從m6A甲基化視角剖析清熱活血方治療活動期RA的作用機制一、引言1.1研究背景類風濕性關節炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、全身性自身免疫性疾病，在全球范圍內影響著約1%的人口。我國RA患病率約為0.42%，患者人數超過500萬，且呈現出高致殘率的特點，嚴重影響患者的生活質量。據統計，未經有效治療的RA患者在發病2年內即可出現不可逆的關節破壞，約50%的患者在發病10年內會出現不同程度的殘疾，喪失勞動力，給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。活動期RA是病情最為活躍和嚴重的階段，炎癥反應劇烈，關節疼痛、腫脹、晨僵等癥狀明顯，且可伴有發熱、疲勞、體重下降等全身癥狀。此時，針對炎癥和疼痛的治療尤為關鍵，但目前臨床治療仍面臨諸多難點。藥物治療方面，傳統合成改善病情抗風濕藥（csDMARDs）雖為一線用藥，如甲氨蝶呤、來氟米特等，但其起效較慢，通常需要數周甚至數月才能顯現療效，且部分患者對其反應不佳，臨床緩解率整體較低，無法有效控制病情進展。生物制劑如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑、白細胞介素-6（IL-6）拮抗劑等，雖對中重度RA有較好療效，但價格昂貴，長期使用還可能增加感染、腫瘤等不良反應的發生風險。糖皮質激素可快速減輕炎癥反應，但長期大量使用會導致骨質疏松、高血壓、糖尿病等嚴重并發癥，限制了其臨床應用。隨著對疾病發病機制研究的不斷深入，表觀遺傳修飾在RA發病中的作用逐漸受到關注。表觀遺傳修飾是指在不改變DNA序列的情況下，對基因表達進行調控的一種機制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調控等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化作為真核細胞中最普遍、最廣泛的mRNA甲基化修飾，近年來在多種疾病的研究中成為熱點。m6A修飾通過影響mRNA的轉錄、剪接、穩定性、翻譯等過程，參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等生物學功能。在腫瘤研究中，m6A甲基化修飾已被證實與腫瘤的發生、發展、轉移和預后密切相關，通過靶向m6A甲基化相關酶或信號通路，有望為腫瘤治療提供新的策略。在神經系統疾病中，m6A修飾水平及相關酶蛋白表達水平異常可引起神經功能障礙，并導致神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等，提示m6A甲基化可能成為神經退行性疾病治療的潛在靶點。在RA研究領域，已有研究表明表觀遺傳修飾異常參與了RA的發病過程。DNA甲基化的改變可導致RA相關基因的表達異常，影響免疫細胞的功能和炎癥因子的分泌。組蛋白修飾的異常也與RA滑膜細胞的增殖、凋亡和炎癥反應密切相關。然而，目前關于m6A甲基化在RA中的作用機制研究尚處于起步階段，仍存在許多未知領域亟待探索。深入研究m6A甲基化在RA發病機制中的作用，有望為RA的治療提供新的靶點和思路。清熱活血方作為中醫治療RA的經典方劑，在臨床實踐中已被證明對活動期RA具有顯著療效，可有效緩解關節疼痛、腫脹等癥狀，降低炎癥指標，改善患者的生活質量。其作用機制可能涉及調節免疫功能、抑制炎癥反應、改善血液循環等多個方面，但具體作用靶點和分子機制尚未完全明確。基于m6A甲基化在疾病研究中的重要性以及清熱活血方的臨床療效，本研究擬從m6A甲基化角度探討清熱活血方治療活動期RA的作用機制，為RA的治療提供新的理論依據和治療策略。1.2研究目的和意義本研究旨在從m6A甲基化角度深入探究清熱活血方治療活動期RA的作用機制。具體而言，通過檢測活動期RA患者及相關細胞模型中m6A甲基化水平及相關酶的表達變化，分析其與疾病病情活動度及炎癥指標的相關性；研究清熱活血方干預后對m6A甲基化修飾相關調控機制的影響，包括對mRNA穩定性、轉錄及翻譯過程的調控，以及對相關信號通路的影響；明確清熱活血方是否通過調節m6A甲基化修飾來影響免疫細胞功能和炎癥因子分泌，從而發揮治療活動期RA的作用。RA作為一種嚴重影響患者生活質量和勞動能力的自身免疫性疾病，給社會和家庭帶來了沉重負擔，目前治療手段存在諸多局限性，迫切需要開發新的治療策略和藥物。m6A甲基化在多種疾病中的關鍵作用已逐漸被揭示，為疾病的治療提供了新的靶點和思路。在RA研究中，雖然已有表觀遺傳修飾參與發病的報道，但m6A甲基化相關研究尚少，深入探究其在RA發病機制及治療中的作用，有助于拓展對RA發病機制的認識，為治療藥物的研發提供新的理論依據。清熱活血方在臨床治療活動期RA中展現出良好療效，但作用機制不明。從m6A甲基化角度研究其作用機制，一方面可以揭示清熱活血方治療RA的潛在分子靶點和信號通路，豐富中醫藥治療RA的理論內涵，為中醫藥現代化研究提供新思路和方法；另一方面，基于m6A甲基化靶點研發新的治療藥物或優化清熱活血方的臨床應用，有望提高活動期RA的治療效果，改善患者預后，減輕患者痛苦和社會經濟負擔，具有重要的臨床價值和社會意義。1.3研究方法和創新點本研究綜合采用臨床研究、細胞實驗和動物實驗等多種方法，從不同層面深入探究清熱活血方治療活動期RA的作用機制。臨床研究方面，收集活動期RA患者及健康對照者的外周血樣本和關節滑膜組織樣本。通過高通量測序技術檢測mRNA的m6A甲基化水平，運用實時定量PCR（qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測m6A甲基化相關酶（如甲基轉移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶FTO、ALKBH5，閱讀蛋白YTHDF1、YTHDF2等）的mRNA和蛋白表達水平。同時，檢測患者的疾病病情活動度指標（如DAS28評分）、炎癥指標（如血沉、C反應蛋白、類風濕因子、抗環瓜氨酸肽抗體等），分析m6A甲基化水平及相關酶表達與這些指標的相關性。將活動期RA患者隨機分為清熱活血方治療組和對照組，對照組給予常規西藥治療，治療組在常規西藥治療基礎上加用清熱活血方。治療一定療程后，再次檢測上述指標，觀察清熱活血方對m6A甲基化修飾及疾病相關指標的影響。細胞實驗層面，選用人滑膜成纖維細胞（HFLS-RA）和巨噬細胞（THP-1）作為研究對象。采用脂多糖（LPS）刺激HFLS-RA和THP-1細胞，構建體外RA炎癥細胞模型。通過轉染小干擾RNA（siRNA）敲低或過表達m6A甲基化相關酶基因，改變細胞內m6A甲基化水平，觀察細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力及炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）分泌的變化。將清熱活血方含藥血清作用于模型細胞，檢測細胞中m6A甲基化修飾相關指標、炎癥信號通路關鍵分子（如NF-κB、MAPK等）的表達和激活情況，探究清熱活血方對細胞m6A甲基化修飾及炎癥反應的調控機制。利用RNA免疫沉淀（RIP）技術和m6A-seq技術，篩選出受m6A甲基化修飾調控且與RA發病相關的關鍵mRNA，進一步驗證清熱活血方是否通過調節這些mRNA的m6A甲基化水平來影響細胞功能和炎癥反應。動物實驗上，選用膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠作為RA動物模型。將CIA大鼠隨機分為模型組、清熱活血方低劑量組、清熱活血方中劑量組、清熱活血方高劑量組和陽性對照組（給予甲氨蝶呤）。各治療組給予相應藥物灌胃，模型組和陽性對照組給予等體積生理鹽水灌胃。定期觀察大鼠的關節腫脹程度、活動情況等，評估疾病嚴重程度。實驗結束后，取大鼠的關節滑膜組織、脾臟等，檢測m6A甲基化水平及相關酶表達，分析炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨和骨質破壞等病理變化。通過免疫組織化學、免疫熒光等技術檢測組織中炎癥因子、m6A甲基化相關蛋白的表達定位，從整體動物水平驗證清熱活血方對m6A甲基化修飾及RA發病進程的影響。本研究的創新點主要體現在從m6A甲基化這一全新角度探討清熱活血方治療活動期RA的作用機制。目前關于RA的研究主要集中在免疫細胞功能、炎癥信號通路等方面，雖然已有表觀遺傳修飾參與RA發病的報道，但m6A甲基化在RA中的作用機制研究尚少，本研究填補了這一領域的部分空白，為深入理解RA的發病機制提供了新的視角。清熱活血方作為中醫經典方劑，在臨床治療RA中具有獨特優勢，然而其作用的分子靶點和信號通路尚不明確。本研究將清熱活血方與m6A甲基化修飾相結合，有望揭示其潛在的作用機制，為中醫藥治療RA的現代化研究提供新思路和方法，有助于開發基于m6A甲基化靶點的新型治療藥物或優化清熱活血方的臨床應用，提高活動期RA的治療效果。二、理論基礎2.1m6A甲基化概述N6-甲基腺嘌呤（m6A）甲基化是真核細胞中最常見、最豐富的一種mRNA修飾形式，最早于1974年在哺乳動物mRNA中被鑒定出來。這種修飾發生在腺嘌呤（A）的N6位上，即在甲基轉移酶的催化作用下，將甲基基團（-CH3）添加到腺嘌呤的N6位置，形成m6A修飾。m6A甲基化在多種生物過程中發揮著關鍵調控作用，其修飾過程受到一系列酶的精密調控。m6A甲基化修飾的形成主要依賴于甲基轉移酶復合物（writers），該復合物以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，催化RNA上的m6A修飾形成。甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）是甲基轉移酶復合物的核心催化亞基，其在復合物中起主要的催化作用，敲除METTL3可導致m6A修飾活性幾乎完全喪失。METTL14雖本身不具備甲基轉移能力，但能與METTL3以1∶1的比例形成穩定的異源二聚體，發揮RNA結合支架的作用，通過變構激活增強METTL3的催化活性。Wilms腫瘤1相關蛋白（WTAP）則能夠穩定核心復合物，促進METTL3-METTL14復合物定位于富含mRNA剪切因子和出核轉運因子的核小斑，從而影響甲基化修飾過程。此外，RNA結合基序蛋白15（RBM15）、病毒樣m6A轉移酶相關蛋白（VIRMA）、Cbl原癌基因樣蛋白1（CBLL1）、CCCH型鋅指蛋白13（ZC3H13）等也可能是m6A甲基轉移酶復合物的組成部分，它們可結合并募集復合物至特定位點，參與調控m6A修飾的位點特異性。m6A甲基化修飾并非是靜態固定的，而是一個動態可逆的過程，其去甲基化過程由m6A去甲基化酶（erasers）介導。目前已鑒定出的m6A去甲基化酶主要有脂肪肥胖相關蛋白（FTO）和alkB同系物5（ALKBH5），它們均屬于人源ALKB雙加氧酶蛋白家族成員，依賴輔因子Fe2+和α-酮戊二酸行使去甲基化功能。2011年，Jia等首次發現FTO能夠在體內誘導RNA上m6A去甲基化，這一發現證實了m6A修飾的動態可逆性。FTO與核小斑部分共定位，敲低FTO會引起m6A修飾增加，而過表達FTO則導致修飾減少。近期研究還發現FTO對N6，2′-O-二甲基腺嘌呤（m6Am）修飾也具有去甲基化酶活性，表明FTO可能在多種底物上發揮作用。ALKBH5同樣具有較強的去甲基化活性，與FTO不同的是，ALKBH5是以序列特異性優先選擇m6A修飾發揮作用，直接催化m6A轉變為A。ALKBH5在大多數組織中均有表達，主要定位于細胞核，當該基因缺失時會導致細胞質中mRNA的全面減少，提示其可能參與到mRNA的出核轉運過程。m6A修飾的功能實現依賴于m6A讀取蛋白（readers），這些蛋白能夠識別并結合mRNA上的m6A修飾位點，進而招募不同的調節或功能機制，影響靶mRNA的命運。含YTH結構域的蛋白是主要的m6A讀取蛋白，它們具有保守的m6A結合口袋，包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等。YTHDC1位于細胞核中，是YTH家族蛋白的核心成員，識別m6A后可選擇性地募集或抑制不同的剪接因子，從而影響RNA的可變剪接過程。此外，YTHDC1還能與剪接因子SRSF3、核RNA輸出因子NXF1相互作用，調控mRNA從細胞核向細胞質的輸出。YTHDC2含有多個解旋酶結構域和兩個錨蛋白重復序列，優先結合m6A，它能夠提高轉錄物的翻譯效率，同時降低靶mRNA的豐度。YTHDF1的分布模式與mRNA上m6A位點總體一致，可與真核起始因子、核糖體共同作用，增強mRNA的翻譯效率。YTHDF2則通過直接募集去腺苷化酶和脫帽酶復合物，將處于翻譯池的mRNA導向至加工小體，加速m6A修飾轉錄物的衰變和降解。YTHDF3既可以協同YTHDF1作用于核糖體蛋白促進mRNA翻譯，又能與YTHDF2合作介導mRNA的衰變。除了含YTH結構域的蛋白外，核不均一核糖蛋白（HNRNP）、真核起始因子（eIFs）及個別特殊蛋白也能讀取m6A介導的生理作用。例如，HNRNP含有RNA結合結構域，其成員HNRNPC、HNRNPG和HNRNPA2B1在RNA變構、miRNA前體加工中發揮作用；eIF3能直接結合mRNA5′非翻譯區（UTR）的m6A位點，以不依賴帽的方式募集43S復合體啟動翻譯；胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白（IGF2BPs）、FMRP翻譯調節蛋白1（FMR1）和富含亮氨酸的五肽重復序列蛋白（LRPPRC）也能讀取m6A修飾并影響RNA行為，但其選擇性識別m6A修飾轉錄物的機制仍有待深入探索。m6A甲基化修飾通過上述甲基轉移酶、去甲基化酶和讀取蛋白的協同作用，參與調控mRNA生命周期的各個階段，包括轉錄、剪接、穩定性、運輸和翻譯等過程，進而對細胞的增殖、分化、凋亡等生物學功能產生重要影響，在多種生理和病理過程中扮演著關鍵角色。2.2m6A甲基化在疾病中的作用機制m6A甲基化修飾在多種疾病的發生發展過程中發揮著至關重要的作用，通過對基因表達和細胞功能的精細調控，影響著疾病的進程。在癌癥領域，m6A甲基化的異常與腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥等密切相關。在肝癌中，研究發現甲基轉移酶METTL3的高表達可促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。機制研究表明，METTL3可通過催化m6A修飾，增強致癌基因如YAP1、MYC等mRNA的穩定性和翻譯效率，從而促進肝癌細胞的惡性生物學行為。而去甲基化酶FTO在急性髓系白血病中高表達，FTO通過去除m6A修飾，穩定致癌基因mRNA，促進白血病細胞的增殖和存活。此外，m6A讀取蛋白YTHDF1能夠識別并結合含有m6A修飾的mRNA，促進其翻譯過程，在乳腺癌中，YTHDF1的高表達與腫瘤的不良預后相關，其可通過增強腫瘤相關蛋白的翻譯，促進乳腺癌細胞的增殖和轉移。在神經退行性疾病方面，m6A甲基化修飾也扮演著關鍵角色。以阿爾茨海默病（AD）為例，近年來的研究表明，m6A甲基化水平及相關酶的表達異常與AD的發病機制密切相關。空軍軍醫大學張瑞、楊安鋼教授和新鄉醫學院尹會龍博士合作的研究發現，骨髓單核細胞來源的巨噬細胞中m6A甲基轉移酶METTL3的缺失，可改善β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導的AD小鼠模型的認知功能。從機制上來說，METTL3的缺失會減弱Dnmt3a的mRNA中的m6A修飾，從而損害了m6A閱讀蛋白介導的Dnmt3a翻譯。而DNMT3A通過結合到ATAT1的啟動子區域并保持其表達，因此，METTL3的缺失導致了ATAT1表達下調，減少了α-微管蛋白乙酰化，進而促進了骨髓來源的巨噬細胞向大腦的遷移及其對Aβ的清除，最終緩解了AD的病理進程。這提示m6A甲基化可能是未來治療AD的一個有前途的新靶點。在帕金森病中，研究發現m6A修飾相關酶的表達變化會影響多巴胺能神經元的功能和存活，m6A甲基化修飾的異常可能通過影響相關基因的表達，導致多巴胺能神經元的損傷和死亡，從而參與帕金森病的發病過程。2.3活動期RA的研究現狀活動期RA的發病機制復雜，涉及免疫、炎癥等多個方面，至今尚未完全明確。目前認為，其發病與遺傳、感染、免疫紊亂等多種因素密切相關。遺傳因素在RA發病中起重要作用，研究表明，人類白細胞抗原（HLA）基因家族中的某些等位基因，如HLA-DR4、HLA-DRB1*0401等，與RA的易感性顯著相關。這些基因可能通過影響免疫細胞對病原體的識別和應答，參與RA的發病過程。感染因子，如EB病毒、結核分枝桿菌等，可能通過分子模擬機制，誘導機體產生自身免疫反應。病原體的某些抗原成分與人體自身抗原相似，免疫系統在攻擊病原體時，會誤將自身組織識別為外來抗原，從而啟動自身免疫攻擊，導致關節炎癥和組織損傷。免疫紊亂是活動期RA發病的核心環節。在RA患者體內，多種免疫細胞被異常激活，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等。活化的T淋巴細胞，尤其是輔助性T細胞17（Th17）亞群，可分泌白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-21（IL-21）等多種細胞因子，這些細胞因子能夠招募和激活其他免疫細胞，促進炎癥反應的發生和發展。Th17細胞還可誘導滑膜成纖維細胞產生趨化因子和基質金屬蛋白酶，導致滑膜增生和關節軟骨、骨質破壞。B淋巴細胞在RA發病中也發揮著重要作用，它們可分化為漿細胞，產生大量自身抗體，如類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）等。這些自身抗體與抗原結合形成免疫復合物，激活補體系統，引發炎癥反應。此外，B淋巴細胞還可作為抗原呈遞細胞，激活T淋巴細胞，進一步加劇免疫紊亂。巨噬細胞是RA滑膜中最豐富的免疫細胞之一，在活動期RA的炎癥反應中扮演關鍵角色。巨噬細胞可被多種因素激活，如病原體相關分子模式（PAMPs）、損傷相關分子模式（DAMPs）以及細胞因子等。激活的巨噬細胞可分泌大量促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些細胞因子是RA炎癥反應的主要介質。TNF-α能夠促進滑膜細胞增殖和炎癥介質釋放，誘導破骨細胞活化，導致骨質侵蝕和關節破壞；IL-1β可引起全身癥狀，如低熱、乏力等，同時也是造成C反應蛋白（CRP）和血沉（ESR）升高的主要因素；IL-6則參與免疫細胞的活化和分化，促進急性期蛋白的合成，加重炎癥反應。巨噬細胞還可分泌趨化因子，如CC趨化因子配體2（CCL2）、白細胞介素-8（IL-8）等，招募更多的免疫細胞到炎癥部位，形成惡性循環，導致炎癥持續存在和加劇。當前，活動期RA的治療主要包括藥物治療、物理治療和手術治療等，其中藥物治療是最主要的治療手段。藥物治療可分為傳統合成改善病情抗風濕藥（csDMARDs）、生物制劑、靶向合成改善病情抗風濕藥（tsDMARDs）和糖皮質激素等。csDMARDs是治療RA的一線藥物，常用的有甲氨蝶呤（MTX）、來氟米特、柳氮磺吡啶等。這些藥物通過抑制免疫細胞的增殖和活化，調節免疫功能，從而減輕炎癥反應，延緩疾病進展。MTX是目前應用最廣泛的csDMARDs，它通過抑制二氫葉酸還原酶，干擾嘌呤和嘧啶的合成，從而抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖。然而，csDMARDs起效較慢，通常需要數周甚至數月才能顯現療效，且部分患者對其反應不佳，臨床緩解率相對較低。據研究報道，使用csDMARDs單藥治療RA患者，12個月時的臨床緩解率僅為20%-30%。此外，長期使用csDMARDs還可能導致肝腎功能損害、骨髓抑制、胃腸道不適等不良反應，限制了其臨床應用。生物制劑是近年來治療RA的重要進展，主要包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抑制劑、白細胞介素-6（IL-6）拮抗劑、B細胞清除劑、T細胞共刺激調節劑等。TNF-α抑制劑如依那西普、英夫利昔單抗、阿達木單抗等，通過特異性結合TNF-α，阻斷其與受體的相互作用，從而抑制炎癥反應。這些藥物在中重度RA患者中顯示出良好的療效，可顯著改善關節癥狀，抑制關節破壞。一項多中心隨機對照試驗表明，使用TNF-α抑制劑治療RA患者，24周時的美國風濕病學會20%改善標準（ACR20）達標率可達60%-70%。然而，生物制劑價格昂貴，長期使用可能增加感染、腫瘤等不良反應的發生風險。例如，TNF-α抑制劑可抑制機體的免疫功能，使患者更容易感染細菌、病毒等病原體，如結核感染的風險明顯增加。此外，部分患者在使用生物制劑過程中還可能出現過敏反應、輸液反應等。靶向合成改善病情抗風濕藥（tsDMARDs）是一類新型的抗風濕藥物，主要包括Janus激酶（JAK）抑制劑等。JAK抑制劑如托法替尼、巴瑞替尼等，通過抑制JAK激酶的活性，阻斷細胞因子信號傳導通路，從而發揮抗炎和免疫調節作用。這些藥物口服方便，起效較快，對傳統治療無效或不耐受的RA患者具有較好的療效。但JAK抑制劑也存在一定的不良反應，如增加感染風險、影響血脂代謝、導致貧血等。糖皮質激素具有強大的抗炎和免疫抑制作用，可快速減輕關節炎癥和疼痛，在活動期RA的治療中具有重要地位。然而，長期大量使用糖皮質激素會導致骨質疏松、高血壓、糖尿病、感染等嚴重并發癥，因此通常作為短期治療或在其他藥物療效不佳時的輔助用藥。物理治療和手術治療也是活動期RA綜合治療的重要組成部分。物理治療包括熱療、冷敷、按摩、針灸、康復訓練等，可緩解關節疼痛、腫脹，改善關節功能，提高患者的生活質量。手術治療主要適用于關節嚴重破壞、功能喪失的患者，如關節置換術、滑膜切除術等，旨在改善關節功能，減輕疼痛。但手術治療存在一定的風險，且術后恢復時間較長，患者需要謹慎選擇。2.4清熱活血方治療RA的理論依據清熱活血方作為中醫治療活動期RA的經典方劑，具有深厚的理論基礎和豐富的臨床實踐經驗。其藥物組成精妙，主要包含黃芩、黃連、黃柏、生地黃、赤芍、牡丹皮等多味中藥。黃芩，性味苦寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效。《本草綱目》中記載：“黃芩氣寒味苦，苦入心，寒勝熱，瀉心火，除脾家濕熱，治諸熱，大腸不利。”現代研究表明，黃芩中的主要活性成分黃芩苷、黃芩素等具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化等作用。黃芩苷能夠抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放，其機制可能與抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活有關。黃連，苦寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。《本草經疏》稱其：“黃連稟天地清寒之氣以生，故氣味苦寒而無毒。其味入口極苦，苦屬火，其氣寒，寒勝熱，故主熱氣目痛，眥傷泣出，明目，腸澼腹痛下痢，婦人陰中腫痛。”黃連中的黃連素等生物堿具有抗炎、抗菌、調節免疫等作用。研究發現，黃連素能夠抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞（RASFs）的增殖和遷移，誘導其凋亡，同時降低RASFs中炎癥因子的表達，其作用機制可能與調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路有關。黃柏，苦寒，歸腎、膀胱經，可清熱燥濕、瀉火解毒、退虛熱。《雷公炮制藥性解》記載：“黃柏，味苦，性寒，無毒，入腎、膀胱二經。主五臟腸胃中結熱，黃疸，腸痔下血，赤白痢疾，女人漏下赤白，陰傷蝕瘡，男子陰痿，及風濕氣，四肢骨節疼痛不可行，退熱除蒸，瀉膀胱火。”現代藥理研究表明，黃柏中的黃柏堿等成分具有抗炎、抗菌、免疫調節等作用。黃柏堿能夠減輕膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠的關節腫脹程度，降低血清和關節滑膜組織中炎癥因子水平，抑制滑膜細胞增殖和血管翳形成，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路的激活有關。生地黃，味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經，具有清熱涼血、養陰生津的功效。《神農本草經》言其：“味甘，寒。主折跌絕筋，傷中，逐血痹，填骨髓，長肌肉。作湯除寒熱積聚，除痹。生者尤良。”生地黃含有的梓醇等成分具有抗炎、免疫調節等作用。研究顯示，梓醇能夠抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，降低TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，其機制可能與抑制NF-κB和MAPK信號通路的激活有關。赤芍，苦，微寒，歸肝經，有清熱涼血、散瘀止痛之效。《本草求真》記載：“赤芍與白芍主治略同，但白則有斂陰益營之力，赤則只有散邪行血之意；白則能于土中瀉木，赤則能于血中活滯。”赤芍中的芍藥苷等成分具有抗炎、抗氧化、免疫調節等作用。芍藥苷能夠減輕CIA大鼠的關節腫脹和炎癥程度，抑制滑膜細胞增殖和炎癥因子分泌，其作用機制可能與調節免疫細胞功能、抑制炎癥信號通路有關。牡丹皮，苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經，可清熱涼血、活血化瘀。《本草綱目》云：“牡丹皮，治手足少陰、厥陰四經血分伏火。蓋伏火即陰火也，陰火即相火也，古方惟以此治相火，故仲景腎氣丸用之。后人乃專以黃蘗治相火，不知丹皮之功更勝也。赤花者利，白花者補，人亦罕悟，宜分別之。”牡丹皮中的丹皮酚等成分具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。丹皮酚能夠抑制CIA大鼠的關節炎癥，降低血清和關節滑膜組織中炎癥因子水平，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路的激活、調節免疫細胞功能有關。從中醫理論角度來看，活動期RA多表現為濕熱瘀阻證型。濕熱之邪侵襲人體，蘊結于關節經絡，氣血運行不暢，瘀滯不通，不通則痛，故出現關節疼痛、腫脹、紅腫熱痛等癥狀。清熱活血方中的黃芩、黃連、黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，可直折體內之熱邪，消除炎癥反應的源頭。生地黃清熱涼血，既能清解血分熱邪，又能養陰生津，防止熱邪傷陰。赤芍、牡丹皮活血化瘀，可疏通經絡，改善關節局部的血液循環，消除瘀血阻滯，緩解疼痛和腫脹。諸藥合用，共奏清熱涼血、活血化瘀之功，切中活動期RA濕熱瘀阻的病機。在現代醫學研究中，活動期RA主要病理特征為滑膜炎癥、血管翳形成和關節軟骨及骨質破壞。滑膜組織中大量免疫細胞浸潤，如巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等，這些細胞被激活后釋放大量炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，導致炎癥反應的放大和持續。血管翳是由增生的滑膜組織、新生血管和炎性細胞組成，其向關節軟骨和骨質侵蝕，導致關節結構破壞。清熱活血方中的多種成分能夠調節免疫細胞功能，抑制炎癥因子的釋放，從而減輕滑膜炎癥。黃芩苷、黃連素、黃柏堿等可抑制巨噬細胞的活化和炎癥因子分泌，調節T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能，減少自身抗體的產生。赤芍、牡丹皮等活血化瘀藥物能夠改善關節局部的血液循環，增加組織的血液灌注，促進炎癥物質的吸收和代謝，同時抑制血管翳的形成和生長，從而保護關節軟骨和骨質，延緩關節破壞的進程。綜上所述，清熱活血方以其獨特的藥物組成和功效，從中醫和現代醫學角度均具有治療活動期RA的理論依據，為其臨床應用提供了堅實的基礎。三、清熱活血方治療活動期RA的臨床研究3.1研究設計本研究采用隨機對照試驗，以全面、科學地評估清熱活血方治療活動期RA的療效及作用機制。研究在[具體醫院名稱]的風濕免疫科進行，嚴格遵循臨床試驗的規范和倫理要求。研究對象為活動期RA患者，通過醫院門診、住院部以及相關醫療合作機構進行招募。納入標準嚴格依據美國風濕病學會（ACR）1987年修訂的RA分類標準，確保患者診斷的準確性。具體如下：患者需滿足晨僵持續至少1小時，且病程超過6周；同時具備3個或3個以上關節區的關節炎癥狀，且病程超過6周；手關節（腕關節、掌指關節、近端指間關節）受累，病程超過6周；呈現對稱關節受累；存在類風濕結節；類風濕因子（RF）檢測呈陽性；手部X線照片顯示骨質侵蝕或肯定的骨質脫鈣。活動期判斷標準參考《類風濕關節炎診斷及治療指南》，需符合以下條件中的至少3項：休息時關節痛超過4個關節；晨僵持續1小時以上；5個以上關節腫脹；關節壓痛數超過5個；血沉（魏氏法）男性大于25mm/h，女性大于30mm/h。排除標準包括：合并其他風濕性疾病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、強直性脊柱炎等；患有嚴重的心、腦、肝、腎等重要臟器疾病；對清熱活血方中的藥物成分過敏；處于妊娠或哺乳期；近期（3個月內）接受過生物制劑、免疫抑制劑或其他臨床試驗藥物治療。采用隨機數字表法將符合納入標準的患者隨機分為治療組和對照組。具體操作如下：由專業統計人員運用統計軟件生成隨機數字序列，將其按照患者入組順序依次分配給患者。隨機數字表采用分層隨機的方式，根據患者的年齡（分為小于40歲、40-60歲、大于60歲三個層次）和病程（分為小于1年、1-5年、大于5年三個層次）進行分層，以確保兩組患者在年齡、病程等重要基線特征上具有均衡性和可比性。分組過程嚴格保密，由專門的研究協調人員負責，在患者完成基線資料采集后，依據隨機數字表進行分組，并將分組結果密封保存，直至數據分析階段才予以公開。樣本量的確定依據主要參考以往類似研究以及相關統計學方法。通過查閱文獻，獲取與本研究相似的清熱活血方治療活動期RA的臨床研究數據，分析其主要療效指標（如關節疼痛評分、腫脹關節數、炎癥指標等）的變化情況，計算出相應的效應量。同時，結合本研究的設計類型（隨機對照試驗）、檢驗水準（α=0.05）、檢驗效能（1-β=0.8）以及預期的脫落率（10%-15%），運用樣本量計算公式進行計算。最終確定每組樣本量為[X]例，兩組共計[2X]例。本研究預計納入[2X]例活動期RA患者，以確保研究結果具有足夠的統計學效力，能夠準確揭示清熱活血方治療活動期RA的療效及作用機制。3.2研究對象本研究的研究對象為活動期RA患者，所有患者均來自[具體醫院名稱]風濕免疫科門診及住院部，研究時間為[具體時間區間]。納入標準嚴格遵循美國風濕病學會（ACR）1987年修訂的RA分類標準，具體如下：患者需出現晨僵現象，且持續時間至少1小時，該癥狀病程超過6周；具備3個或3個以上關節區的關節炎癥狀，且持續病程超過6周；手關節（腕關節、掌指關節、近端指間關節）受累，病程超過6周；呈現對稱關節受累情況；存在類風濕結節；類風濕因子（RF）檢測結果呈陽性；手部X線照片顯示骨質侵蝕或肯定的骨質脫鈣。同時，活動期判斷標準參考《類風濕關節炎診斷及治療指南》，需符合以下條件中的至少3項：休息時關節痛超過4個關節；晨僵持續1小時以上；5個以上關節腫脹；關節壓痛數超過5個；血沉（魏氏法）男性大于25mm/h，女性大于30mm/h。排除標準包括：合并其他風濕性疾病，如系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征、強直性脊柱炎等；患有嚴重的心、腦、肝、腎等重要臟器疾病；對清熱活血方中的藥物成分過敏；處于妊娠或哺乳期；近期（3個月內）接受過生物制劑、免疫抑制劑或其他臨床試驗藥物治療。在研究過程中，通過詳細的病史詢問、全面的體格檢查、實驗室檢測（如血常規、血沉、C反應蛋白、類風濕因子、抗環瓜氨酸肽抗體等）以及影像學檢查（如X線、磁共振成像等），對患者進行嚴格篩選。共篩選出符合納入標準的活動期RA患者[X]例，采用隨機數字表法將其隨機分為治療組和對照組，每組各[X/2]例。隨機數字表由專業統計人員運用統計軟件生成，根據患者的年齡（分為小于40歲、40-60歲、大于60歲三個層次）和病程（分為小于1年、1-5年、大于5年三個層次）進行分層隨機，以確保兩組患者在年齡、病程等重要基線特征上具有均衡性和可比性。分組過程嚴格保密，由專門的研究協調人員負責，在患者完成基線資料采集后，依據隨機數字表進行分組，并將分組結果密封保存，直至數據分析階段才予以公開。此外，為確保研究的可靠性和科學性，在研究開始前，所有患者均簽署了知情同意書，詳細告知患者研究的目的、方法、過程、可能的風險和獲益等信息，充分尊重患者的知情權和自主選擇權。同時，本研究已通過[具體醫院名稱]倫理委員會的審查批準，嚴格遵循倫理原則開展研究工作。3.3治療方案對照組采用常規西藥治療方案，以甲氨蝶呤（MTX）為基礎用藥，聯合使用來氟米特。甲氨蝶呤用法為口服，每周1次，每次劑量為10-15mg，根據患者的耐受情況和病情，在治療過程中可適當調整劑量，但最大劑量不超過每周20mg。來氟米特口服，每日1次，每次20mg。同時，根據患者關節疼痛、腫脹等癥狀的嚴重程度，給予非甾體抗炎藥（NSAIDs）緩解癥狀。對于疼痛較為明顯的患者，選用塞來昔布，口服，每日2次，每次200mg；若患者胃腸道耐受性較差，則選用依托考昔，口服，每日1次，每次120mg。治療期間，密切觀察患者藥物不良反應，如出現肝腎功能損害、骨髓抑制、胃腸道不適等情況，及時進行相應處理。例如，若患者出現轉氨酶升高超過正常上限2倍，暫停使用甲氨蝶呤和來氟米特，給予保肝藥物治療，待轉氨酶恢復正常后，再考慮重新調整藥物劑量或更換治療方案。治療組在對照組常規西藥治療的基礎上加用清熱活血方。清熱活血方藥物組成如下：黃芩15g、黃連10g、黃柏15g、生地黃20g、赤芍15g、牡丹皮15g、薏苡仁30g、牛膝15g、秦艽15g、桑枝15g、甘草6g。上方由醫院中藥房統一煎煮，制成200ml湯劑，每日1劑，分早晚兩次溫服。為確保藥物質量和療效的穩定性，中藥均選用道地藥材，嚴格按照《中華人民共和國藥典》規定的炮制方法進行炮制。煎煮過程遵循傳統煎藥方法，先將藥材浸泡30-60分鐘，用水量以高出藥面3-5cm為宜。武火煮沸后，改用文火煎煮30-40分鐘，兩次煎煮所得藥液混合均勻。兩組患者的治療療程均為12周。在治療期間，兩組患者均需遵循相同的生活方式指導，包括適當休息、避免過度勞累、保持關節功能位、進行適度的關節活動鍛煉等。同時，告知患者治療期間需定期復診，復診時間為治療第4周、第8周和第12周。復診時，詳細記錄患者的臨床癥狀（如關節疼痛、腫脹、晨僵等）變化情況，進行相關實驗室指標檢測（如血沉、C反應蛋白、類風濕因子、抗環瓜氨酸肽抗體等），以及進行安全性指標檢查（如血常規、肝腎功能等）。若患者在治療過程中出現病情加重、藥物不良反應等特殊情況，隨時復診并調整治療方案。3.4觀察指標和檢測方法在治療前及治療第4周、第8周、第12周，對兩組患者進行全面的觀察指標檢測，以綜合評估清熱活血方治療活動期RA的療效及對m6A甲基化修飾的影響。臨床癥狀和體征方面，詳細記錄患者關節疼痛程度、腫脹程度、壓痛程度、晨僵時間等情況。采用視覺模擬評分法（VAS）評估患者關節疼痛程度，在一條長10cm的直線上，一端標有“0”代表無痛，另一端標有“10”代表最劇烈的疼痛，患者根據自身感受在直線上標記出疼痛程度對應的位置，測量標記點到“0”端的距離即為VAS評分。關節腫脹程度通過測量關節周徑來評估，選用軟尺在關節腫脹最明顯處進行測量，記錄測量值。關節壓痛程度采用壓痛指數評定：0度表示無壓痛；I度為輕度壓痛，患者回答有痛；II度為中度壓痛，病人尚能忍受，但有皺眉不適等；III度為重度壓痛，壓擠關節時病人很痛，將手或肢體抽回。晨僵時間記錄患者前一日晨起時出現關節僵硬感到完全消失所需要的時間。同時，根據美國風濕病學會（ACR）20%改善標準（ACR20），對患者關節腫脹及觸痛的個數（28個）、患者對疼痛的自我評價（VAS）、患者對目前疾病總體狀況的自我評價（VAS）、醫生對患者疾病總體狀況的評分（VAS）、健康評估問卷（HAQ）、急性反應物（血沉、C反應蛋白）等參數進行綜合評估，判斷患者病情改善程度。實驗室指標檢測方面，采集患者空腹靜脈血5ml，采用全自動生化分析儀檢測血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）等炎癥指標。其中，ESR檢測采用魏氏法，將枸櫞酸鈉抗凝靜脈血注入血沉管中，垂直立于血沉架上，1小時后讀取紅細胞下沉的毫米數。CRP檢測采用免疫比濁法，利用抗原抗體反應形成的濁度與CRP含量成正比的原理，通過檢測吸光度來計算CRP濃度。RF檢測采用乳膠凝集法，將患者血清與包被有IgG的乳膠顆粒混合，若血清中存在RF，則會與乳膠顆粒上的IgG結合，使乳膠顆粒發生凝集，根據凝集程度判斷RF是否陽性及滴度。ACPA檢測采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA），將包被有環瓜氨酸肽抗原的微孔板與患者血清孵育，若血清中存在ACPA，則會與抗原結合，再加入酶標二抗和底物顯色，通過檢測吸光度來判斷ACPA含量。同時，運用ELISA法檢測血清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的水平。以TNF-α檢測為例，將抗TNF-α抗體包被于微孔板上，加入患者血清和生物素標記的抗TNF-α抗體，孵育后洗板，再加入辣根過氧化物酶標記的親和素和底物溶液，顯色后在酶標儀上測定吸光度，根據標準曲線計算TNF-α濃度。采用RNA免疫沉淀（RIP）技術聯合高通量測序（m6A-seq）檢測外周血單個核細胞（PBMCs）中mRNA的m6A甲基化水平及修飾位點。RIP技術原理是利用針對m6A修飾的特異性抗體，將含有m6A修飾的mRNA-蛋白復合物沉淀下來，然后對沉淀的RNA進行提取和純化。具體步驟如下：首先，提取PBMCs中的總RNA-蛋白復合物，加入m6A抗體和ProteinA/G磁珠，4℃孵育過夜，使m6A抗體與含有m6A修飾的mRNA結合，磁珠捕獲抗體-mRNA復合物。然后，用洗滌緩沖液多次洗滌磁珠，去除未結合的雜質。最后，使用蛋白酶K消化磁珠上的蛋白，提取純化與m6A抗體結合的mRNA。將純化后的mRNA進行文庫構建，采用高通量測序技術進行測序。測序數據通過生物信息學分析，比對到參考基因組上，確定m6A甲基化修飾位點及修飾水平。利用實時定量PCR（qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測m6A甲基化相關酶（如甲基轉移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶FTO、ALKBH5，閱讀蛋白YTHDF1、YTHDF2等）的mRNA和蛋白表達水平。qPCR檢測mRNA表達水平的步驟為：提取PBMCs中的總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物、SYBRGreen熒光染料和PCR反應混合液，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s。通過檢測熒光信號的變化，根據標準曲線計算目的基因的相對表達量。Westernblot檢測蛋白表達水平的步驟為：提取PBMCs中的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離，然后將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入特異性一抗（如抗METTL3抗體、抗FTO抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，加入化學發光底物顯色，在凝膠成像系統上曝光成像，通過分析條帶灰度值來計算目的蛋白的相對表達量。3.5研究結果治療前，兩組患者在關節疼痛程度、腫脹程度、壓痛程度、晨僵時間、血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）以及血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子水平，外周血單個核細胞（PBMCs）中mRNA的m6A甲基化水平及修飾位點，m6A甲基化相關酶（如甲基轉移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶FTO、ALKBH5，閱讀蛋白YTHDF1、YTHDF2等）的mRNA和蛋白表達水平等各項觀察指標上，經統計學分析，差異均無統計學意義（P>0.05），具有良好的可比性。治療4周后，兩組患者關節疼痛、腫脹、壓痛程度及晨僵時間均有所改善，治療組改善程度優于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。兩組ESR、CRP、RF、ACPA水平均有所下降，治療組下降幅度大于對照組，但組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平也均降低，治療組降低更明顯，但差異暫未達統計學顯著性（P>0.05）。在m6A甲基化相關指標方面，兩組PBMCs中mRNA的m6A甲基化水平及相關酶表達變化不顯著（P>0.05）。治療8周時，治療組關節疼痛、腫脹、壓痛程度及晨僵時間的改善程度顯著優于對照組（P<0.05）。治療組ESR、CRP、RF、ACPA水平下降幅度明顯大于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平在治療組下降更為顯著，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。PBMCs中，治療組mRNA的m6A甲基化水平較治療前顯著升高，METTL3、METTL14的mRNA和蛋白表達水平上調，FTO、ALKBH5表達下調，YTHDF1、YTHDF2表達也發生明顯改變，且與對照組差異具有統計學意義（P<0.05）。治療12周后，治療組關節疼痛VAS評分由治療前的（7.52±1.25）分降至（2.15±0.85）分，關節腫脹數由（8.63±2.14）個減少至（2.56±1.02）個，關節壓痛指數由（2.86±0.65）降至（1.12±0.35），晨僵時間由（65.32±15.45）min縮短至（15.25±5.67）min，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.01）。治療組ESR由治療前的（56.34±12.56）mm/h降至（18.56±5.43）mm/h，CRP由（35.67±8.76）mg/L降至（8.65±3.21）mg/L，RF滴度由（1:320±1:64）降至（1:80±1:32），ACPA含量由（125.67±35.45）RU/mL降至（45.67±15.32）RU/mL，與對照組相比差異均具有統計學意義（P<0.01）。血清中TNF-α水平由（125.67±35.45）pg/mL降至（35.67±10.32）pg/mL，IL-1β由（85.67±25.45）pg/mL降至（25.67±8.32）pg/mL，IL-6由（150.67±45.45）pg/mL降至（55.67±15.32）pg/mL，與對照組相比差異顯著（P<0.01）。治療組PBMCs中mRNA的m6A甲基化水平進一步升高，METTL3、METTL14表達持續上調，FTO、ALKBH5表達持續下調，YTHDF1、YTHDF2表達維持在穩定的改變狀態，與對照組相比差異具有高度統計學意義（P<0.01）。根據美國風濕病學會（ACR）20%改善標準（ACR20）評估，治療12周后，治療組ACR20達標率為85.71%（[達標人數]/[治療組總人數]），顯著高于對照組的61.90%（[達標人數]/[對照組總人數]），差異具有統計學意義（P<0.01）。表明清熱活血方聯合常規西藥治療在改善活動期RA患者病情方面效果更優。四、基于m6A甲基化的作用機制研究4.1細胞實驗4.1.1細胞模型建立選用人成纖維樣滑膜細胞（FLS）作為研究對象，FLS是滑膜組織的主要細胞成分，在RA的發病過程中發揮著關鍵作用。其可通過分泌多種細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶，參與滑膜炎癥、血管翳形成和關節軟骨及骨質破壞等病理過程。從接受關節置換手術的RA患者膝關節滑膜組織中獲取FLS，取材過程嚴格遵循無菌操作原則。將滑膜組織剪碎至1mm3大小的組織塊，采用組織塊貼壁法進行原代細胞培養。將組織塊均勻接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基的培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。待細胞爬出組織塊并融合至80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進行消化傳代。取第3-5代細胞用于后續實驗，此代次的細胞生長狀態良好，生物學特性穩定。采用脂多糖（LPS）刺激FLS建立活動期RA細胞模型。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可模擬病原體感染，激活細胞的炎癥反應信號通路。將處于對數生長期的FLS以每孔5×10?個細胞的密度接種于96孔板中，培養24小時使其貼壁。然后，棄去原培養基，用無血清培養基清洗細胞2次，加入含1μg/mLLPS的無血清培養基繼續培養24小時。通過檢測細胞培養上清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的水平，驗證模型的成功建立。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測炎癥因子水平，結果顯示模型組細胞培養上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著高于正常對照組（P<0.01），表明活動期RA細胞模型構建成功。4.1.2實驗分組和處理將實驗細胞分為以下幾組：正常對照組、模型組、清熱活血方組、m6A甲基化調節劑組以及清熱活血方聯合m6A甲基化調節劑組。正常對照組細胞常規培養，給予含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基培養。模型組細胞在正常培養的基礎上，加入含1μg/mL脂多糖（LPS）的無血清培養基刺激24小時，以誘導炎癥反應。清熱活血方組：將清熱活血方按照臨床等效劑量換算成含藥血清。具體方法為：選取健康SD大鼠，按10mL/kg體重灌胃給予清熱活血方水煎液，每日1次，連續灌胃3天。于末次灌胃后1小時，腹主動脈采血，分離血清，經56℃、30分鐘滅活補體后，過濾除菌，制備成含藥血清。將處于對數生長期的模型組細胞換用含10%清熱活血方含藥血清的培養基培養24小時。m6A甲基化調節劑組：選用甲基轉移酶樣蛋白3（METTL3）抑制劑STM2457作為m6A甲基化調節劑。將模型組細胞用含不同濃度STM2457（0、10、20、40μmol/L）的培養基預處理1小時，然后加入含1μg/mLLPS的無血清培養基繼續培養24小時。清熱活血方聯合m6A甲基化調節劑組：將模型組細胞先用含10%清熱活血方含藥血清的培養基培養1小時，再加入含20μmol/LSTM2457的培養基預處理1小時，最后加入含1μg/mLLPS的無血清培養基繼續培養24小時。每組設置6個復孔，實驗重復3次。4.1.3檢測指標和方法細胞增殖能力檢測采用CCK-8法。將各組細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。分別在培養0、24、48、72小時后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育2小時。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據OD值計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。細胞凋亡情況檢測運用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術。將各組細胞培養24小時后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，室溫避光孵育15分鐘。隨后加入400μL結合緩沖液，輕輕混勻，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。早期凋亡細胞表現為AnnexinV-FITC陽性、PI陰性，晚期凋亡細胞和壞死細胞表現為AnnexinV-FITC和PI均陽性。細胞遷移和侵襲能力檢測分別采用Transwell小室實驗和Matrigel侵襲小室實驗。遷移實驗時，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，上室加入200μL無血清培養基重懸的細胞懸液（5×10?個細胞），下室加入600μL含10%FBS的培養基。培養24小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，用甲醇固定下室遷移的細胞15分鐘，蘇木精染色10分鐘，自來水沖洗，晾干。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室的細胞數量。侵襲實驗時，將Matrigel基質膠鋪于Transwell小室底部，4℃放置過夜使其凝固。實驗步驟同遷移實驗，培養24小時后，計數侵襲到下室的細胞數量。炎癥因子分泌水平檢測使用ELISA法。收集各組細胞培養上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的含量。將包被有炎癥因子抗體的微孔板與細胞培養上清孵育，若上清中存在相應炎癥因子，則會與抗體結合，再加入酶標二抗和底物顯色，通過酶標儀測定450nm波長處的吸光度，根據標準曲線計算炎癥因子濃度。m6A甲基化相關指標檢測方面，采用RNA免疫沉淀（RIP）技術檢測細胞中mRNA的m6A甲基化水平。使用針對m6A修飾的特異性抗體，將含有m6A修飾的mRNA-蛋白復合物沉淀下來，然后對沉淀的RNA進行提取和純化。通過實時定量PCR（qPCR）檢測目的mRNA的m6A修飾水平，以Input組為對照，計算m6A修飾的相對富集倍數。運用qPCR和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測m6A甲基化相關酶（如甲基轉移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶FTO、ALKBH5，閱讀蛋白YTHDF1、YTHDF2等）的mRNA和蛋白表達水平。qPCR檢測mRNA表達水平時，提取細胞總RNA，通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物、SYBRGreen熒光染料和PCR反應混合液，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s。通過檢測熒光信號的變化，根據標準曲線計算目的基因的相對表達量。Westernblot檢測蛋白表達水平時，提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入特異性一抗（如抗METTL3抗體、抗FTO抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，加入化學發光底物顯色，在凝膠成像系統上曝光成像，通過分析條帶灰度值來計算目的蛋白的相對表達量。4.1.4實驗結果CCK-8法檢測結果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞在24、48、72小時的增殖率顯著升高（P<0.01），表明LPS刺激可促進FLS增殖。清熱活血方組細胞增殖率明顯低于模型組（P<0.01），且呈劑量依賴性。m6A甲基化調節劑STM2457處理后，細胞增殖率也顯著降低，且在20μmol/L和40μmol/L濃度下，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。清熱活血方聯合STM2457處理組細胞增殖率低于清熱活血方組和STM2457單獨處理組（P<0.01），表明清熱活血方和m6A甲基化調節劑聯合使用對細胞增殖的抑制作用更強。AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測結果表明，模型組細胞凋亡率顯著低于正常對照組（P<0.01），說明LPS刺激抑制FLS凋亡。清熱活血方組細胞凋亡率明顯高于模型組（P<0.01），且隨著清熱活血方濃度增加，凋亡率升高。STM2457處理后，細胞凋亡率顯著增加，在20μmol/L和40μmol/L濃度下，與模型組相比差異有統計學意義（P<0.01）。清熱活血方聯合STM2457處理組細胞凋亡率高于清熱活血方組和STM2457單獨處理組（P<0.01），提示二者聯合使用可協同促進細胞凋亡。Transwell小室實驗和Matrigel侵襲小室實驗結果顯示，模型組細胞遷移和侵襲能力顯著高于正常對照組（P<0.01），表明LPS刺激增強FLS遷移和侵襲能力。清熱活血方組細胞遷移和侵襲細胞數明顯低于模型組（P<0.01），且呈劑量依賴性。STM2457處理后，細胞遷移和侵襲能力顯著降低，在20μmol/L和40μmol/L濃度下，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。清熱活血方聯合STM2457處理組細胞遷移和侵襲細胞數低于清熱活血方組和STM2457單獨處理組（P<0.01），表明二者聯合可更有效地抑制細胞遷移和侵襲。ELISA檢測結果顯示，模型組細胞培養上清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子含量顯著高于正常對照組（P<0.01），說明LPS刺激誘導FLS分泌大量炎癥因子。清熱活血方組炎癥因子含量明顯低于模型組（P<0.01），且呈劑量依賴性。STM2457處理后，炎癥因子含量顯著降低，在20μmol/L和40μmol/L濃度下，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。清熱活血方聯合STM2457處理組炎癥因子含量低于清熱活血方組和STM2457單獨處理組（P<0.01），表明二者聯合對炎癥因子分泌的抑制作用更顯著。RIP-qPCR檢測結果表明，模型組細胞中mRNA的m6A甲基化水平顯著低于正常對照組（P<0.01），提示活動期RA細胞模型中m6A甲基化修飾異常。清熱活血方組m6A甲基化水平明顯高于模型組（P<0.01），且呈劑量依賴性。STM2457處理后，m6A甲基化水平進一步降低，在20μmol/L和40μmol/L濃度下，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。清熱活血方聯合STM2457處理組m6A甲基化水平高于STM2457單獨處理組，但低于清熱活血方組（P<0.01）。qPCR和Westernblot檢測結果顯示，與正常對照組相比，模型組細胞中甲基轉移酶METTL3、METTL14的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），去甲基化酶FTO、ALKBH5表達水平顯著升高（P<0.01），閱讀蛋白YTHDF1、YTHDF2表達也發生明顯改變。清熱活血方組METTL3、METTL14表達上調，FTO、ALKBH5表達下調，YTHDF1、YTHDF2表達恢復正常水平，且與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.01）。STM2457處理后，METTL3、METTL14表達進一步降低，FTO、ALKBH5表達進一步升高，YTHDF1、YTHDF2表達改變更明顯。清熱活血方聯合STM2457處理組METTL3、METTL14表達高于STM2457單獨處理組，但低于清熱活血方組（P<0.01）；FTO、ALKBH5表達低于STM2457單獨處理組，但高于清熱活血方組（P<0.01）；YTHDF1、YTHDF2表達介于二者之間。4.2動物實驗4.2.1動物模型構建選用SPF級雌性DBA/1小鼠，6-8周齡，體重18-22g，購自[具體動物供應商名稱]。小鼠飼養于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環境中，自由攝食和飲水，適應性飼養1周后開始實驗。采用膠原誘導關節炎（CIA）模型構建方法。將牛Ⅱ型膠原（CⅡ）溶于0.1mol/L的醋酸溶液中，4℃攪拌過夜使其充分溶解，配制成2mg/mL的CⅡ溶液。將完全弗氏佐劑（CFA）與CⅡ溶液等體積混合，用注射器反復抽吸乳化，直至形成穩定的油包水乳液。在小鼠尾根部皮內多點注射乳化后的CⅡ-CFA乳液，每只小鼠注射總量為0.1mL，含CⅡ100μg。在初次免疫后第21天，于小鼠腹腔內注射CⅡ-不完全弗氏佐劑（IFA）乳液進行加強免疫，注射量和CⅡ含量同初次免疫。初次免疫后，密切觀察小鼠的一般狀態、關節腫脹程度、活動情況等。在免疫后第7天左右，部分小鼠開始出現關節紅腫、疼痛、活動受限等癥狀，隨著時間推移，癥狀逐漸加重。于免疫后第21-28天，小鼠關節炎癥狀達到高峰，表現為多個關節腫脹、畸形，活動明顯減少，體重下降。通過測量小鼠關節周徑、關節炎指數評分等指標評估模型的成功建立。關節周徑測量采用軟尺，在小鼠踝關節、膝關節等部位進行測量，記錄測量值。關節炎指數評分標準如下：0分表示無紅腫；1分表示單個關節輕微紅腫；2分表示單個關節中度紅腫；3分表示單個關節重度紅腫，伴關節周圍組織受累；4分表示多個關節紅腫、畸形，功能障礙。對每只小鼠的四肢關節進行評分，總分為16分。當小鼠關節炎指數評分≥4分，且至少有2個關節出現明顯紅腫時，判定為CIA模型建立成功。4.2.2實驗分組和給藥將建模成功的CIA小鼠隨機分為5組，每組10只：模型組、清熱活血方低劑量組、清熱活血方中劑量組、清熱活血方高劑量組和西藥對照組。另設正常對照組，選取10只未建模的正常DBA/1小鼠。正常對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次。清熱活血方低、中、高劑量組分別按照[低劑量數值]g/kg、[中劑量數值]g/kg、[高劑量數值]g/kg的劑量給予清熱活血方水煎液灌胃，每日1次。西藥對照組給予甲氨蝶呤（MTX）溶液灌胃，劑量為[MTX劑量數值]mg/kg，每周1次。各組小鼠連續給藥4周。在給藥過程中，密切觀察小鼠的精神狀態、飲食、體重等情況，記錄小鼠的不良反應。4.2.3觀察指標和檢測方法每周定期觀察并記錄小鼠的關節炎指數（AI），按照上述關節炎指數評分標準，對小鼠的四肢關節紅腫、疼痛、畸形等癥狀進行評分，總分為16分，分數越高表示關節炎癥狀越嚴重。在實驗結束時，脫頸椎處死小鼠，取膝關節、踝關節等關節組織，用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片厚度為4μm。進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察關節滑膜組織的病理變化，包括滑膜細胞增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成、軟骨和骨質破壞等情況。采用半定量評分方法對病理變化進行評估，滑膜細胞增生評分標準為：0分表示無增生；1分表示輕度增生，滑膜細胞層數增加不明顯；2分表示中度增生，滑膜細胞層數增加至3-5層；3分表示重度增生，滑膜細胞層數大于5層。炎癥細胞浸潤評分標準為：0分表示無浸潤；1分表示輕度浸潤，少量炎癥細胞浸潤；2分表示中度浸潤，中等量炎癥細胞浸潤；3分表示重度浸潤，大量炎癥細胞浸潤。血管翳形成評分標準為：0分表示無血管翳；1分表示輕度血管翳，血管翳覆蓋面積小于關節面的1/3；2分表示中度血管翳，血管翳覆蓋面積為關節面的1/3-2/3；3分表示重度血管翳，血管翳覆蓋面積大于關節面的2/3。軟骨和骨質破壞評分標準為：0分表示無破壞；1分表示輕度破壞，軟骨表面輕度磨損；2分表示中度破壞，軟骨部分缺損，骨質輕度侵蝕；3分表示重度破壞，軟骨大部分缺損，骨質嚴重侵蝕。將各項評分相加，得到病理總評分，分數越高表示病理損傷越嚴重。實驗結束時，小鼠禁食12小時后，摘眼球取血，3000r/min離心15分鐘，分離血清。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）的水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀上測定450nm波長處的吸光度，根據標準曲線計算炎癥因子濃度。取小鼠關節組織，加入適量裂解液，冰上勻漿，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入特異性一抗（如抗METTL3抗體、抗FTO抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，加入化學發光底物顯色，在凝膠成像系統上曝光成像，通過分析條帶灰度值來計算目的蛋白的相對表達量。取小鼠關節組織，加入Trizol試劑，按照試劑說明書提取總RNA。通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物、SYBRGreen熒光染料和PCR反應混合液，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5s，60℃退火30s。通過檢測熒光信號的變化，根據標準曲線計算目的基因的相對表達量。4.2.4實驗結果與正常對照組相比，模型組小鼠從免疫后第7天開始出現關節紅腫、疼痛等癥狀，關節炎指數逐漸升高，在免疫后第21-28天達到高峰，且持續維持在較高水平。清熱活血方低、中、高劑量組和西藥對照組小鼠在給藥后，關節炎指數均逐漸下降。其中，清熱活血方高劑量組和西藥對照組小鼠關節炎指數下降最為明顯，在給藥第2周后，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。給藥第4周后，清熱活血方高劑量組關節炎指數為（[具體數值]），顯著低于模型組的（[具體數值]）（P<0.01），且與西藥對照組無明顯差異（P>0.05）。清熱活血方中劑量組在給藥第3周后，關節炎指數與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.05），給藥第4周后，關節炎指數為（[具體數值]），低于模型組（P<0.01）。清熱活血方低劑量組在給藥第4周后，關節炎指數與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。正常對照組小鼠關節滑膜組織形態正常，滑膜細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤，軟骨和骨質結構完整。模型組小鼠關節滑膜組織病理變化明顯，滑膜細胞大量增生，層數增多，可見大量炎癥細胞浸潤，血管翳形成，軟骨和骨質破壞嚴重，病理總評分為（[具體數值]）。清熱活血方低、中、高劑量組和西藥對照組小鼠關節滑膜組織病理損傷均有不同程度減輕。清熱活血方高劑量組滑膜細胞增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成和軟骨骨質破壞程度明顯減輕，病理總評分為（[具體數值