DNA的粗提取和鑒定（一）實驗原理2.DNA不溶于酒精，但是細胞中的某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA和蛋白質。1.DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色，因此二苯胺試劑可作為鑒定DNA的試劑。（提取原理）（提取原理）（鑒定原理）DNA+二苯胺沸水浴藍色DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）1.選材：2.試劑：①研磨液

②體積分數為95%的酒精④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有2mol/LNaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl

——析出DNA——鑒定DNA，要現配現用研磨液、二苯胺的配制方法

課本P117SDS:使蛋白質變性與DNA分離;EDTA:是一種DNA酶的抑制劑，可防止細胞破碎后DNA酶降解DNA;從而保護DNATris:提供緩沖體系，DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態。2mol/LNaCl：溶解DNAHCl：調節pH（三）實驗步驟取材、研磨過濾分離鑒定結果觀察1.取材、研磨

稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨①研磨的目的？

破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中2.過濾或離心取上清液

在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？

可能含有核蛋白、多糖等雜質②低溫放置幾分鐘的作用？可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解3.預冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數為95%)，靜置2-3min，溶液中出現的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。①攪拌時應輕緩、并沿一個方向？減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子②酒精預冷的作用？

同“低溫放置的作用”4.NaCl溶液溶解DNA并鑒定

取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。實驗組對照組水浴加熱*溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關。思考：1．鳥類和哺乳動物的紅細胞都適合用來提取DNA嗎？請說明理由。2．實驗過程要充分地攪拌和研磨，如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核，不適合作材料提取DNA。研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，導致看不到絲狀物或沉淀物，用二苯胺鑒定不顯示藍色。（五）結果分析與評價1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。二苯胺試劑鑒定呈現藍色說明實驗基本成功；如果不呈現藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。

本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？（五）結果分析與評價3.與其他同學提取的DNA進行比較，看看實驗結果有何不同，分析產生差異的原因。本實驗可以采取分組的方式進行。可以選取不同的實驗材料；也可以查閱資料了解其他提取DNA的方法，對同種材料采用不同的方法。最后從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺試劑顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好。（六）進一步探究本實驗只是對DNA進行了粗提取，請查閱資料，了解實驗室提取純度較高的DNA的一種方法，并與本實驗中所使用的方法進行比較，總結兩種方法的異同。

實驗室提取純度較高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加質量分數為25%的SDS溶液，使蛋白質變性后與DNA分開；隨后，加入氯仿—異丙醇混合液(體積比為24：1)，通過離心將蛋白質及其他雜質除去，取上清液；可重復上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。此外由于苯酚可以迅速使蛋白質變性，抑制核酸酶的活性，因此還可以先用苯酚處理，然后離心分層，這時DNA溶于上層水相，蛋白質變性后存在于酚層中，用吸管、微量移液器等實驗用具就可以將兩者分開。練習與應用一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（）A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端C練習與應用一、概念檢測2.在重組DNA技術中，將外源基因送入受體細胞的載體可以是（）A.大腸桿菌的質粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用來識別特定基因的DNA探針A練習與應用二、拓展應用1.想一想，為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？是因為含有某種限制酶的細胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA入侵。2．有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。A片段B片段練習與應用二、拓展應用練習與應用二、拓展應用A片段B片段（1）哪種限制酶切割B片段產生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割A片段產生的DNA片段相連接？為什么？XbaⅠ。因為XbaⅠ與SpeⅠ切割產生了相同的黏性末端。練習與應用二、拓展應用A片段B片段(2)不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義？識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割產生相同黏性末端的限制酶被稱為同尾酶