大約20種氨基酸構成了數目龐大的各種肽類和蛋白質。其中8種氨基酸是人體必需的，它們分別是L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸和L-纈氨酸。第一節概述現在是1頁\一共有119頁\編輯于星期四一、氨基酸的應用與市場

氨基酸的應用是基于它們的營養價值、風味、生理活性和化學特性。主要應用領域是食品、飼料、化妝品、醫藥，也用作化學工業的中間體。據估計全世界每年氨基酸市場為40－50億美元，其中35%用于食品、50%用于飼料和15%用于醫藥和化妝品。現在是2頁\一共有119頁\編輯于星期四1、食品領域氨基酸大多無味，但它們是自然芳香的前體。谷氨酸鈉（味精）是所有氨基酸中最大生產品種，全世界年產量達100萬噸（中國大陸約為60萬噸）。二肽和寡肽大多具有苦味，但二肽L-門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（Aspartame，阿斯巴甜）是個例外，它比蔗糖甜150－200倍，現已廣泛作為人造甜味劑，應用于低熱量的飲料等。目前，阿斯巴甜的世界年產量已超過2萬噸。

現在是3頁\一共有119頁\編輯于星期四2、飼料領域

組成蛋白質的氨基酸幾乎半數對于動物（如豬和家禽）來說是必需的。蛋氨酸和賴氨酸的全世界年產量分別為35萬噸和40萬噸。近年來，由于發酵水平的提高，蘇氨酸成功地進入飼料市場，估計全世界年產量已達1.5萬噸。L-色氨酸也是一種限制性氨基酸，尤其在以玉米為基礎的飼料中。但由于生產成本較高，目前L-色氨酸的世界年產量僅500噸（日本400噸），因此還不能廣泛作為飼料添加劑使用。現在是4頁\一共有119頁\編輯于星期四3、醫藥領域

L-氨基酸輸液是術前和術后的營養治療劑。標準氨基酸輸液含有8種必需氨基酸，2種半必需氨基酸（L-精氨酸和L-組氨酸），以及幾種非必需氨基酸，通常包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-谷氨酸。L-門冬氨酸鉀鎂常用于消除疲勞和治療心力衰竭和肝臟疾病。現在是5頁\一共有119頁\編輯于星期四4、工業領域

谷氨酸制成的聚谷氨酸樹脂具有天然皮革性能，因此可用于制造人造皮革和涂料。谷氨酸還可以制造人造纖維。甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸等可用于制造表面活性劑、緩沖劑和抗氧化劑。

現在是6頁\一共有119頁\編輯于星期四生產氨基酸的大國為日本和德國。日本的味之素、協和發酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產的三巨頭。它們能生產高品質的氨基酸，可直接用于輸液制劑的生產。日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產廠家，生產氨基酸和天冬甜精等衍生物。國內生產氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司，湖北八峰氨基酸公司，但目前無論生產規模及產品質量還難于與國外抗衡。2000年后，世界氨基酸產值已達45億美元，占生物技術市場的7%；國內的氨基酸產值可達40億元，占全國發酵產業總產值的12%。現在是7頁\一共有119頁\編輯于星期四二、氨基酸的生產方法

蛋白質水解法：早期味精生產、復合氨基酸化學合成法：DL-蛋氨酸，甘氨酸，DL-丙氨酸微生物發酵法1956年，木下竹郎（Kinoshita）首次報道分離出谷氨酸產生菌；次年發酵法工業化生產谷氨酸首先在日本問世，繼而迅速掀起一股氨基酸發酵研究的熱潮。經過半個世紀的努力，目前幾乎所有氨基酸都能用微生物法生產（胱氨酸和半胱氨酸除外）。現在是8頁\一共有119頁\編輯于星期四氨基酸發酵屬于典型的代謝控制發酵，這是由于氨基酸的生物合成受到嚴格的反饋調節。要進行氨基酸發酵，就必須采取某些人為的手段以打破微生物的反饋調節機制，從而大量積累目的氨基酸。現在是9頁\一共有119頁\編輯于星期四采用微生物法生產氨基酸的情況如下：1）使用野生型細菌生產氨基酸（L-谷氨酸、L-丙氨酸等）；2）使用突變株生產氨基酸（L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鳥氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸等）；3）使用添加前體的方法生產氨基酸（如用鄰氨基苯甲酸生產L-色氨酸；甘氨酸生產L-絲氨酸等）；現在是10頁\一共有119頁\編輯于星期四4）使用酶法生產氨基酸（利用微生物細胞或微生物產生的酶來制造氨基酸，如以延胡索酸和銨鹽為原料，經天冬氨酸酶催化生產L-天冬氨酸）；5）應用基因工程、蛋白質工程和代謝工程方法育成的菌株，進行發酵生產（L-羥脯氨酸）。現在是11頁\一共有119頁\編輯于星期四氨基酸本身的合成在不同生物體中，有較大的差異，但是許多氨基酸的合成途徑在不同生物體中也有共同之處。按照起始物可將氨基酸的合成分成幾個家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包括：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸；

現在是12頁\一共有119頁\編輯于星期四㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸和異亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包括：甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，組氨酸的合成為單獨的一條途徑。現在是13頁\一共有119頁\編輯于星期四第二節谷氨酸發酵的代謝控制育種

1957年日本率先采用微生物發酵法生產谷氨酸，被譽為現代發酵工業的重大創舉，使發酵工業進行代謝控制發酵的階段。目前全國有近50家工廠生產味精，年產量約為60萬噸，居世界首位。

現在是14頁\一共有119頁\編輯于星期四一、谷氨酸的生物合成與發酵生產

㈠谷氨酸生物合成途徑（1）糖酵解途徑（EMP）（2）磷酸已糖途徑（HMP)（3）三羧酸循環(TCA)（4）乙醛酸循環（DCA）（5）二氧化碳固定反應（6）α-KGA的還原氨基化反應現在是15頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是16頁\一共有119頁\編輯于星期四①蘋果酸酶②丙酮酸羧化酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CO2固定反應(丙酮酸羧化支路)現在是17頁\一共有119頁\編輯于星期四㈡谷氨酸glutamicacid合成的內在因素GA產生菌必須具備以下條件α-酮戊二酸脫氫酶的活性微弱或缺失TCA環阻斷，α-酮戊二酸積累琥珀酸輔酶ATCA環正常

GA產生菌體內的NADPH的氧化能力欠缺或喪失積累NADPH，抑制α—KGA的脫羧氧化

GA產生菌體內必須有乙醛酸循環（DCA）的關鍵酶——異檸檬酸裂解酶通過該酶酶活性調節實現DCA循環的封閉，GA積累現在是18頁\一共有119頁\編輯于星期四

菌體有強烈的L—谷氨酸脫氫酶活性提供NADPH,用于還原α-酮戊二酸生成谷氨酸氨的導入合成谷氨酸的反應有3種：α-酮戊二酸+NH4++NADPH谷氨酸脫氫酶GDHα-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADPH谷氨酸轉氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GS谷氨酸H2ONADP++反應的關鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯

現在是19頁\一共有119頁\編輯于星期四㈢谷氨酸生物合成的理想途徑此時，谷氨酸對糖的轉化率達到81.7%；目前，國內的GA生產企業的糖酸轉化率通常都在50%以內。現在是20頁\一共有119頁\編輯于星期四㈣生物素（VH）對谷氨酸發酵的影響1、生物素對糖代謝的影響生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度(對TCA有促進作用）而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸積累乳酸積累碳源利用率降低，而且帶來的是發酵液的pH值下降。現在是21頁\一共有119頁\編輯于星期四研究表明，異檸檬酸裂解酶活性

為醋酸誘導

受琥珀酸的阻遏抑制當VH缺乏時：（1）丙酮酸的有氧氧化就會減弱，乙酰輔酶A的生成量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導作用降低；（2）VH對TCA循環的促進作用的降低，使得其中間產物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強；兩者綜合的作用使得異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環得到封閉。另一方面，可以通過控制VH的濃度，實現對于乙醛酸循環的封閉。現在是22頁\一共有119頁\編輯于星期四

生物素對糖代謝的影響：主要是影響糖降解速度，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。在生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應，因而會引起乳酸的溢出。

生物素對CO2固定反應也有影響。研究表明，生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應。據有關資料報道，當生物素過量（100μg/L以上）時，CO2固定反應可提高30%。現在是23頁\一共有119頁\編輯于星期四以葡萄糖為原料發酵生成谷氨酸時，通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性。另外，該酶受琥珀酸阻遏，生物素亞適量時因琥珀酸氧化能力降低而積累的琥珀酸就會反饋抑制該酶的活性，并阻遏該酶的合成，乙醛酸循環基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移動。現在是24頁\一共有119頁\編輯于星期四2、生物素對氮代謝的影響VH豐富時，出現“只長菌，不產酸”的現象谷氨酸發酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產物的正常合成。控制谷氨酸發酵的關鍵之一就是降低蛋白質的合成能力，使合成的谷氨酸不能轉化成其他氨基酸或參與蛋白質合成。現在是25頁\一共有119頁\編輯于星期四在生物素亞適量的情況下，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通過轉氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白質。在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強，琥珀酸氧化能力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環的比例增加，草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應增強，蛋白質合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉氨作用生成的其他氨基酸量增加。現在是26頁\一共有119頁\編輯于星期四3、生物素對菌體細胞膜通透性的影響通常谷氨酸發酵采用的菌種都是生物素缺陷型，而生物素又是菌體細胞膜合成的必須物質，因此，可以通過控制生物素的濃度（干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來實現對菌體細胞膜通透性的調節。

培養基中生物素限量時，胞內AA92%胞外培養基中生物素豐富時，胞內AA12%胞外

現在是27頁\一共有119頁\編輯于星期四谷氨酸生產菌大多是生物素缺陷型，發酵時控制生物素亞適量，使細胞變形拉長，改變了細胞膜的通透性引起代謝失調使Glu得以積累。生物素貧乏時，細胞內的Glu含量少而且容易析出，而培養基中積累大量的Glu；生物素豐富時，培養基中幾乎不積累Glu，而細胞內卻含有大量的Glu，且不易被析出。這說明生物素對細胞膜通透性有重要影響。現在是28頁\一共有119頁\編輯于星期四細胞膜透性的調節谷氨酸發酵的關鍵在于發酵培養期間谷氨酸生產菌細胞膜結構與功能發生特異性變化，使細胞膜轉變成有利于谷氨酸向膜外滲透的形態，使終產物不斷排出細胞外，胞內谷氨酸不能積累到引起反饋調節的濃度，胞內谷氨酸源源不斷被優先合成，分泌到發酵培養基中積累。細胞透性的調節，一般通過向培養基中添加化學成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性劑、青霉素等，達到抑制磷脂、細胞膜的形成或阻礙細胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生產菌處于異常生理狀態，解除細胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。現在是29頁\一共有119頁\編輯于星期四生物素：影響磷脂的合成及細胞膜的完整性。油酸：直接影響磷脂的合成及細胞膜甘油：甘油缺陷型菌株喪失α-磷酸甘油脫氫酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供應甘油，控制了細胞膜中與滲透性直接關系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。表面活性劑：對生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合成，導致磷脂合成不足，影響細胞膜的完整性，提供細胞膜對谷氨酸的滲透性。青霉素：抑制細菌細胞壁的后期合成，形成不完整的細胞壁，使細胞膜失去保護，使胞內外的滲透壓差導致細胞膜的物理損傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性。現在是30頁\一共有119頁\編輯于星期四生物素阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成表面活性劑對生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細胞膜的合成在對數生長期添加青霉素抑制細胞壁合成細胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細胞膜的合成提高細胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使細胞膜受損（如表面活性劑）青霉素損傷細胞壁，間接影響細胞膜控制磷脂含量通過油酸的合成通過甘油合成直接控制磷脂合成現在是31頁\一共有119頁\編輯于星期四二、谷氨酸生物合成的調節機制現在是32頁\一共有119頁\編輯于星期四㈠谷氨酸生物合成的調節①谷氨酸脫氫酶②-酮戊二酸脫氫酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶④檸檬酸合成酶現在是33頁\一共有119頁\編輯于星期四⑴優先合成在微生物的代謝中，Glu比Asp優先合成；合成過量時則抑制谷氨酸脫氫酶，使代謝轉向合成Asp；Asp過量時反饋抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。

⑵谷氨酸脫氫酶(GDH)的調節谷氨酸脫氫酶谷氨酸對其反饋抑制和反饋阻遏⑶檸檬酸合成酶的調節檸檬酸合成酶TCA的關鍵酶，受能荷調節，谷氨酸反饋阻遏，烏頭酸反饋抑制所以，正常代謝不積累Glu現在是34頁\一共有119頁\編輯于星期四⑷異檸檬酸脫氫酶的調節

細胞內α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡。當α-酮戊二酸過量時，將對異檸檬酸脫氫酶發生反饋抑制作用，停止合成α-酮戊二酸。異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸反饋抑制⑸α-酮戊二酸脫氫酶:谷氨酸產生菌中先天性的喪失或微弱。⑹磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEP受天冬氨酸反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸反饋阻遏。現在是35頁\一共有119頁\編輯于星期四喪失或有微弱的-酮戊二酸脫氫酶活力，使-酮戊二酸不能繼續氧化；CO2固定能力強，使四碳二羧酸全部由CO2固定反應提供，而不走乙醛酸循環；谷氨酸脫氫酶的活力很強，并喪失谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋抑制和反饋阻遏，同時，NADPH2再氧化能力弱，使-酮戊二酸到琥珀酸的過程受阻；有過量的NH4+存在，-酮戊二酸經氧化還原共軛氨基化反應而生成谷氨酸卻不形成蛋白質，從而分泌泄漏于菌體外；同時，谷氨酸生產菌應不利用體外的谷氨酸，使谷氨酸成為最終產物。生產菌株還應該具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特點。㈡谷氨酸高產菌模型特征36現在是36頁\一共有119頁\編輯于星期四1、谷氨酸生產菌的育種思路

㈢谷氨酸生產的代謝調控現在是37頁\一共有119頁\編輯于星期四1.切斷或減弱支路代謝

2.解除自身的反饋抑制

3.增加前體物的合成

4.提高細胞膜的滲透性

5.強化能量代謝6.利用基因工程技術構建谷氨酸工程菌株

育種思路：現在是38頁\一共有119頁\編輯于星期四1.切斷或減弱支路代謝

⑴選育減弱α-酮戊二酸進一步氧化能力的突變株

減弱α-酮戊二酸脫氫酶復合體的活性，可以使代謝流向谷氨酸，從而使谷氨酸得到積累。

⑵選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株

通過HMP途徑也可生成核糖、核苷酸、輔酶Q、維生素K、葉酸等物質。這些物質的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產率降低。如果削弱或切斷這些物質的合成途徑，就會使谷氨酸的產率增加。這可通過選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進生長的突變株以及抗嘌呤、嘧啶類似物或核苷酸類抗生素來實現。現在是39頁\一共有119頁\編輯于星期四⑶選育不分解利用谷氨酸的突變株

可通過選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長或生長微弱的突變株來實現。⑷選育減弱乙醛酸循環的突變株

四碳二羧酸是由CO2固定反應和乙醛酸循環所提供的。減弱乙醛酸循環，CO2固定反應所占的比例就會增大，谷氨酸的產率就高。這可通過選育琥珀酸敏感型突變株、不分解利用乙酸突變株、異檸檬酸裂解酶活力降低菌株來實現。⑸阻止谷氨酸進一步代謝

由于細胞還可以谷氨酸為前體繼續向下合成谷氨酰胺等，要避免谷氨酸被菌體利用，還需要切斷谷氨酸向下的代謝途徑。現在是40頁\一共有119頁\編輯于星期四2.解除菌體自身的反饋調節

⑴選育耐高滲透壓突變株

要使菌種能高產谷氨酸，首先要使菌種具備在高糖、高谷氨酸的培養基中仍能正常生長、代謝的能力。這可通過選育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨酸突變株來實現。

⑵選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節的突變株

當谷氨酸合成達到一定量時，谷氨酸就會反饋抑制和阻遏谷氨酸脫氫酶，使谷氨酸的合成停止，使代謝轉向天冬氨酸的合成，因此要解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋調節。這可通過選育酮基丙二酸抗性、谷氨酸結構類似物抗性（如谷氨酸氧肟酸鹽）、谷氨酰胺抗性突變株來實現。

現在是41頁\一共有119頁\編輯于星期四3.增加前體物的合成

⑴選育強化三羧酸循環中從檸檬酸到α-酮戊二酸代謝的突變株

這可通過選育檸檬酸合成酶活力強突變株及抗氟乙酸、氟化鈉、重氮絲氨酸、氟檸檬酸等突變株來實現。

⑵選育強化CO2固定反應的突變株

這可通過選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源生長良好的突變株、氟丙酮酸敏感突變株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突變株來實現。

現在是42頁\一共有119頁\編輯于星期四4.提高細胞膜的滲透性

（1）選育抗Vp類衍生物突變株

選育抗Vp類衍生物，如香豆素、盧丁等突變株，都能遺傳性的改變細胞膜的滲透性。生物素缺陷株（生物素亞適量）（2）選育溶菌酶敏感突變株

使細胞壁網狀結構變疏松，對細胞膜保護作用降低，滲透性變大。（3）選育二氨基庚二酸缺陷突變株

現在是43頁\一共有119頁\編輯于星期四5.利用基因工程技術構建谷氨酸工程菌株2000年，蓮花集團技術中心與河南省科學院生物研究所共同承擔河南省重大科技攻關項目“FM00-187谷氨酸高產酸菌種選育”，利用原生質融合這一基因重組技術，將兩個具有不同基因型的細胞進行融合，達到基因重組的目的，獲得高產酸的谷氨酸菌株，谷氨酸產酸率由10.5%提高到14%以上，糖酸轉化率提高到65%以上。現在是44頁\一共有119頁\編輯于星期四1、生產菌種現在經過鑒定和命名的谷氨酸生產菌很多，主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節桿菌屬中的細菌。它們有很多相似點：革蘭氏陽性；不形成芽孢；沒有鞭毛，不能運動；都需要生物素作為生長因子；都具有一定的過量合成谷氨酸能力。目前國內大多數廠家使用的菌種是天津工業微生物研究所選育的天津短桿菌T6-13及其變異株。三、谷氨酸的生產工藝現在是45頁\一共有119頁\編輯于星期四2、谷氨酸發酵生產發酵初期（適應期），糖基本沒有利用，尿素分解放出氨使pH值略上升。延滯期的長短一般為2-4h。進入對數生長期，代謝旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升。但隨著氨被利用pH值又下降，溶氧濃度急劇下降，然后又維持一定水平，菌體濃度迅速增大。這個時期，為了及時供給菌體生長必需的氮源及調節培養液的pH值至，必須流加尿素；又由于代謝旺盛，泡沫增加并放出大量發酵熱，需加入消泡劑及冷卻，使溫度維持在30-32℃。這個階段主要是菌體生長，幾乎不產酸，一般為12h左右。

現在是46頁\一共有119頁\編輯于星期四當菌體生長基本停止就轉入谷氨酸合成階段，此時菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產生的α-酮戊二酸和氨主要用來合成谷氨酸。這一階段，為了提供谷氨酸合成所需的氨及維持pH值在，必須流加尿素，又為了促進谷氨酸的合成需要加大通氣量，并將發酵溫度提高到谷氨酸合成的最適溫度36-37℃。發酵后期，菌體衰老，糖耗緩慢，殘糖低，此時流加尿素必須相應減少。當營養物質耗盡酸度不再增加時需及時放罐。發酵周期一般為30-36h。

現在是47頁\一共有119頁\編輯于星期四第三節

天冬氨酸族氨基酸發酵機制現在是48頁\一共有119頁\編輯于星期四一、生物合成途徑及代謝調控機制㈠、生物合成途徑

天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸為原料，合成蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和賴氨酸。現在是49頁\一共有119頁\編輯于星期四葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸β-半醛

賴氨酸高絲氨酸蛋氨酸

蘇氨酸

異亮氨酸EMPCO2固定、氧化氨基化反應天冬氨酸激酶天冬氨酸β-半醛脫氫酶二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶高絲氨酸脫氫酶琥珀酰高絲氨酸合成酶高絲氨酸激酶蘇氨酸脫氨酶現在是50頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是51頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是52頁\一共有119頁\編輯于星期四㈡、天冬氨酸族生物合成的代謝調節機制在細菌中，雖然天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑是相同的，但是其代謝調節機制是多種多樣的。1.大腸桿菌K12①天冬氨酸激酶（AK）

AKⅠ:受蘇氨酸、異亮氨酸的多價抑制和阻遏AKⅡ：受蛋氨酸專一性抑制和阻遏AKⅢ：受賴氨酸專一性抑制和阻遏現在是53頁\一共有119頁\編輯于星期四②天冬氨酸-β-半醛脫氫酶專一性的受賴氨酸不完全的抑制③二氫吡啶二羧酸（DDP）合成酶（賴氨酸分支的第一個酶）DDP合成酶受賴氨酸反饋抑制。二氨基庚二酸（DAP）脫羧酶受賴氨酸阻遏現在是54頁\一共有119頁\編輯于星期四④高絲氨酸脫氫酶（HD）（通向蘇氨酸、蛋氨酸分支的第一個酶）HDⅠ：受蘇氨酸反饋抑制HDⅡ：受蛋氨酸阻遏⑤蘇氨酸脫氨酶（異亮氨酸合成途徑的酶）受異亮氨酸的反饋抑制和阻遏現在是55頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是56頁\一共有119頁\編輯于星期四2.黃色短桿菌其賴氨酸生物合成調節機制比大腸桿菌簡單，其天冬氨酸激酶只有一種，該酶具有兩個變構部位，可以與終產物結合，當只有一種終產物（賴氨酸或蘇氨酸）與酶結合，酶活性不受影響。當兩種終產物（賴氨酸和蘇氨酸）同時過量時，與酶的兩個變構部位結合，該酶活性受到抑制，這種終產物的反饋抑制稱為協同反饋抑制。現在是57頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是58頁\一共有119頁\編輯于星期四3.乳糖發酵短桿菌賴氨酸合成調節1）存在代謝優先向蘇氨酸和蛋氨酸方向進行。2）與黃色短桿菌區別：AK受賴氨酸+蘇氨酸的反饋抑制存在代謝互鎖，DDP合成酶的合成受亮氨酸阻遏，DDP還原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。現在是59頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是60頁\一共有119頁\編輯于星期四黃色短桿菌和乳糖發酵短桿菌，其賴氨酸生物合成調節機制比大腸桿菌簡單得多。這些細菌只有一種AK，不存在想大腸桿菌那樣的三種同功酶。反饋調節易于解除，使育種過程簡單化，故常被用作氨基酸發酵育種的出發菌株。現在是61頁\一共有119頁\編輯于星期四谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代謝調節機制包括以下幾方面：⑴關鍵酶AK是關鍵酶，受Lys和Thr的協同反饋抑制。⑵優先合成Met比Thr、Lys優先合成，Thr比Lys優先合成。⑶代謝互鎖在乳糖發酵短桿菌中，Lys分支途徑的初始酶DDP合成酶受Leu的反饋阻遏。⑷平衡合成Asp和乙酰CoA形成平衡合成。當乙酰CoA合成過量時，能解除Asp對PEP羧化酶的反饋抑制。⑸Asp與Glu之間的調節機制Glu比Asp優先合成。當Glu合成過量時，反饋抑制GHD，使生物合成轉向Asp。當Asp合成過量時，反饋抑制PEP羧化酶，使整個生物合成停止。現在是62頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是63頁\一共有119頁\編輯于星期四二、賴氨酸發酵

L-賴氨酸的化學名稱為2,6-二氨基己酸，分子式C6H14O2N2。作為第一限制性必需氨基酸，廣泛應用于食品、飼料和醫藥工業，在平衡氨基酸組成方面起著十分重要的作用。目前絕大部分賴氨酸都是采用發酵法生產。現在是64頁\一共有119頁\編輯于星期四賴氨酸是一種必需氨基酸，可以促進兒童發育，增強體質。補充適量L-賴氨酸，可以大大提高蛋白質的利用率。賴氨酸被廣泛用于食品強化劑、飼料添加劑及醫療保健、滋補飲料等各方面，是一個具有廣泛市場的氨基酸產品。目前全世界產量已達20萬噸，而且還呈上升趨勢，其中日本占世界產量的60%，我國賴氨酸生產水平還有待提高。現在是65頁\一共有119頁\編輯于星期四公司廠址規模(萬噸/年)制法味之素日本，九州佐賀縣2.0發酵法協和發酵日本，山口縣防府1.5發酵法哈特蘭德賴氨酸公司美國，依阿華州2.0發酵法生物協和發酵美國，蜜蘇里州開普吉拉多1.36發酵法ADM公司美國，依利諾斯州迪凱特4.7發酵法亞吉諾莫托公司美國，北卡羅來納州羅利不詳發酵法歐洲賴氨酸公司法國，亞眠2.0發酵法日本味之素泰國公司泰國，曼谷0.2發酵法東麗公司日本，名古屋0.8酶法費埃爾麥克斯墨西哥0.6發酵法協和與匈聯營公司匈牙利，布達佩斯東0.5發酵法塔拉戈納化工公司西班牙，巴倫西亞得塘湖安0.6發酵法臺灣糖業公司臺南市0.4發酵法合計21.58表世界主要賴氨酸生產廠家現在是66頁\一共有119頁\編輯于星期四我國賴氨酸生產狀況南寧賴氨酸廠：1987年投產，生產能力6000噸/年。泉州賴氨酸廠：1989年與正大集團合資后改名為“泉州大泉賴氨酸有限公司”，生產能力為5000噸/年左右，使用國外菌種和技術。四川川化味之素公司是中日合資企業，賴氨酸生產能力為6000噸/年，使用日本菌種和技術。我國賴氨酸行業的特點是：總生產能力小、企業規模小、生產水平低，因而發展困難。現在是67頁\一共有119頁\編輯于星期四生產技術指標日本我國產酸水平/%104.5~6.5轉化率/%5035提取率/%86~9571~90工廠最大規模/萬噸

年-11.50.6生產成本比值12電耗/kwh

t-11600~22009117我國與日本發酵法賴氨酸生產(商業規模)技術指標對照現在是68頁\一共有119頁\編輯于星期四㈠菌種

賴氨酸的直接發酵法生產主要采用短桿菌屬和棒桿菌屬細菌的各種變異株。與大腸桿菌相比，短桿菌屬和棒桿菌的L-賴氨酸生物合成調節機制較為簡單，適合作為出發菌株（如黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳酸發酵短桿菌等）。一般來說，L-賴氨酸產生菌由亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、紫外線（UV）等誘變選育而得。現在是69頁\一共有119頁\編輯于星期四㈡賴氨酸的生物合成

1、L-賴氨酸生物合成途徑微生物中的L-賴氨酸生物合成途徑自1950年以來逐漸闡明。微生物的L-賴氨酸有兩條生物合成途徑，即二氨酸庚二酸途徑（DAP途徑）和α-氨基己二酸途徑。細菌的L-賴氨酸生物合成途徑為DAP途徑。

現在是70頁\一共有119頁\編輯于星期四在谷氨酸棒桿菌和黃色短桿菌中的L-賴氨酸合成分支上第一個酶是二氫吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶或PS），它不受末端產物L-賴氨酸的反饋調節。因此，AK是谷氨酸棒桿菌和黃色短桿菌的L-賴氨酸合成途徑中唯一的關鍵酶。2、L-賴氨酸生物合成反饋調節機制現在是71頁\一共有119頁\編輯于星期四在乳糖發酵短桿菌中，AK不但受到末端產物L-賴氨酸、L-蘇氨酸的協同反饋調節，L-賴氨酸單獨過剩時AK活性也被抑制45%。此外，DDP合成酶還受到門冬氨酸族以外的L-亮氨酸的阻遏。現在是72頁\一共有119頁\編輯于星期四㈢L-賴氨酸產生菌的育種要點

1、解除反饋調節解除反饋調節包括解除代謝產物對關鍵酶的反饋抑制或阻遏。在DAP途徑中，有3個關鍵酶起限速反應作用：門冬氨酸激酶（AK）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC)二氫吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶或PS）其中PC受門冬氨酸的反饋抑制，AK受賴氨酸和蘇氨酸的協同反饋抑制，DDP合成酶受亮氨酸的代謝互鎖作用。現在是73頁\一共有119頁\編輯于星期四AK反饋調節的解除（AK脫敏）AK（在黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌和乳糖發酵短桿菌中）只受蘇氨酸和賴氨酸的協同反饋抑制。

現在是74頁\一共有119頁\編輯于星期四要解除對AK的反饋抑制，可以選用下表的結構類似物抗性突變株。除了選育結構類似物抗性突變株外，還可以選育組合型突變株，如營養缺陷型和結構類似物抗性組合突變株，由于其具有兩者的優點，因而可大幅度地提高賴氨酸的產量。現在是75頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是76頁\一共有119頁\編輯于星期四PC的脫敏與激活PC催化PEP生成Asp，PC受Asp的反饋抑制。在丙酮酸激酸催化下，PEP生成Pyr（丙酮酸）。為了增加Lys前體Asp的量，就必須切斷生成PYR的支路，同時解除Asp對PC的反饋抑制。現在是77頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是78頁\一共有119頁\編輯于星期四①選育ALA-或丙氨酸的溫度敏感株（tmps）。②選育AspHxr、磺胺類藥物抗性突變株。③選育FPs突變株。④用200～500μ/L的生物素激活PC。⑤選育在琥珀酸平板上快速生長的突變株。⑥構建丙酮酸激酶缺陷的工程菌株。⑦構建檸檬酸合成酶活力低或缺陷的工程菌株。⑧選育GluHxs突變株。⑨用乙酶CoA激活PC。⑩采用低糖流加法激活PC（糖濃度為4%～5%）。現在是79頁\一共有119頁\編輯于星期四2、切斷或減弱支路代謝

選育營養缺陷型或滲漏突變株，即切斷或減弱合成蛋氨酸和蘇氨酸的分支途徑，可達到積累賴氨酸的目的。高絲氨酸滲漏突變株（Hse1）是由于高絲氨酸脫氫酶（HD）活性下降但不完全喪失，使得代謝流發生變化，由原來優先合成高絲氨酸方向轉向合成賴氨酸方向。由于生成的蘇氨酸量不足于與賴氨酸共同對AK起協同反饋抑制作用，從而使賴氨酸得以積累。

現在是80頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是81頁\一共有119頁\編輯于星期四3、解除代謝互鎖作用

在乳糖發酵短桿菌中，賴氨酸的生物合成與亮氨酸之間存在著代謝互鎖。賴氨酸生物合成分支途徑的第一酶DDP合成酶的合成受到亮氨酸阻遏。在此情況下，副產物Ala、Val生成量顯著地增加，這是因為PS的合成受到阻遏，酶活力顯著降低，使丙酮酸通向賴氨酸的代謝受阻，而丙酮酸轉向合成Ala、Val的結果。現在是82頁\一共有119頁\編輯于星期四現在是83頁\一共有119頁\編輯于星期四解除代謝互鎖的方法包括：①選育亮氨酸缺陷突變株；②選育亮氨酸結構類似物抗性突變株；③選育亮氨酸溫度敏感突變株；④選育對苯醌或喹啉衍生物敏感的突變株；⑤選育NAA-突變株（萘乙酸缺陷突變株）和亮氨酸溫度敏感突變株。現在是84頁\一共有119頁\編輯于星期四4、改善膜的通透性代謝終產物（如Lys）在菌體內合成后，通過細胞膜滲透到發酵液中是非常重要的。一方面可以使產物易于提取，另一方面可以降低產物在菌體內的濃度，從而合產物達不到足以引起反饋抑制或阻遏的濃度。Tosaka等人對乳糖發酵短桿菌AECr突變株的研究，發現它的賴氨酸排出是通過主動運輸系統來進行的，而且當培養基中Lys濃度相當于細胞內濃度的5倍時，仍能排出。現在是85頁\一共有119頁\編輯于星期四5、增加前體物的合成

①選育丙氨酸缺陷型：切斷丙酮酸合成丙氨酸的代謝流，丙酮酸能充分用于合成Asp，增加Lys的產量；

②選育門冬氨酸結構類似抗性突變株；③選育適宜的CO2固定酶/TC循環酶活性比的突變株。現在是86頁\一共有119頁\編輯于星期四6、利用基因工程技術構建賴氨酸工程菌

棒桿菌屬（Corynebacterium）催化賴氨酸生物合成酶的基因已被成功克隆。已發現將某些用來催化賴氨酸生物合成酶的基因導入寄主細胞能有效提高賴氨酸的產量。Richamd等把幾個參與Lys合成的基因分別在具有高拷貝數的質粒pBR322上進行克隆，使拷貝數高達50以上。再轉化大腸桿菌，改變了天冬氨酸激酶，最終使工程菌能產生比原菌株高5倍的Lys。現在是87頁\一共有119頁\編輯于星期四綜上所述，在天冬氨酸族氨基酸代謝途徑中，末端產物種類多，調節機制復雜，為了高效率生產賴氨酸，可以采取順序解除各種調節機制的誘變育種方法，獲得多重標記突變株。但是，采用人工誘變獲得多重標記組合型突變株，是一件費時、費力、非常麻煩的工作。采用細胞工程和基因工程新技術，將誘變所獲得的優良特性組合起來，獲得高產菌株就容易得多。現在是88頁\一共有119頁\編輯于星期四1、賴氨酸的發酵控制賴氨酸生產菌大多是細菌，以谷氨酸生產菌為出發菌株，通過選育解除自身的代謝調節獲得賴氨酸的高產菌株。也有酵母菌，但產量較細菌低。三、賴氨酸的發酵工藝現在是89頁\一共有119頁\編輯于星期四1）培養基中蘇氨酸、蛋氨酸的控制

賴氨酸生產菌是高絲氨酸缺陷型突變株。蘇氨酸和蛋氨酸是賴氨酸生產菌的生長因子。賴氨酸生產菌缺乏蛋白質分解酶，不能直接分解蛋白質，只能將有機氮源水解后才能被利用。發酵過程中，如果培養基中的蘇氨酸和蛋氨酸豐富，就會出現只長菌體，而不產或少產賴氨酸的現象，所以要控制其在亞適量，當菌體生長到一定時間后，轉入產酸期。

現在是90頁\一共有119頁\編輯于星期四2）生物素對賴氨酸的影響

賴氨酸生產菌大多是生物素缺陷型，如果在發酵培養基中限量添加生物素，賴氨酸發酵就會向谷氨酸轉換，大量積累谷氨酸；若添加過量生物素，使細胞內合成的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶產生反饋抑制作用，則抑制谷氨酸的大量生成，使代謝流向合成門冬氨酸方向。因此，生物素可促進草酰乙酸生成，增加門冬氨酸的供給，提高賴氨酸的產量。

現在是91頁\一共有119頁\編輯于星期四3）賴氨酸發酵的工藝條件

發酵溫度前期為32℃，中后期為34℃。pH＝。發酵過程中，通過添加尿素或氨水來控制pH值，同時尿素和氨水還能為賴氨酸的生物合成提供氮源。種齡和接種量要求以對數生長期的種子為好，當采用二級種子擴大培養時，接種量約為2%，種齡一般為8-12h；當采用三級種子擴大培養時，接種量約為10%，種齡一般為6-8h。現在是92頁\一共有119頁\編輯于星期四控制溶解氧濃度對賴氨酸發酵很重要，賴氨酸發酵要求供氧充足。供氧不足，將導致乳酸積累，使細胞體內的賴氨酸和磷脂含量增加，而發酵液中賴氨酸含量很低，并可能導致賴氨酸生產受到不可逆抑制，該抑制作用與細胞膜透性有關。現在是93頁\一共有119頁\編輯于星期四2、賴氨酸的提取與精制

賴氨酸的提取過程包括發酵液預處理、提取和精制三個階段。因游離的L-賴氨酸易吸附空氣中的CO2，故結晶比較困難，一般商品都以L-賴氨酸鹽酸鹽的形式存在。

現在是94頁\一共有119頁\編輯于星期四1）發酵液預處理一般采用離心法（高速離心4000-65000r/min）除去菌體，添加絮凝劑（如聚丙烯酰胺、明礬等）沉淀。濾液用鹽酸調節pH4.0后備用。現在是95頁\一共有119頁\編輯于星期四2）離子交換法提取賴氨酸從發酵液中提取賴氨酸通常有四種方法：①沉淀法；②有機溶劑抽提法；③離子交換法；④電滲析法。工業上大多采用離子交換法來提取賴氨酸。賴氨酸是堿性氨基酸，等電點為9.59，在pH＝2.0左右被強酸性陽離子交換樹脂所吸附，pH＝被弱酸性陽離子交換樹脂所吸附。

現在是96頁\一共有119頁\編輯于星期四強酸性陽離子交換樹脂的氫型對賴氨酸的吸附比銨型容易得多，但是銨型能選擇性地吸附賴氨酸和其它堿性氨基酸，不吸附中性和酸性氨基酸，同時在用氨水洗脫賴氨酸后，樹脂不必再生。所以從發酵液中提取賴氨酸均選用銨型強酸性陽離子交換樹脂。現在是97頁\一共有119頁\編輯于星期四3）賴氨酸的精制離子交換柱的洗脫液中含游離賴氨酸和氫氧化銨。需經真空濃縮蒸去氨后，再用鹽酸調至賴氨酸鹽的等電點5.2，生成賴氨酸鹽酸鹽以含一個結晶水合物的形式析出。經離心分離后，在50℃以上進行干燥，去除結晶水即得賴氨酸鹽酸鹽成品。

現在是98頁\一共有119頁\編輯于星期四第四節蘇氨酸的發酵及育種蘇氨酸用于飼料工業、保健食品和醫藥工業，目前產量約5萬噸。主要生產企業為日本味之素公司、德國德固賽公司、美國ADM公司、日本協和發酵工業公司等，其產量占全球份額的90%左右。制備方法有化學合成法、發酵法和蛋白質水解法，以發酵法最為先進；由微生物發酵生成的蘇氨酸都是L-蘇氨酸。現在是99頁\一共有119頁\編輯于星期四一、蘇氨酸的育種途徑現在是100頁\一共有119頁\編輯于星期四蘇氨酸高產菌株應具備的生化特征DDP合成酶活力極弱或欠缺琥珀酰高絲氨酸合成酶酶活力極弱或欠缺蘇氨酸脫氨酶酶活力極弱或欠缺CO2固定能力強天冬氨酸合成能力強天冬氨酸激酶活力強，對蘇氨酸和賴氨酸的協同反饋抑制不敏感高絲氨酸脫氫酶活力強，不受蘇氨酸反饋調節。現在是101頁\一共有119頁\編輯于星期四二、選育蘇氨酸生產菌的方法⑴切斷或減弱支路代謝選育和利用營養缺陷型突變株（或營養滲漏型突變株，營養缺陷回復突變株）是積累蘇氨酸的有效措施。①選育Lys-、Lysl、Lys+突變株②選育Met-、Metl、Met+突變株③選育Ile-、Ilel、Ile+突變株現在是102頁\一共有119頁\編輯于星期四⑵解除反饋調節在Thr發酵中，必須解除終產物對關鍵酶AK和HD的反饋調節。選育抗賴氨酸、抗蘇氨酸結構類似物突變株，可以得到關鍵酶AK對蘇氨酸、Lys協同反饋抑制脫敏的突變株。。如AHVr、ThrHxr、AECr、MLr、ALLr、LysHxr等。現在是103頁\一共有119頁\編輯于星期四⑶增加前體物的合成與Lys高產菌株的選育一樣，增加前體物Asp的生成，可提高Thr的積累，其方法為：①選育Ala-突變株②選育抗Asp結構類似物突變株③選育谷氨酸結構類似物敏感突變株④利用平衡合成，通過添加乙醇、醋酸等增加乙酰CoA的生成。現在是104頁\一共有119頁\編輯于星期四⑷切斷蘇氨酸進一步代謝途徑細胞可以