后計算平均值。,2.統計菌落數目 甲、乙兩位同學用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數。在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下兩種統計結果。 (1)甲同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為230，該同學的統計結果是否真實可靠？為什么？,答案,答案 不合理。微生物計數時，如果實驗中出現重復實驗的結果不一致的情況，應分析實驗過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地舍棄后進行計數。,(2)乙同學在該濃度下涂布了3個平板，統計的菌落數分別為21、212、256，該同學將21舍去，然后取平均值。該同學對實驗結果的處理是否合理？為什么？,答案,答案 105的稀釋度下取0.1 mL涂布的三個平板上的菌落數在30300之間，計算其平均值為(212234287)/3244。進一步可以換算出1 g樣品中活菌數為(2440.1)1052.44108。,(3)某同學在三種稀釋度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，統計菌落數，得到以下的數據，試計算1 g樣品的活菌數。,答案,答案 當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。,(4)為什么統計的菌落數比活菌的實際數目低？,答案,答案 可能是他選擇的土壤樣品不同于其他同學；也可能是培養基受到了污染或操作失誤。,3.對照實驗設計的分析 分析教材P22“設置對照”中的實例，探討下列問題： (1)在A同學確定自己操作無誤的情況下，A同學得出的菌落數多于其他同學的原因可能有哪兩種？,答案,答案 其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗，如果結果與A同學一致，則證明A同學操作無誤；如果結果不同，證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題； 將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下培養作為空白對照，以判斷培養基是否受到污染。,(2)如何設計對照實驗幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結果的因素？,答案,答案 土壤中各種微生物的數量是不同的，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離。,4.微生物數量測定的實驗設計 (1)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？,答案 每隔24 h統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果。,(2)本實驗中應如何統計培養基上生長的菌落數？,答案 培養基、錐形瓶、試管、鏟子、信封等，需要進行滅菌。 稱取土壤要在火焰旁進行。 稀釋土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁進行。,(3)實驗中的無菌操作主要有哪些？,答案,歸納總結,分離尿素分解菌操作中的注意事項,(1)在實驗操作中，每個步驟都要注意無菌操作，以防培養基被污染，影響實驗效果。 (2)樣品稀釋液的最佳濃度為獲得每個平板上有30300個菌落，這個稀釋度細菌一般為104、105、106倍稀釋液，放線菌一般為103、104、105倍稀釋液，真菌一般為102、103、104倍稀釋液。 (3)為排除非測試因素(培養基)的干擾，實驗需設置牛肉膏蛋白胨培養基進行空白對照。 (4)每一稀釋倍數的菌液都至少要涂布3個平板，作為重復實驗，求其平均值，若其中有菌落數與其他平板懸殊過大的，需要對該平板重新制作。,拓展應用,3.如圖為“土壤中分解尿素的細菌的分離和計數”實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析下列敘述正確的是 A.4號試管中稀釋液進行平板培養得 到的菌落平均數一定恰為5號的10倍 B.5號試管的結果表明每克該土壤中 的菌株數目為1.7108個 C.在用移液管吸取菌液進行梯度稀釋時，可用手指輕壓移液管上的橡皮頭， 吹吸三次，使菌液與無菌水充分混勻 D.某一稀釋度下至少涂3個平板，該實驗方法統計得到的結果常會比實 際活菌數目高,答案,4.自然界中的微生物往往是混雜生長的。人們在研究微生物時一般要將它們分離提純，然后進行數量的測定。下面是對大腸桿菌進行數量測定的實驗，請回答有關問題。 (1)實驗步驟 制備稀釋倍數為102、103、104、105、106的系列稀釋液。 為了得到更加準確的結果，應選用 法接種樣品。 適宜溫度下培養。,稀釋涂布平板,答案,(2)結果分析 測定大腸桿菌數目時，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，與事實更加接近的是 。 A.一個平板，統計的菌落數是230 B.兩個平板，統計的菌落數是220和260，取平均值240 C.三個平板，統計的菌落數分別是400、212和256，取平均值289 D.四個平板，統計的菌落數分別是210、260、240和250，取平均值240,答案,一同學在稀釋倍數為106的培養基上測得平板上菌落數的平均值為212，那么每毫升樣品中的菌落數約是(涂布平板時所用的稀釋液體積為0.2 mL) 。 用這種方法測定菌體密度時，實際活菌數量要比測得的數量 (填“多”或“少”)，因為_ 。,答案,解析,問題導析,1.06109個,多,當兩個或多個細菌連在一起時，平板上觀察到的只是一,個菌落,問題導析 (1)因為題中操作的目的是對大腸桿菌進行數量的測定，所以接種的方法是 。 (2)測定活菌數量時，選擇的平板越多誤差 ，且選擇的平板要能形成 個菌落。 (3)所做的多個平板中，如果其中一個平板中菌落的數目明顯_ 其他幾個平板，則說明該平板不符合要求，應 或舍棄。,答案,返回上頁,稀釋涂布平板法,越小,30300,多于或少于,重做,返回上頁,解析 (1)若對大腸桿菌進行計數，則需要用稀釋涂布平板法接種樣品。 (2)應選取多個菌落數相差不大的平板進行計數，取其平均值。 2120.21061.06109(個)。 因為一個菌落可能由兩個或多個細菌連在一起生長而成，所以實際活菌數量要比測得的數量多。,答案 低。因為稀釋倍數太低，則大部分菌落是由多個細菌繁殖而成，所以測定的菌落的數值要偏低。,一題多變 (1)如果某同學的稀釋倍數僅為104，則測定的數值要比題中測定的數值高還是低？為什么？,答案 培養基被污染，一些菌落是由雜菌繁殖而成的； 接種過程中由于操作不當感染了雜菌； 取菌液時沒有搖晃，導致所取菌液中細菌個體濃度偏大等。,(2)第(2)問第小題C項中菌落數為400的平板不符合要求，試分析該平板中菌落數目多于其他平板的可能的原因。,答案,用稀釋涂布平板法計數微生物的方法 (1)稀釋涂布平板操作要求：按照平行重復的原則，每一稀釋度的菌液涂布3個或3個以上的平板。 (2)計數的時機：當各平板上菌落數目穩定時進行計數。 (3)選擇可用于計數的平板：選擇菌落數在30300之間的平板(相同稀釋度的平板均符合該特點)進行計數，然后取平均值。,課堂小結,目的菌株,稀釋涂布平板法,顯微鏡直接計數法,當堂檢測,2,3,4,5,1,1.選擇培養基是根據某一種或某一類微生物的特殊營養要求或對一些物理、化學抗性而設計的培養基。利用這種培養基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。為選擇酵母菌和硝化細菌，應選用的培養基分別為 A.伊紅美藍培養基、含青霉素的培養基 B.含青霉素的培養基、含氨的無機培養基 C.含氨的無機培養基、含青霉素的培養基 D.含青霉素的培養基、伊紅美藍培養基,答案,解析,2,3,4,5,1,解析 酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培養基進行選擇培養，因為青霉素能夠抑制細菌生長，但不能夠抑制真菌生長。硝化細菌為自養型生物，能夠利用氨轉變為亞硝酸和硝酸所釋放的能量把無機物轉變為有機物以維持自身生命活動，利用含氨的無機培養基可進行選擇培養。,2,3,4,1,5,2.下列操作步驟順序正確的是 土壤取樣 稱取10 g土樣，加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中 吸取0.1 mL土壤溶液進行平板涂布 依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107稀釋度 A. B. C. D.,答案,3.在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑的目的是 A.篩選出能分解尿素的細菌 B.對分離的菌種作進一步鑒定 C.作細菌的營養成分 D.如指示劑變藍就能準確地認定該菌能分解尿素,解析 篩選出能分解尿素的細菌用選擇培養基即可，不需要加指示劑。加入指示劑的培養基，目的是對要分離的菌種作進一步的鑒定。,2,3,4,1,5,答案,解析,4.從土壤中分離以尿素為氮源的細菌，下列實驗操作不正確的是 A.將土壤用無菌水稀釋，制備103106倍的土壤稀釋液 B.將不同濃度的土壤稀釋液涂布于不同平板上 C.用加入剛果紅指示劑的選擇培養基篩選分解尿素的細菌 D.從周圍出現紅色環帶的菌落中挑取能夠分泌脲酶的菌株,解析 用加入酚紅指示劑的鑒別培養基可以鑒別分解尿素的細菌。,2,3,4,1,5,答案,解析,5.尿素是一種重要的農業肥料，但若不經細菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數量繁多，同學們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌(目的菌)。培養基成分如下表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答下列問題：,2,3,4,1,5,將上述物質溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL。,解析 植物組織培養的培養基中需要含有氮、磷、鉀及鋅、銅、鉬、鐵等元素，需要蔗糖為植物細胞提供能量，還需要