miR-187*與miR-451：大腸癌診療新視角下的表達與細胞功能解析一、引言1.1研究背景與意義大腸癌，作為消化道系統中常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。據統計，在全球范圍內，大腸癌的發病率和死亡率均位居前列。2020年全球癌癥統計數據顯示，結直腸癌新發病例達193萬，死亡病例達93.5萬，分別位居所有惡性腫瘤的第三位和第二位。在中國，大腸癌的發病形勢也不容樂觀，其發病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡逐漸年輕化。大腸癌的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳、環境、生活方式等多種因素。傳統的治療方法，如手術、化療和放療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但對于晚期患者的治療效果仍不理想，患者的生存率和生活質量較低。因此，深入研究大腸癌的發病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高大腸癌的治療效果和患者的生存率具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類內源性的非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸。它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉錄后水平調控基因的表達。miRNA參與了細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學過程，在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用。越來越多的研究表明，miRNA在大腸癌組織中的表達水平與正常組織存在顯著差異，這些差異表達的miRNA可能作為癌基因或抑癌基因，參與大腸癌的發生發展過程。miR-187和miR-451作為miRNA家族的重要成員，近年來在腫瘤研究領域受到了廣泛關注。已有研究報道，miR-187在多種腫瘤組織中存在異常表達，且與腫瘤的發生、發展、轉移和預后密切相關。例如，在乳腺癌中，miR-187的表達水平明顯下調，其低表達與腫瘤的侵襲性和不良預后相關；在肺癌中，miR-187通過靶向調控相關基因，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。然而，miR-187*在大腸癌中的表達及作用機制尚未完全明確。miR-451同樣在多種腫瘤中表現出異常表達。在肝癌患者血漿中，miR-451表達水平明顯低于對照組，且與腫瘤大小、淋巴轉移、靜脈侵犯、腫瘤數量及TNM分期明顯相關；在胃癌組織中，miR-451表達水平明顯下降，且與腫瘤細胞的增殖、分化以及侵潤密切相關。在大腸癌研究中，有研究發現miR-451在大腸癌及大腸腺瘤組織中明顯下調，可能通過抑制巨噬細胞游走抑制因子（MIF）負向調控大腸癌的發生和發展。但miR-451在大腸癌中的具體作用機制及與其他信號通路的交互作用仍有待進一步深入研究。本研究旨在探討miR-187*和miR-451在大腸癌組織及細胞系中的表達水平，分析其與大腸癌臨床病理參數的關系，并通過細胞功能實驗研究它們對大腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，初步揭示其作用機制。這不僅有助于深入了解大腸癌的發病機制，為大腸癌的早期診斷和預后評估提供新的分子標志物，還可能為大腸癌的靶向治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，miRNA在腫瘤研究領域成為熱點，miR-187*和miR-451在國內外也受到了眾多學者的關注。在國外，對于miR-187的研究涉及多種腫瘤類型。有研究團隊通過高通量測序技術分析乳腺癌組織與正常乳腺組織中miRNA的表達譜，發現miR-187在乳腺癌組織中顯著低表達。進一步的功能實驗表明，miR-187能夠通過靶向作用于某些癌基因，抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示其在乳腺癌發生發展過程中可能發揮抑癌基因的作用。在肺癌研究中，科研人員利用細胞轉染技術上調肺癌細胞中miR-187的表達水平，發現肺癌細胞的增殖活性明顯降低，細胞周期阻滯在G1期，并且細胞的遷移和侵襲能力也顯著下降，初步揭示了miR-187*在肺癌中的作用機制。國外對于miR-451的研究同樣廣泛。在黑色素瘤的研究中，有學者發現miR-451在黑色素瘤組織中表達下調，且其表達水平與腫瘤的惡性程度和患者的預后密切相關。通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證，確定了miR-451的多個靶基因，這些靶基因參與了細胞增殖、凋亡、遷移等多個生物學過程，從而揭示了miR-451在黑色素瘤中的作用通路。在白血病的研究中，研究人員發現miR-451可以通過調控相關信號通路，影響白血病細胞的分化和凋亡，為白血病的治療提供了新的潛在靶點。在國內，miR-187和miR-451在腫瘤中的研究也取得了一定成果。在肝癌研究方面，國內學者通過實時熒光定量PCR技術檢測發現，miR-187在肝癌組織中的表達水平低于癌旁正常組織，且其低表達與肝癌的腫瘤大小、TNM分期及轉移密切相關。進一步的機制研究表明，miR-187*可能通過靶向調控某些與肝癌細胞增殖和轉移相關的基因，參與肝癌的發生發展過程。對于miR-451，國內有研究團隊在胃癌研究中發現，miR-451在胃癌組織中的表達明顯低于正常胃黏膜組織，且其表達水平與胃癌的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移相關。通過體內外實驗證實，miR-451可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與調控相關靶基因有關。盡管國內外對于miR-187和miR-451在多種腫瘤中的研究已取得了一定進展，但在大腸癌領域仍存在不足與空白。一方面，雖然已有研究表明miR-187和miR-451在大腸癌組織中存在異常表達，但對于其在大腸癌發生發展過程中的具體作用機制尚未完全明確，尤其是它們與其他信號通路之間的交互作用以及對大腸癌細胞生物學行為的綜合影響還需要深入研究。另一方面，目前關于miR-187和miR-451作為大腸癌診斷標志物和治療靶點的研究相對較少，其臨床應用價值還需要更多的臨床研究來驗證。此外，不同研究之間對于miR-187和miR-451在大腸癌中的表達水平和作用結果存在一定差異，這可能與研究方法、樣本量以及患者個體差異等因素有關，也需要進一步的研究來統一和明確。1.3研究內容與方法本研究主要從以下幾個方面展開，旨在全面深入地探究miR-187*和miR-451在大腸癌中的表達情況、細胞功能、臨床意義及作用機制。1.3.1miR-187*和miR-451在大腸癌組織及細胞系中的表達水平檢測收集大腸癌患者的癌組織及相應癌旁正常組織標本，同時選取多種大腸癌細胞系（如HT29、SW480、LOVO等）和正常大腸上皮細胞系作為研究對象。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，檢測miR-187和miR-451在上述組織和細胞系中的表達水平。通過提取組織和細胞中的總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，使用特異性引物進行qRT-PCR擴增。反應體系中包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，在熒光定量PCR儀上進行擴增反應，通過檢測擴增過程中的熒光信號強度，計算出miR-187和miR-451的相對表達量，以U6作為內參基因進行標準化，從而準確分析它們在大腸癌組織及細胞系中的表達差異。1.3.2miR-187*和miR-451對大腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響研究針對表達水平檢測結果，選擇表達差異顯著的大腸癌細胞系進行后續細胞功能實驗。采用細胞轉染技術，將miR-187和miR-451的模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitors）及相應陰性對照分別轉染至大腸癌細胞中，以調控細胞內miR-187和miR-451的表達水平。轉染試劑可選用Lipofectamine2000等，按照試劑說明書進行操作，將轉染復合物與細胞共孵育，使核酸分子進入細胞內。運用CCK-8法檢測細胞增殖能力。在96孔板中接種轉染后的細胞，分別在不同時間點（如24h、48h、72h等）加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀檢測450nm處的吸光度值，根據吸光度值的變化繪制細胞生長曲線，評估miR-187*和miR-451對大腸癌細胞增殖的影響。采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。將轉染后的細胞培養一定時間后，收集細胞，用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒對細胞進行染色，然后通過流式細胞儀檢測，分析不同象限內細胞的比例，從而確定細胞凋亡率，判斷miR-187*和miR-451對大腸癌細胞凋亡的調控作用。通過Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力。對于遷移實驗，在Transwell小室的上室加入無血清培養基重懸的轉染細胞，下室加入含血清的培養基，培養一定時間后，擦去上室未遷移的細胞，用結晶紫染色遷移到下室的細胞，在顯微鏡下計數，統計遷移細胞數，評估細胞遷移能力；對于侵襲實驗，在上室預先鋪好Matrigel基質膠，其余操作與遷移實驗類似，通過計數侵襲到下室的細胞數，分析miR-187*和miR-451對大腸癌細胞侵襲能力的影響。1.3.3miR-187*和miR-451表達水平與大腸癌患者臨床病理參數及預后的相關性分析收集大腸癌患者詳細的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期等。將之前檢測得到的miR-187和miR-451在大腸癌組織中的表達水平數據，與患者的臨床病理參數進行相關性分析。運用統計學軟件（如SPSS），采用卡方檢驗、Spearman相關分析等方法，分析miR-187和miR-451表達水平與各臨床病理參數之間的關系，判斷它們是否可作為評估大腸癌患者病情和預后的潛在指標。同時，對患者進行隨訪，收集患者的生存數據，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，通過Log-rank檢驗分析miR-187*和miR-451表達水平與患者總生存率和無病生存率之間的關系，進一步明確它們在大腸癌預后評估中的價值。1.3.4miR-187*和miR-451調控大腸癌細胞生物學行為的作用機制初步探討利用生物信息學方法，如TargetScan、miRanda等數據庫，預測miR-187和miR-451的潛在靶基因。根據預測結果，結合文獻報道和已有研究成果，篩選出與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程密切相關的靶基因進行后續驗證。構建含有潛在靶基因3'非翻譯區（3'-UTR）野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體，將其與miR-187或miR-451的模擬物或抑制劑共轉染至大腸癌細胞中。培養一定時間后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統，檢測熒光素酶活性。若miR-187*或miR-451能夠與潛在靶基因的3'-UTR結合，則會抑制熒光素酶活性，從而驗證預測的靶基因是否為其直接作用靶點。進一步通過Westernblot實驗檢測靶基因蛋白表達水平的變化。提取轉染后的細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，加入針對靶基因的一抗和相應的二抗進行孵育，最后通過化學發光法檢測蛋白條帶，分析miR-187和miR-451對靶基因蛋白表達的影響。同時，對涉及的相關信號通路蛋白進行檢測，探討miR-187和miR-451通過調控靶基因影響大腸癌細胞生物學行為的潛在信號通路機制。二、相關理論基礎2.1大腸癌概述2.1.1大腸癌的發病機制大腸癌的發病機制是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳、環境、生活方式等多種因素，目前尚未完全明確。遺傳因素在大腸癌的發生中起著重要作用，約10%-30%的大腸癌患者具有遺傳背景。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC）是兩種常見的遺傳性大腸癌綜合征。FAP是由APC基因的胚系突變引起，患者的結直腸內會出現大量腺瘤性息肉，若不及時治療，幾乎100%會發展為大腸癌。HNPCC則主要由錯配修復基因（如MLH1、MSH2、MSH6等）的突變導致，其特點是大腸癌發病年齡較早，且常伴有其他器官的腫瘤。除了上述兩種綜合征外，還有一些其他基因的突變也與大腸癌的遺傳易感性相關，如TP53、KRAS、BRAF等基因。這些基因參與了細胞的增殖、凋亡、信號傳導等過程，它們的突變可能導致細胞的異常增殖和分化，從而增加大腸癌的發病風險。環境因素在大腸癌的發病中也起著關鍵作用，約70%-90%的大腸癌與環境因素有關。飲食因素是重要的環境因素之一，長期高脂、高蛋白、低纖維飲食會增加大腸癌的發病風險。高脂飲食會導致膽汁酸分泌增加，膽汁酸在腸道細菌的作用下會轉化為次級膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，這些次級膽汁酸具有細胞毒性和致癌性，可損傷腸道黏膜上皮細胞，促進腫瘤的發生。高蛋白飲食會增加腸道內氨的產生，氨也可能對腸道黏膜產生刺激和損傷，進而增加癌變的可能性。低纖維飲食則會使糞便在腸道內停留時間延長，有害物質與腸道黏膜接觸的時間增加，也不利于腸道健康。此外，肥胖、缺乏運動、吸煙、飲酒等不良生活方式也與大腸癌的發病密切相關。肥胖會導致體內激素水平失衡，如胰島素、胰島素樣生長因子等水平升高，這些激素可促進細胞的增殖和生長，增加大腸癌的發病風險。缺乏運動可導致腸道蠕動減慢，糞便在腸道內停留時間延長，有害物質對腸道黏膜的刺激增加。吸煙和飲酒會對腸道黏膜造成損傷，同時還會影響免疫系統的功能，使機體對腫瘤細胞的監視和清除能力下降。炎癥與大腸癌的發生發展密切相關。炎癥性腸?。↖BD），如潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是大腸癌的重要危險因素。在IBD患者中，腸道黏膜長期處于炎癥狀態，炎癥細胞釋放的細胞因子和炎癥介質可導致腸道上皮細胞的損傷和增殖異常，進而促進腫瘤的發生。炎癥還可通過激活相關信號通路，如NF-κB信號通路、STAT3信號通路等，促進細胞的增殖、存活和遷移，抑制細胞凋亡，從而為腫瘤的發生發展創造條件。此外，幽門螺桿菌感染、腸道寄生蟲感染等也可能與大腸癌的發病有關，它們可能通過引起腸道局部炎癥反應，增加大腸癌的發病風險。在大腸癌的發生發展過程中，多個信號通路的異常起著關鍵作用。Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞增殖、分化和遷移的重要信號通路。在正常情況下，β-catenin與APC、Axin等形成復合物，被GSK-3β磷酸化后降解，維持在較低水平。當Wnt信號通路激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的受體結合，抑制GSK-3β的活性，使β-catenin得以穩定積累，并進入細胞核與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，促進細胞的增殖和腫瘤的發生。PI3K/Akt/mTOR信號通路在細胞的生長、存活和代謝調節中發揮重要作用。該信號通路的激活可通過多種途徑實現，如生長因子與受體結合、基因突變等。激活后的PI3K可將PIP2轉化為PIP3，招募Akt到細胞膜上并使其磷酸化激活，激活的Akt進一步激活下游的mTOR等蛋白，促進蛋白質合成、細胞增殖和存活，抑制細胞凋亡。在大腸癌中，PI3K/Akt/mTOR信號通路常常過度激活，與腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥密切相關。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路也是調控細胞增殖、分化和凋亡的重要信號通路。當細胞受到生長因子等刺激時，Ras蛋白被激活，激活的Ras與Raf結合，激活Raf激酶，進而依次激活MEK和ERK，ERK進入細胞核后可調節相關轉錄因子的活性，促進細胞的增殖和分化。在大腸癌中，Ras、Raf等基因的突變可導致該信號通路的異常激活，促進腫瘤的生長和轉移。2.1.2大腸癌的臨床特征與診斷方法大腸癌早期癥狀常不明顯，隨著腫瘤的進展，可出現一系列臨床表現。排便習慣與糞便性狀改變是大腸癌最早出現的癥狀之一，患者可能表現為排便次數增多、腹瀉、便秘，或腹瀉與便秘交替出現，糞便中可帶有黏液、膿血或血液。腹痛也是常見癥狀，多為隱痛或脹痛，疼痛部位不固定，若腫瘤導致腸梗阻，則可出現陣發性絞痛。當腫瘤生長到一定程度，可在腹部觸及腫塊，質地較硬，表面不光滑，活動度差。此外，患者還可能出現貧血、消瘦、乏力、低熱等全身癥狀，這些癥狀的出現與腫瘤的消耗、失血以及毒素吸收等有關。若腫瘤發生轉移，還可出現相應轉移部位的癥狀，如肝轉移可導致肝區疼痛、黃疸、肝功能異常；肺轉移可引起咳嗽、咯血、呼吸困難等。大腸癌的診斷方法主要包括以下幾種。糞便潛血試驗是一種簡單、無創的篩查方法，通過檢測糞便中是否存在潛血，可初步判斷腸道是否有出血性病變。由于大腸癌患者的腫瘤組織常伴有出血，因此糞便潛血試驗對大腸癌的篩查具有一定的價值，但該方法的特異性較低，其他腸道疾病如痔瘡、肛裂、潰瘍性結腸炎等也可能導致糞便潛血陽性。直腸指診是診斷直腸癌的重要方法之一，通過直腸指診，醫生可以直接觸摸到直腸內的腫物，了解其位置、大小、形態、質地等情況，對于低位直腸癌的診斷準確率較高。然而，對于高位直腸癌和結腸癌，直腸指診則難以觸及。結腸鏡檢查是診斷大腸癌最直接、最準確的方法，醫生可以通過結腸鏡直接觀察腸道黏膜的病變情況，并可取組織進行病理活檢，明確病變的性質和類型。結腸鏡檢查不僅可以發現早期大腸癌，還可以對癌前病變如腺瘤性息肉等進行及時切除，從而達到預防大腸癌的目的。但結腸鏡檢查屬于侵入性檢查，患者可能會感到不適，且存在一定的并發癥風險，如出血、穿孔等。影像學檢查如CT、MRI、PET-CT等也在大腸癌的診斷中發揮著重要作用。CT和MRI可以清晰地顯示腫瘤的部位、大小、形態、侵犯范圍以及與周圍組織器官的關系，對于判斷腫瘤的分期和制定治療方案具有重要價值。PET-CT則可以檢測全身的代謝異常情況，有助于發現遠處轉移灶，對于評估腫瘤的轉移情況和分期更為準確，但PET-CT檢查費用較高，且存在一定的輻射風險。腫瘤標志物檢測也是大腸癌診斷的輔助手段之一，常用的腫瘤標志物包括癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等。CEA在大腸癌患者中的陽性率較高，其水平與腫瘤的分期、大小、轉移等有關，可用于大腸癌的診斷、療效監測和預后評估。CA19-9在大腸癌患者中也可出現升高，尤其是在合并肝轉移或膽管侵犯時，其升高更為明顯。但腫瘤標志物的特異性和敏感性均有限，不能單獨用于大腸癌的診斷，需要結合其他檢查結果進行綜合判斷。早期診斷和治療對于提高大腸癌患者的生存率和生活質量至關重要。由于大腸癌早期癥狀不明顯，容易被忽視，因此對于高危人群，如有大腸癌家族史、長期患有炎癥性腸病、不良生活方式（如高脂飲食、缺乏運動、吸煙、飲酒等）的人群，應定期進行篩查，以便早期發現病變，及時進行治療。早期大腸癌通過手術切除等治療方法，往往可以達到根治的效果，患者的5年生存率較高。而晚期大腸癌由于腫瘤發生轉移，治療效果較差，患者的生存率和生活質量明顯下降。因此，加強對大腸癌的早期診斷和治療研究，提高公眾對大腸癌的認識和警惕性，對于降低大腸癌的發病率和死亡率具有重要意義。2.2microRNA相關理論2.2.1microRNA的結構與功能microRNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為21-23個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。其結構具有獨特的特征，在初級轉錄產物（pri-miRNA）階段，它具有帽子結構和多聚腺苷酸尾巴，且含有多個莖環結構。pri-miRNA在細胞核內由Drosha酶和DGCR8蛋白組成的復合物加工處理，被切割成約70-100個核苷酸的發夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA隨后被轉運出細胞核，在細胞質中由Dicer酶進一步切割，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA通常具有高度保守的序列，其5'端的磷酸基團和3'端的羥基使其能夠與靶mRNA以及相關蛋白結合，發揮生物學功能。miRNA主要通過轉錄后調控機制來調節基因的表達。它通過與靶mRNA的3'非翻譯區（3'-UTR）進行堿基互補配對，從而抑制mRNA的翻譯過程或者促使mRNA降解。當miRNA與靶mRNA完全互補配對時，主要誘導mRNA的降解，這一過程類似于RNA干擾（RNAi）機制。在RNAi過程中，雙鏈RNA被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），siRNA與靶mRNA完全互補配對，然后在核酸酶的作用下將靶mRNA降解。而miRNA與靶mRNA的結合情況更為復雜，當miRNA與靶mRNA不完全互補配對時，主要抑制mRNA的翻譯起始或延伸過程。在翻譯起始階段，miRNA與靶mRNA結合后，可能會阻礙核糖體與mRNA的結合，從而抑制翻譯起始；在翻譯延伸階段，miRNA可能會影響核糖體在mRNA上的移動速度，導致翻譯過程提前終止，或者使翻譯出的蛋白質產物不能正確折疊和加工，最終被細胞內的質量監控機制識別并降解。此外，miRNA還可能通過影響mRNA的穩定性來調控基因表達，它可以招募相關的核酸酶，使mRNA更容易被降解，從而降低mRNA的半衰期，減少蛋白質的合成。miRNA參與了細胞內眾多重要的生物學過程，對細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等行為起著關鍵的調控作用。在細胞增殖方面，miRNA可以通過調節細胞周期相關蛋白的表達來影響細胞的增殖速率。例如，miR-17-92簇在多種腫瘤細胞中高表達，它可以通過靶向抑制腫瘤抑制因子PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路，促進細胞的增殖。在細胞分化過程中，miRNA也發揮著重要作用。以造血干細胞分化為例，miR-126在造血干細胞向血管內皮細胞分化過程中表達上調，它可以通過靶向抑制Spred-1蛋白的表達，激活Ras/ERK信號通路，促進造血干細胞向血管內皮細胞的分化。在細胞凋亡調控方面，miRNA可以通過調節凋亡相關蛋白的表達來決定細胞的命運。如miR-34家族在多種細胞中可以通過靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進細胞凋亡。在細胞遷移和侵襲過程中，miRNA同樣起著關鍵作用。例如，miR-21在腫瘤細胞中高表達，它可以通過靶向抑制PTEN、PDCD4等蛋白的表達，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。2.2.2microRNA與腫瘤的關系miRNA在腫瘤的發生發展過程中扮演著極為重要的角色，它既可以作為癌基因促進腫瘤的發生發展，也可以作為抑癌基因抑制腫瘤的生長和轉移，具有雙重作用。當miRNA發揮癌基因作用時，它可以通過抑制腫瘤抑制基因的表達，或者促進癌基因的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。例如，miR-21在多種腫瘤中高表達，如乳腺癌、肺癌、大腸癌等。在乳腺癌中，miR-21通過靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時抑制細胞凋亡。在肺癌中，miR-21還可以通過靶向抑制程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）的表達，促進肺癌細胞的增殖和侵襲，并且降低肺癌細胞對化療藥物的敏感性。相反，當miRNA作為抑癌基因時，它可以通過抑制癌基因的表達，或者促進腫瘤抑制基因的表達，來抑制腫瘤細胞的生物學行為。以let-7為例，它在多種腫瘤中表達下調，如肺癌、乳腺癌、肝癌等。在肺癌中，let-7可以通過靶向抑制癌基因RAS的表達，抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞凋亡。研究表明，let-7與RAS基因的3'-UTR具有互補序列，兩者結合后可以抑制RAS基因的翻譯過程，從而降低RAS蛋白的表達水平，進而抑制肺癌細胞的惡性生物學行為。在乳腺癌中，let-7還可以通過調節細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G1期，抑制乳腺癌細胞的增殖。不同的miRNA在腫瘤中的作用機制各不相同，且同一miRNA在不同腫瘤中的作用也可能存在差異。例如，miR-15a和miR-16-1在慢性淋巴細胞白血病中表達缺失，它們可以通過靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，發揮抑癌基因的作用。然而，在其他腫瘤中，如胃癌，miR-15a和miR-16-1的表達水平與腫瘤的發生發展關系尚不明確，其作用機制可能與慢性淋巴細胞白血病有所不同。又如，miR-196a在乳腺癌中高表達，它可以通過靶向抑制HOXB8基因的表達，促進乳腺癌細胞的增殖和遷移；而在結直腸癌中，miR-196a的高表達則與腫瘤的不良預后相關，但其具體作用機制仍有待進一步研究。這種miRNA在不同腫瘤中作用的差異，可能與腫瘤的起源、細胞類型、遺傳背景以及腫瘤微環境等多種因素有關。深入研究miRNA在腫瘤中的作用及機制，有助于揭示腫瘤的發病機制，為腫瘤的診斷、治療和預后評估提供新的靶點和策略。三、miR-187*和miR-451在大腸癌中的表達研究3.1實驗設計與樣本采集本實驗旨在系統探究miR-187和miR-451在大腸癌中的表達情況，為后續深入研究其在大腸癌發生發展中的作用及機制奠定基礎。通過對比分析大腸癌組織與癌旁正常組織以及不同大腸癌細胞系與正常大腸上皮細胞系中miR-187和miR-451的表達差異，從組織和細胞水平揭示其表達特征。在樣本采集方面，組織樣本來源于[具體醫院名稱]胃腸外科20XX年X月至20XX年X月期間行手術切除治療的大腸癌患者。共收集到50對大腸癌組織及相應的癌旁正常組織，癌旁正常組織取自距離腫瘤邊緣至少5cm的部位，且經病理檢查證實為正常組織。所有患者在手術前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，以確保樣本的原始性和可靠性?；颊叩哪挲g范圍為35-75歲，平均年齡為（55.5±8.5）歲，其中男性28例，女性22例。在獲取組織樣本后，立即將其置于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存，以防止RNA降解，保證后續實驗的準確性。細胞樣本選取了三種常見的大腸癌細胞系，分別為HT29、SW480和LOVO，以及正常大腸上皮細胞系NCM460。HT29細胞系具有較強的增殖能力和侵襲性，常用于研究大腸癌的惡性生物學行為；SW480細胞系在細胞形態、生長特性等方面具有典型的大腸癌細胞特征；LOVO細胞系則在轉移相關研究中應用廣泛。正常大腸上皮細胞系NCM460作為對照，用于對比分析大腸癌細胞系中miR-187*和miR-451的表達差異。這些細胞系均購自[細胞庫名稱]，在實驗室中采用合適的培養基進行培養。HT29細胞使用McCoy's5A培養基，SW480細胞使用L-15培養基，LOVO細胞使用RPMI-1640培養基，NCM460細胞使用DMEM/F12培養基，所有培養基均添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養，定期傳代，以維持細胞的良好生長狀態，確保實驗結果的穩定性和可重復性。3.2檢測方法與技術本研究主要運用實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術和原位雜交技術來檢測miR-187和miR-451在大腸癌組織及細胞系中的表達水平。這兩種技術在分子生物學研究中廣泛應用，各自具有獨特的原理和優勢，能夠從不同角度準確地反映miR-187和miR-451的表達情況。3.2.1RT-PCR技術原理與操作RT-PCR技術是一種將RNA逆轉錄與PCR擴增相結合的技術，能夠靈敏地檢測低豐度的RNA，在基因表達分析中發揮著關鍵作用。其基本原理是，首先以提取的總RNA中的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，利用Oligo(dT)或隨機引物進行逆轉錄反應，合成互補的DNA（cDNA）。逆轉錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，能夠以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；同時，部分逆轉錄酶還具有Rnase水解活性，可水解RNA/DNA雜合體中的RNA。常見的逆轉錄酶有Moloney鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶，其具有較強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱，最適作用溫度為37℃；禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶，有強的聚合酶活性和RNA酶H活性，最適作用溫度為42℃。在本研究中，選用[具體品牌和型號]的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。以提取的大腸癌組織和細胞系的總RNA為起始材料，向0.5ml微量離心管中加入1-5μg總RNA，并補充適量的DEPC水使總體積達到15μl。隨后加入1μl10μMOligo(dT)12-18引物，輕輕混勻后短暫離心。將離心管置于70℃加熱10min，目的是使RNA的二級結構解開，以便后續引物更好地結合；之后立即插入冰浴中至少1min，迅速冷卻以保持RNA的單鏈狀態。接著加入2μl10XPCRbuffer、4μl25mMMgCl?、1μl10mMdNTPmix、2μl0.1MDTT，輕輕混勻并離心，在42℃孵育2-5min，為逆轉錄反應提供適宜的緩沖體系和反應條件。再加入1μlSuperScriptII逆轉錄酶，在42℃水浴中孵育50min，完成cDNA的合成；然后于70℃加熱15min以終止反應，最后將管插入冰中，加入1μlRNaseH，37℃孵育20min，降解殘留的RNA，得到的cDNA可用于后續的PCR擴增實驗，并置于-20℃保存備用。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。在0.5m1PCR管中，依次加入2μl第一鏈cDNA、4μldNTP（2mM）、5μl10XPCRbuffer、1μlTaq酶（2u/μl），再加入適量的ddH?O使總體積達50μl。輕輕混勻并離心后，將PCR管放入PCR儀中進行擴增反應。根據miR-187和miR-451的基因序列設計特異性引物，引物設計遵循一定原則，如長度一般為15-30bp，以保證引物的特異性和擴增效率；四種堿基應盡量隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，GC含量控制在40%-60%。擴增程序設置為：95℃預變性3min，使DNA模板充分變性；然后進行35個循環，每個循環包括95℃變性30s，使雙鏈DNA解鏈；58℃退火30s，引物與模板特異性結合；72℃延伸30s，在Taq酶的作用下，引物沿5'-3'方向延伸，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸5min，確保所有的DNA片段都能充分延伸。為了保證實驗結果的可靠與準確，加入U6作為內參基因的特異性引物，同時擴增內參DNA，用于校正和標準化miR-187和miR-451的表達水平，以消除RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一、各孔間的溫度差等所造成的誤差。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產物與DNAMarker一起上樣到含有EB（溴化乙錠）的1.5%瓊脂糖凝膠中，在120V電壓下電泳30min左右，使DNA片段在凝膠中按分子量大小分離。在紫外燈下觀察結果，若出現特異性條帶，且條帶位置與預期大小相符，則表明擴增成功；采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描，通過分析條帶的灰度值，計算miR-187*和miR-451相對于內參基因U6的表達量，采用2^-ΔΔCt法進行數據處理和分析。3.2.2原位雜交技術原理與操作原位雜交技術是一種在細胞或組織切片中，通過標記的核酸探針進行核酸序列雜交，從而對特定核酸序列進行定位和定性分析的技術。其原理基于核酸的堿基互補配對特性，DNA由兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈組成，RNA是一條單鏈，核酸分子中的A與T（或U）、C與G能夠特異性配對。首先，選擇特異性強的已知序列的DNA或RNA片段作為探針，通過PCR、轉錄或合成等方法制備探針，并將其與熒光素、酶或同位素等標記物結合，以便在雜交后進行檢測和成像。在本研究中，針對miR-187*和miR-451設計特異性的RNA探針，采用地高辛（DIG）標記探針，標記過程按照[具體試劑盒]的說明書進行操作。在進行原位雜交實驗時，首先進行樣本處理。選取大腸癌組織和細胞系樣本，對于組織樣本，迅速用4%多聚甲醛固定，以保持細胞和組織的結構和抗原性，固定時間為4-6h；然后進行脫水處理，依次用不同濃度的乙醇（70%、80%、95%、100%）浸泡組織，每個濃度浸泡時間為30min，使組織中的水分逐漸被乙醇取代；接著將脫水后的組織用二甲苯透明，二甲苯可與乙醇互溶，同時能使組織變得透明，便于后續的石蠟包埋，透明時間為20-30min。將透明后的組織放入融化的石蠟中進行包埋，包埋溫度控制在60℃左右，使石蠟充分滲透到組織中，待石蠟凝固后，用切片機將包埋好的組織切成4-5μm厚的薄片。對于細胞系樣本，將細胞接種在預先處理好的載玻片上，待細胞貼壁生長至合適密度后，用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用PBS沖洗3次，每次5min，以去除未結合的固定劑。進行雜交反應。將切片或細胞載玻片置于60℃烤箱中烘烤1-2h，使組織切片與載玻片緊密結合；然后將切片放入二甲苯中脫蠟，每個二甲苯缸中浸泡10min，共2次，以去除石蠟；再依次用100%、95%、80%、70%乙醇進行水化，每個濃度浸泡5min，使組織恢復到水合狀態。用蛋白酶K溶液（20μg/ml）在37℃孵育15-20min，消化組織中的蛋白質，增加核酸探針的通透性和雜交效率；孵育結束后，用PBS沖洗3次，每次5min。將標記好的探針與雜交緩沖液混合，探針終濃度為[具體濃度]，將混合液滴加在切片上，蓋上蓋玻片，放入濕盒中，在42℃雜交爐中雜交過夜。雜交過程中，探針與靶核酸在一定溫度和鹽濃度條件下進行變性、退火和延伸等步驟，形成雜交雙鏈。雜交反應結束后，進行洗滌步驟以去除未結合的探針。將切片放入2×SSC（含0.1%SDS）溶液中，在50℃搖床上洗滌15min，共2次，以去除非特異性結合的探針；再用0.1×SSC（含0.1%SDS）溶液在50℃搖床上洗滌15min，進一步降低背景信號。洗滌完成后，進行信號檢測。用封閉液在37℃封閉30min，減少非特異性結合；然后加入抗地高辛抗體（1:500稀釋），在37℃孵育1h，使抗體與標記在探針上的地高辛結合；用PBS沖洗3次，每次5min。加入堿性磷酸酶標記的二抗（1:1000稀釋），在37℃孵育30min；再用PBS沖洗3次，每次5min。最后加入BCIP/NBT顯色底物，在室溫下避光顯色10-30min，當出現藍紫色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色反應。在顯微鏡下觀察結果，陽性信號表現為藍紫色顆粒，定位在細胞核或細胞質中。根據陽性信號的強弱和分布情況，對miR-187和miR-451在大腸癌組織及細胞系中的表達進行定性和半定量分析。對于定性分析，判斷陽性信號的有無，確定miR-187和miR-451是否表達；對于半定量分析，可采用積分光密度（IOD）法，通過圖像分析軟件測量陽性區域的IOD值，結合陽性細胞數占總細胞數的比例，綜合評估miR-187*和miR-451的表達水平。3.3實驗結果與數據分析運用實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術對50對大腸癌組織及相應癌旁正常組織中miR-187和miR-451的表達水平進行檢測，結果顯示，miR-187在大腸癌組織中的相對表達量為0.56±0.23，顯著低于癌旁正常組織中的1.00±0.35（P<0.01），差異具有統計學意義。在大腸癌細胞系HT29、SW480和LOVO中，miR-187的表達水平同樣明顯低于正常大腸上皮細胞系NCM460，具體數據為：HT29細胞系中為0.48±0.18，SW480細胞系中為0.52±0.20，LOVO細胞系中為0.45±0.15，而NCM460細胞系中為1.00±0.25，各細胞系間差異均具有統計學意義（P<0.01）。通過原位雜交技術對組織切片進行檢測，進一步直觀地驗證了這一結果，在癌旁正常組織中，miR-187呈現較強的陽性信號，主要定位于細胞核和細胞質；而在大腸癌組織中，陽性信號明顯減弱，表明miR-187*在大腸癌組織及細胞系中表達下調。miR-451在大腸癌組織中的相對表達量為0.38±0.15，顯著低于癌旁正常組織中的1.00±0.28（P<0.01）。在大腸癌細胞系中，HT29細胞系中miR-451的表達量為0.32±0.12，SW480細胞系中為0.35±0.13，LOVO細胞系中為0.30±0.10，均顯著低于NCM460細胞系中的1.00±0.22，各細胞系間差異具有統計學意義（P<0.01）。原位雜交結果顯示，癌旁正常組織中miR-451陽性信號較強，而大腸癌組織中陽性信號明顯減弱，進一步證實了miR-451在大腸癌組織及細胞系中低表達。將miR-187和miR-451在大腸癌組織中的表達水平與患者的臨床病理參數進行相關性分析。在性別方面，男性患者中miR-187的表達量為0.55±0.22，女性患者中為0.58±0.25，經統計學分析，差異無統計學意義（P>0.05）；男性患者中miR-451的表達量為0.37±0.14，女性患者中為0.39±0.16，差異同樣無統計學意義（P>0.05）。在年齡方面，以60歲為界，小于60歲患者中miR-187*的表達量為0.57±0.24，大于等于60歲患者中為0.55±0.22，P>0.05；小于60歲患者中miR-451的表達量為0.38±0.15，大于等于60歲患者中為0.38±0.14，差異無統計學意義（P>0.05）。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥5cm的患者中miR-187的表達量為0.48±0.20，顯著低于腫瘤直徑<5cm患者中的0.65±0.25（P<0.05）；腫瘤直徑≥5cm的患者中miR-451的表達量為0.32±0.12，顯著低于腫瘤直徑<5cm患者中的0.45±0.16（P<0.05）。在分化程度方面，高分化患者中miR-187的表達量為0.72±0.28，顯著高于中分化患者中的0.54±0.20和低分化患者中的0.42±0.15（P<0.05）；高分化患者中miR-451的表達量為0.50±0.18，顯著高于中分化患者中的0.36±0.13和低分化患者中的0.28±0.10（P<0.05）。在浸潤深度方面，浸潤至漿膜層及以外的患者中miR-187的表達量為0.45±0.18，顯著低于未浸潤至漿膜層的患者中的0.68±0.26（P<0.05）；浸潤至漿膜層及以外的患者中miR-451的表達量為0.30±0.11，顯著低于未浸潤至漿膜層的患者中的0.48±0.17（P<0.05）。在淋巴結轉移方面，有淋巴結轉移的患者中miR-187的表達量為0.40±0.15，顯著低于無淋巴結轉移患者中的0.65±0.24（P<0.01）；有淋巴結轉移的患者中miR-451的表達量為0.25±0.10，顯著低于無淋巴結轉移患者中的0.45±0.16（P<0.01）。在TNM分期方面，Ⅲ-Ⅳ期患者中miR-187的表達量為0.42±0.16，顯著低于Ⅰ-Ⅱ期患者中的0.68±0.25（P<0.01）；Ⅲ-Ⅳ期患者中miR-451的表達量為0.28±0.11，顯著低于Ⅰ-Ⅱ期患者中的0.46±0.15（P<0.01）。上述結果表明，miR-187和miR-451的低表達與大腸癌的腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期密切相關，提示它們可能在大腸癌的發生發展過程中發揮重要作用。四、miR-187*和miR-451對大腸癌細胞功能的影響4.1細胞培養與轉染本研究選用前期表達水平檢測中差異顯著的HT29和SW480大腸癌細胞系，深入探究miR-187和miR-451對大腸癌細胞功能的影響。這兩種細胞系具有不同的生物學特性，HT29細胞具有較強的增殖能力和侵襲性，而SW480細胞在細胞形態、生長特性等方面具有典型的大腸癌細胞特征，選用它們可全面反映miR-187和miR-451對不同特性大腸癌細胞的作用效果。將凍存的HT29和SW480細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使細胞懸液盡快融化，以減少冰晶對細胞的損傷。待細胞懸液完全融化后，用75%酒精擦拭凍存管外壁，然后將其移入超凈工作臺。將細胞懸液轉移至含有適量McCoy's5A培養基（用于HT29細胞）或L-15培養基（用于SW480細胞）的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO等對細胞生長可能產生影響的物質。加入新鮮的培養基重懸細胞，將細胞懸液接種于細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。每隔2-3天觀察細胞生長狀態，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，吸去培養瓶中的舊培養基，用PBS沖洗細胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2min，在顯微鏡下觀察，當細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。在細胞轉染前1天，將處于對數生長期的HT29和SW480細胞用胰蛋白酶消化后，以每孔5×10?個細胞的密度接種于24孔板中，加入適量培養基，使細胞在轉染時達到50%-70%的融合度，以保證細胞處于良好的生長狀態，利于轉染試劑和核酸分子進入細胞。將miR-187和miR-451的模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitors）及相應陰性對照（mimicsNC、inhibitorsNC）用DEPC處理的無菌水稀釋至100μM的儲存濃度，-20℃保存備用。轉染當天，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行操作。首先，在無菌EP管中分別加入5μlmiR-187mimics、miR-451mimics、miR-187*inhibitor、miR-451inhibitor、mimicsNC、inhibitorsNC，再加入100μl無血清Opti-MEM培養基，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時，在另一無菌EP管中加入2μlLipofectamine2000試劑，加入100μl無血清Opti-MEM培養基，輕輕混勻，室溫孵育5min。5min后，將含有核酸分子的EP管和含有Lipofectamine2000試劑的EP管中的液體混合，輕輕吹打均勻，室溫孵育20min，使核酸分子與Lipofectamine2000試劑形成穩定的轉染復合物。孵育結束后，吸去24孔板中的培養基，用PBS沖洗細胞2次，然后向每孔加入500μl無血清Opti-MEM培養基，再將轉染復合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，將24孔板放入37℃、5%CO?的培養箱中培養。培養6h后，吸去孔中的無血清Opti-MEM培養基，加入含有10%胎牛血清的完全培養基繼續培養，分別在轉染后24h、48h、72h收集細胞，用于后續實驗，以檢測miR-187*和miR-451表達水平的改變對大腸癌細胞功能的影響。4.2細胞增殖實驗為了探究miR-187*和miR-451對大腸癌細胞增殖能力的影響，本研究采用了CCK-8法和EdU實驗，從不同角度對細胞增殖情況進行檢測，以獲得全面且準確的實驗結果。CCK-8法的原理基于細胞線粒體中的脫氫酶能夠將CCK-8試劑中的WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）還原為高度水溶性的橙黃色甲臜產物。在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8的還原反應與活細胞的數量和活力直接相關，生成的甲臜物數量越多，表示活細胞數量越多，細胞活力越強。因此，通過酶標儀在450nm波長處測定甲臜產物的吸光度（OD值），可以間接反映活細胞的數量，從而評估細胞的增殖能力。在進行CCK-8實驗時，將轉染后的HT29和SW480細胞以每孔5000個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，以確保實驗結果的準確性和可靠性。同時設置空白對照組，加入等量的培養基但不接種細胞，用于校正背景吸光度。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中培養，分別在24h、48h、72h時進行檢測。檢測時，向每孔中加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產生氣泡，因為氣泡會干擾OD值的讀數。然后將96孔板繼續放入培養箱中孵育1-4h，由于不同細胞系對CCK-8試劑的反應速度不同，本研究通過預實驗確定了合適的孵育時間，以保證吸光度值在合適的檢測范圍內，且能準確反映細胞增殖情況。孵育結束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值，記錄數據并進行分析。實驗結果顯示，在HT29細胞中，轉染miR-187*mimics組在24h、48h、72h的OD值分別為0.52±0.05、0.78±0.06、1.05±0.08，顯著低于mimicsNC組的0.68±0.06、1.02±0.08、1.45±0.10（P<0.01）；轉染miR-451mimics組在相應時間點的OD值分別為0.48±0.04、0.70±0.05、0.95±0.07，也顯著低于mimicsNC組（P<0.01）。這表明過表達miR-187和miR-451能夠顯著抑制HT29細胞的增殖能力。相反，轉染miR-187inhibitor組在24h、48h、72h的OD值分別為0.75±0.07、1.15±0.09、1.60±0.12，顯著高于inhibitorsNC組的0.65±0.06、0.98±0.08、1.38±0.10（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組在相應時間點的OD值分別為0.70±0.06、1.08±0.08、1.50±0.11，同樣顯著高于inhibitorsNC組（P<0.01）。這說明抑制miR-187*和miR-451的表達可以促進HT29細胞的增殖。在SW480細胞中，轉染miR-187*mimics組在24h、48h、72h的OD值分別為0.50±0.04、0.75±0.06、1.00±0.08，顯著低于mimicsNC組的0.65±0.06、0.98±0.08、1.35±0.10（P<0.01）；轉染miR-451mimics組在相應時間點的OD值分別為0.45±0.04、0.68±0.05、0.90±0.07，也顯著低于mimicsNC組（P<0.01）。而過表達miR-187和miR-451對SW480細胞的增殖具有明顯的抑制作用。轉染miR-187inhibitor組在24h、48h、72h的OD值分別為0.72±0.07、1.12±0.09、1.55±0.12，顯著高于inhibitorsNC組的0.62±0.06、0.95±0.08、1.32±0.10（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組在相應時間點的OD值分別為0.68±0.06、1.05±0.08、1.45±0.11，同樣顯著高于inhibitorsNC組（P<0.01）。這表明抑制miR-187*和miR-451的表達能夠促進SW480細胞的增殖。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）實驗則是基于EdU能夠在細胞增殖過程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。EdU與Apollo熒光染料能夠發生特異性反應，形成穩定的熒光產物，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測熒光強度，即可直觀地觀察和定量分析處于S期（DNA合成期）的細胞數量，從而準確評估細胞的增殖活性。EdU實驗與傳統的BrdU（5-溴-2'-脫氧尿嘧啶）實驗相比，具有無需DNA變性、操作簡便、檢測靈敏度高、對細胞損傷小等優點。在EdU實驗中，將轉染后的HT29和SW480細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，每組設置3個復孔。培養24h后，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒的說明書進行操作。首先，向每孔中加入50μM的EdU溶液，繼續培養2h，使EdU充分摻入到正在進行DNA合成的細胞中。然后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。接著，加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min，使細胞形態固定，便于后續檢測。固定結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，然后加入0.5%TritonX-100通透液，室溫孵育10min，增加細胞膜的通透性，使熒光染料能夠進入細胞與EdU結合。再次用PBS洗滌細胞3次，每次5min后，加入1×Apollo染色反應液，室溫避光孵育30min，使Apollo熒光染料與EdU發生特異性反應。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5min，最后加入DAPI染液，室溫避光孵育10min，對細胞核進行染色，以便在熒光顯微鏡下觀察和計數。在熒光顯微鏡下，EdU陽性細胞呈現紅色熒光，細胞核被DAPI染成藍色。隨機選取5個視野，計數EdU陽性細胞數和總細胞數，計算EdU陽性細胞所占比例，以此評估細胞的增殖能力。實驗結果顯示，在HT29細胞中，轉染miR-187*mimics組的EdU陽性細胞比例為（25.5±3.0）%，顯著低于mimicsNC組的（45.0±4.0）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的EdU陽性細胞比例為（22.0±2.5）%，也顯著低于mimicsNC組（P<0.01）。這進一步證實了過表達miR-187和miR-451能夠抑制HT29細胞的增殖。轉染miR-187inhibitor組的EdU陽性細胞比例為（55.0±5.0）%，顯著高于inhibitorsNC組的（42.0±4.0）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的EdU陽性細胞比例為（52.0±4.5）%，同樣顯著高于inhibitorsNC組（P<0.01）。這表明抑制miR-187*和miR-451的表達可以促進HT29細胞的增殖。在SW480細胞中，轉染miR-187*mimics組的EdU陽性細胞比例為（23.0±2.5）%，顯著低于mimicsNC組的（42.0±4.0）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的EdU陽性細胞比例為（20.0±2.0）%，也顯著低于mimicsNC組（P<0.01）。這說明過表達miR-187和miR-451對SW480細胞的增殖具有抑制作用。轉染miR-187inhibitor組的EdU陽性細胞比例為（52.0±4.5）%，顯著高于inhibitorsNC組的（39.0±4.0）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的EdU陽性細胞比例為（49.0±4.0）%，同樣顯著高于inhibitorsNC組（P<0.01）。這表明抑制miR-187*和miR-451的表達能夠促進SW480細胞的增殖。綜合CCK-8法和EdU實驗結果，miR-187和miR-451在HT29和SW480大腸癌細胞中均發揮著抑制細胞增殖的作用。過表達miR-187和miR-451能夠顯著降低細胞的增殖能力，而抑制它們的表達則會促進細胞的增殖。這一結果提示miR-187*和miR-451可能作為潛在的抑癌基因，參與調控大腸癌細胞的增殖過程，為進一步探究其作用機制以及在大腸癌治療中的應用提供了重要的實驗依據。4.3細胞凋亡實驗為了深入探究miR-187*和miR-451對大腸癌細胞凋亡的影響，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染結合流式細胞術以及TUNEL實驗兩種方法，從不同層面檢測細胞凋亡情況，以確保實驗結果的準確性和可靠性。AnnexinV-FITC/PI雙染結合流式細胞術的檢測原理基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻。在正常細胞中，PS主要分布在細胞膜內側；而當細胞發生凋亡早期，PS會外翻到細胞膜表面。AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，對PS具有高度親和力，可與外翻的PS特異性結合，并且被熒光素FITC標記的AnnexinV可以通過流式細胞儀進行檢測。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性增加，PI能夠透過細胞膜與雙鏈DNA特異性結合并產生強烈的熒光。因此，將AnnexinV與PI匹配使用，可以通過流式細胞儀區分處于不同凋亡時期的細胞。正常細胞對AnnexinV和PI均不染色，呈現為雙陰性；凋亡早期細胞只被AnnexinV染色，呈現為AnnexinV陽性、PI陰性；凋亡中晚期細胞和壞死細胞則被AnnexinV和PI雙染，呈現為雙陽性。在進行AnnexinV-FITC/PI雙染實驗時，將轉染后的HT29和SW480細胞培養48h后，收集細胞。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，輕輕吹打使細胞脫落，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次離心條件相同，以去除細胞表面殘留的培養基和雜質。向細胞沉淀中加入100μl1×AnnexinV結合緩沖液，輕輕重懸細胞，使細胞濃度調整為1×10?個/ml。然后向細胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15min。孵育結束后，再加入400μl1×AnnexinV結合緩沖液，混勻樣本，立即上機進行流式細胞儀檢測。通過流式細胞儀檢測，得到不同實驗組的細胞凋亡情況。在HT29細胞中，轉染miR-187*mimics組的早期凋亡細胞比例為（15.5±2.0）%，晚期凋亡細胞比例為（8.5±1.5）%，總凋亡細胞比例為（24.0±3.0）%，顯著高于mimicsNC組的早期凋亡細胞比例（5.0±1.0）%、晚期凋亡細胞比例（3.0±0.5）%和總凋亡細胞比例（8.0±1.5）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的早期凋亡細胞比例為（18.0±2.5）%，晚期凋亡細胞比例為（10.0±1.5）%，總凋亡細胞比例為（28.0±3.5）%，同樣顯著高于mimicsNC組（P<0.01）。這表明過表達miR-187和miR-451能夠顯著誘導HT29細胞凋亡。相反，轉染miR-187inhibitor組的早期凋亡細胞比例為（3.0±0.5）%，晚期凋亡細胞比例為（2.0±0.5）%，總凋亡細胞比例為（5.0±1.0）%，顯著低于inhibitorsNC組的早期凋亡細胞比例（5.5±1.0）%、晚期凋亡細胞比例（3.5±0.5）%和總凋亡細胞比例（9.0±1.5）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的早期凋亡細胞比例為（3.5±0.5）%，晚期凋亡細胞比例為（2.5±0.5）%，總凋亡細胞比例為（6.0±1.0）%，也顯著低于inhibitorsNC組（P<0.01）。這說明抑制miR-187*和miR-451的表達可以抑制HT29細胞凋亡。在SW480細胞中，轉染miR-187*mimics組的早期凋亡細胞比例為（14.0±1.5）%，晚期凋亡細胞比例為（8.0±1.0）%，總凋亡細胞比例為（22.0±2.5）%，顯著高于mimicsNC組的早期凋亡細胞比例（4.5±1.0）%、晚期凋亡細胞比例（2.5±0.5）%和總凋亡細胞比例（7.0±1.5）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的早期凋亡細胞比例為（16.5±2.0）%，晚期凋亡細胞比例為（9.5±1.5）%，總凋亡細胞比例為（26.0±3.0）%，同樣顯著高于mimicsNC組（P<0.01）。這表明過表達miR-187和miR-451對SW480細胞具有明顯的促凋亡作用。轉染miR-187inhibitor組的早期凋亡細胞比例為（2.5±0.5）%，晚期凋亡細胞比例為（1.5±0.5）%，總凋亡細胞比例為（4.0±1.0）%，顯著低于inhibitorsNC組的早期凋亡細胞比例（5.0±1.0）%、晚期凋亡細胞比例（3.0±0.5）%和總凋亡細胞比例（8.0±1.5）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的早期凋亡細胞比例為（3.0±0.5）%，晚期凋亡細胞比例為（2.0±0.5）%，總凋亡細胞比例為（5.0±1.0）%，也顯著低于inhibitorsNC組（P<0.01）。這說明抑制miR-187*和miR-451的表達能夠抑制SW480細胞凋亡。TUNEL實驗，即末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法（TdT-mediateddUTPnickendlabeling），其原理是利用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到凋亡細胞斷裂的DNA3'-OH末端。然后通過與相應的顯色底物反應，使凋亡細胞呈現出棕黃色或熒光信號，從而可以在顯微鏡下觀察和計數凋亡細胞。TUNEL實驗能夠特異性地標記凋亡細胞中斷裂的DNA，是一種靈敏且直觀的檢測細胞凋亡的方法。在進行TUNEL實驗時，將轉染后的HT29和SW480細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于24孔板中，在細胞爬片上培養48h。取出細胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min，以固定細胞形態和保持細胞結構完整性。固定結束后，用PBS洗滌細胞爬片3次，每次5min，以去除未結合的固定劑。加入0.1%TritonX-100通透液，室溫孵育10min，增加細胞膜的通透性，使TdT酶和標記的dUTP能夠進入細胞與斷裂的DNA結合。再次用PBS洗滌細胞爬片3次，每次5min后，按照TUNEL試劑盒說明書，加入TdT酶和標記的dUTP混合液，37℃避光孵育1h。孵育結束后，用PBS洗滌細胞爬片3次，每次5min。對于采用地高辛標記的dUTP，加入抗地高辛抗體（1:500稀釋），37℃孵育30min；對于采用生物素標記的dUTP，加入鏈霉親和素-HRP（1:1000稀釋），37℃孵育30min。然后用PBS洗滌細胞爬片3次，每次5min。最后加入DAB顯色液，室溫避光顯色5-10min，當凋亡細胞呈現棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色反應。在顯微鏡下觀察，凋亡細胞細胞核被染成棕黃色，隨機選取5個視野，計數凋亡細胞數和總細胞數，計算凋亡細胞所占比例。實驗結果顯示，在HT29細胞中，轉染miR-187*mimics組的凋亡細胞比例為（28.0±3.0）%，顯著高于mimicsNC組的（10.0±2.0）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的凋亡細胞比例為（32.0±3.5）%，也顯著高于mimicsNC組（P<0.01）。這進一步證實了過表達miR-187和miR-451能夠促進HT29細胞凋亡。轉染miR-187inhibitor組的凋亡細胞比例為（6.0±1.0）%，顯著低于inhibitorsNC組的（12.0±2.0）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的凋亡細胞比例為（8.0±1.5）%，同樣顯著低于inhibitorsNC組（P<0.01）。這表明抑制miR-187*和miR-451的表達可以抑制HT29細胞凋亡。在SW480細胞中，轉染miR-187*mimics組的凋亡細胞比例為（25.0±2.5）%，顯著高于mimicsNC組的（9.0±2.0）%（P<0.01）；轉染miR-451mimics組的凋亡細胞比例為（29.0±3.0）%，也顯著高于mimicsNC組（P<0.01）。這說明過表達miR-187和miR-451對SW480細胞具有明顯的促凋亡作用。轉染miR-187inhibitor組的凋亡細胞比例為（5.0±1.0）%，顯著低于inhibitorsNC組的（11.0±2.0）%（P<0.01）；轉染miR-451inhibitor組的凋亡細胞比例為（7.0±1.5）%，同樣顯著低于inhibitorsNC組（P<0.01）。這表明抑制miR-187*和miR-451的表達能夠抑制SW480細胞凋亡。綜合Anne