GM-CSF與BZLF1融合基因重組腺病毒表達載體的構建及功能探究一、引言1.1研究背景與意義在生物醫學領域，基因治療作為一種新興的治療手段，正逐漸成為研究的熱點。其中，GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）和BZLF1（EB病毒即刻早期基因）基因因其獨特的生物學功能，在腫瘤治療、免疫調節等方面展現出了巨大的研究價值。GM-CSF是一種多功能細胞因子，在免疫系統中扮演著至關重要的角色。它主要作用于骨髓祖細胞和成熟巨噬細胞，能夠刺激祖細胞分化為成熟巨噬細胞，并激活巨噬細胞以發揮其免疫調節功能。GM-CSF還能刺激中性粒細胞的分化和活性，增強其吞噬能力。在免疫應答過程中，GM-CSF有助于協調免疫細胞的激活和炎癥反應的擴大，從而有效地控制感染和清除病原體。在癌癥治療方面，GM-CSF可以通過激活免疫系統，增強抗腫瘤免疫力。它能夠刺激腫瘤細胞的免疫原性，使腫瘤更容易被免疫系統識別和攻擊。研究表明，將GM-CSF基因轉導至腫瘤細胞中，制備成腫瘤疫苗，能夠有效地預防和治療腫瘤。接種經照射滅活的轉導GM-CSF結腸癌細胞系CT26后，90％的同源性小鼠對原代CT26細胞的攻擊起到了保護作用，同源性小鼠接種分泌GM-CSF的腫瘤疫苗后，對CT26原代細胞的多次攻擊在整個觀察期間未見腫瘤生長。GM-CSF還被用于治療骨髓移植后的中性粒細胞減少癥，以及促進組織修復和再生。BZLF1基因則是EB病毒裂解感染級聯反應中的關鍵基因，其表達產物Zta在病毒裂解感染的啟動和維持中起著至關重要的作用。EB病毒與多種人類惡性腫瘤的發生密切相關，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病等。BZLF1基因能夠誘導潛伏期EBV進入裂解期復制，從而發揮對EBV陽性腫瘤細胞的殺傷作用。研究發現，BZLF1基因可以激活一系列病毒和細胞基因的表達，引發病毒的裂解周期，導致被感染細胞的死亡。這一特性為EBV相關腫瘤的治療提供了新的靶點和思路。構建GM-CSF和BZLF1融合基因重組腺病毒表達載體具有重要的潛在意義。從腫瘤治療的角度來看，GM-CSF可以增強機體的抗腫瘤免疫反應，而BZLF1則能特異性地針對EBV陽性腫瘤細胞發揮作用。將兩者融合，有望實現協同增效，提高對EBV相關腫瘤的治療效果。融合基因可以刺激機體產生更強烈的特異性體液免疫和細胞免疫反應，有效地抑制腫瘤細胞的生長。已有研究表明，GM-CSF與BZLF1融合基因重組卡介苗免疫小鼠后，腫瘤成瘤時間延遲，腫瘤生長緩慢，生存時間顯著延長，平均抑瘤率達到82%。從免疫調節的角度而言，這種融合基因表達載體可能有助于調節免疫系統的平衡，增強機體的整體免疫功能。它不僅可以用于腫瘤治療，還可能在其他免疫相關疾病的治療中發揮作用，為這些疾病的治療提供新的策略和方法。構建GM-CSF和BZLF1融合基因重組腺病毒表達載體是一項具有重要理論意義和實際應用價值的研究工作，有望為腫瘤治療和免疫調節等領域帶來新的突破和進展。1.2研究目的與內容本研究旨在成功構建GM-CSF和BZLF1融合基因重組腺病毒表達載體，為后續深入研究其在腫瘤治療和免疫調節等方面的功能及應用奠定堅實的基礎。為達成這一目標，研究內容主要涵蓋以下幾個關鍵方面：首先是材料準備，精心收集和準備實驗所需的各類材料，包括質粒、細胞株、工具酶、各種試劑以及實驗儀器等。例如，獲取攜帶GFP報告基因的腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV，E1區和E3區缺失的復制缺陷5型腺病毒骨架質粒pAdEasy-1，大腸桿菌BJ5183和DH10B，人胚腎293細胞以及EBV陽性B958細胞系等，這些材料是后續實驗順利開展的物質基礎。接下來是構建GM-CSF和BZLF1融合基因。運用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術，分別從相應的細胞或組織中獲取GM-CSF和BZLF1編碼序列的cDNA。然后，采用剪接式重疊延伸（SOE）技術，通過設計合適的引物，將兩段基因通過多肽接頭（Gly4Ser）3的DNA序列進行巧妙連接，從而構建出融合基因GM-CSF-BZLF1。這一過程需要精確控制反應條件，確保基因片段的準確擴增和連接，是構建融合基因的關鍵步驟。完成融合基因構建后，進行腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM的構建。將融合基因GM-CSF-BZLF1定向亞克隆至pAdTrack-CMV質粒中，利用限制性內切酶對質粒和融合基因進行酶切處理，使其產生互補的粘性末端，再通過T4DNA連接酶將兩者連接起來，構建出腺病毒穿梭載體。在此過程中，需要對連接產物進行篩選和鑒定，確保融合基因正確插入質粒中。隨后，在RecA+BJ5183宿主菌中完成穿梭質粒與骨架質粒pAdEasy-1的同源重組，構建重組腺病毒載體pAd-BZGM。將重組穿梭質粒轉化到RecA+BJ5183宿主菌中，利用宿主菌內的同源重組機制，使穿梭質粒與骨架質粒發生同源重組，形成重組腺病毒載體。通過抗性篩選和酶切鑒定等方法，篩選出含有正確重組質粒的克隆。得到重組腺病毒載體后，將其轉染293細胞，以獲得復制缺陷型重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1。利用脂質體轉染等方法將重組腺病毒載體導入293細胞中，借助293細胞的轉錄和翻譯系統，包裝出重組腺病毒。對收獲的重組腺病毒進行滴度測定，確定其感染活性，為后續實驗提供足夠數量和活性的病毒。最后，對重組腺病毒進行全面的檢測與鑒定。采用RT-PCR技術檢測感染重組腺病毒的293細胞中GM-CSF-BZLF1基因的轉錄表達情況，通過設計特異性引物，擴增融合基因的轉錄產物，以驗證融合基因是否在細胞中成功轉錄。運用Westernblotting技術檢測外源基因的表達產物，進一步確認融合基因在蛋白質水平的表達情況。還會研究重組腺病毒對EBV陽性CNE細胞的作用，觀察其對腫瘤細胞生長、增殖、凋亡等生物學行為的影響，評估重組腺病毒的抗腫瘤效果。1.3國內外研究現狀在GM-CSF的研究方面，國外起步較早，對其生物學功能和作用機制進行了深入的探索。早在20世紀80年代，GM-CSF就被首次克隆和鑒定，隨后的研究揭示了它在免疫系統中的關鍵作用。大量的動物實驗和臨床試驗表明，GM-CSF在癌癥治療中展現出了巨大的潛力。例如，在黑色素瘤的治療中，GM-CSF被用于激活免疫系統，增強機體對腫瘤細胞的識別和攻擊能力，部分患者的生存期得到了顯著延長。GM-CSF還被用于治療骨髓移植后的中性粒細胞減少癥，有效提高了患者的免疫力，降低了感染的風險。國內的研究也在不斷跟進，不僅對GM-CSF的基礎生物學功能進行了深入研究，還在其臨床應用方面進行了積極的探索。在腫瘤治療領域，國內學者嘗試將GM-CSF與其他治療方法相結合，如與化療、放療聯合使用，以提高治療效果。有研究報道，在肺癌的治療中，GM-CSF聯合化療，能夠增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減輕化療的副作用，提高患者的生活質量。關于BZLF1基因的研究，國外主要聚焦于其在EB病毒生命周期中的作用機制以及與腫瘤發生發展的關系。研究發現，BZLF1基因的表達能夠激活一系列病毒和細胞基因的表達，引發EB病毒的裂解周期，這為開發針對EBV相關腫瘤的治療策略提供了重要的理論基礎。通過基因編輯技術敲除BZLF1基因，能夠抑制EBV的裂解復制，從而減少腫瘤細胞的增殖。國內在BZLF1基因的研究方面也取得了一定的成果，特別是在EBV相關腫瘤的診斷和治療方面。有研究通過檢測BZLF1基因的表達水平，為鼻咽癌的早期診斷提供了新的標志物。國內學者還嘗試利用BZLF1基因的特性，開發新型的腫瘤治療方法，如構建表達BZLF1基因的重組病毒載體，用于靶向治療EBV陽性腫瘤。在重組腺病毒表達載體構建方面，國外的技術已經相對成熟，并且在基因治療、疫苗研發等領域得到了廣泛的應用。例如，在基因治療中，重組腺病毒表達載體被用于將治療性基因導入患者體內，以治療各種遺傳性疾病和腫瘤。在疫苗研發方面，重組腺病毒載體疫苗能夠有效地激發機體的免疫反應，具有良好的免疫原性和安全性。國內在這一領域也取得了顯著的進展，許多科研團隊致力于重組腺病毒表達載體的優化和創新，以提高其轉染效率、穩定性和安全性。國內研發的一些重組腺病毒載體在臨床試驗中表現出了良好的效果，為疾病的治療提供了新的選擇。當前研究仍存在一些不足之處。對于GM-CSF和BZLF1基因的協同作用機制研究還不夠深入，尤其是在融合基因的表達調控和功能發揮方面，還存在許多未知的領域。在重組腺病毒表達載體的構建過程中，如何進一步提高載體的轉染效率和靶向性，減少免疫反應，仍然是亟待解決的問題。本研究的創新點在于將GM-CSF和BZLF1基因進行融合，構建全新的融合基因重組腺病毒表達載體。這種融合基因表達載體有望實現兩種基因的協同增效，為腫瘤治療和免疫調節提供新的策略和方法。通過對融合基因表達載體的深入研究，有望揭示GM-CSF和BZLF1基因協同作用的分子機制，為相關領域的研究提供新的理論依據。二、相關理論基礎2.1GM-CSF概述2.1.1GM-CSF的結構與功能GM-CSF，即粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，是一種多功能的細胞因子，在免疫系統和造血系統中發揮著關鍵作用。從結構上看，人的GM-CSF全基因長約2.5kb，含有4個外顯子和3個內含子，定位于人第5條染色體長臂IL-3基因的下游。人GM-CSF是由127個氨基酸組成的蛋白質，屬Ⅰ類造血刺激因子，其作用無細胞系特異性。它是一種單體的糖脂類細胞因子，在穩定狀態下以低水平產生，而在炎癥情況下，如感染和腫瘤免疫期間，其產生量會顯著增加。GM-CSF的功能廣泛而重要。在造血干細胞的增殖與分化方面，它對髓系干細胞到成熟粒細胞的增殖與分化過程均有刺激作用。GM-CSF能夠促進髓系干細胞向粒系（包括中性粒細胞、嗜酸粒細胞系）、紅素、巨核細胞系、粒單細胞系和單核細胞系的共同祖細胞分化，并促進以上各系造血定向干細胞的增殖與成熟。這意味著GM-CSF在維持造血系統的正常功能、補充各類血細胞方面起著不可或缺的作用。在免疫調節方面，GM-CSF可以激活成熟粒細胞及單核巨噬細胞的功能，從而提高抗感染和免疫功能。當機體受到病原體入侵時，GM-CSF能夠增強中性粒細胞、嗜酸粒細胞、單核細胞的功能，使它們更好地發揮吞噬和清除病原體的作用，協調免疫細胞的激活和炎癥反應的擴大，從而有效地控制感染。GM-CSF發揮功能的機制主要是通過與效應細胞表面的GM-CSF受體結合。GM-CSF受體由α（CDw116；GM-CSFRα）和β（GM-CSFRβc）鏈組成，其中βc鏈在GM-CSF、IL-3和IL-5中共享。GM-CSF結合啟動JAK2自身磷酸化和受體后信號傳導，隨后激活STAT5和MAPK等信號通路，進而調節細胞的增殖、分化和功能。造血特異性轉錄因子干擾素調節因子4（IRF4）也是在GM-CSF處理的前體細胞（如單核細胞）中采用樹突狀細胞（DC）樣特性的關鍵信號分子。通過這些復雜的信號傳導過程，GM-CSF實現了對造血和免疫功能的精細調控。2.1.2GM-CSF在疾病治療中的應用GM-CSF在多種疾病的治療中展現出了顯著的療效，為臨床治療提供了新的思路和方法。在腫瘤免疫治療領域，GM-CSF被廣泛應用。它可以增強機體的抗腫瘤免疫力，通過激活免疫系統，使腫瘤細胞更容易被識別和攻擊。研究表明，將GM-CSF基因轉導至腫瘤細胞中，制備成腫瘤疫苗，能夠有效地預防和治療腫瘤。在黑色素瘤的治療中，GM-CSF被用于激活免疫系統，增強機體對腫瘤細胞的識別和攻擊能力，部分患者的生存期得到了顯著延長。GM-CSF還可以與其他治療方法聯合使用，如與化療、放療聯合，能夠增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減輕化療的副作用，提高患者的生活質量。在肺癌的治療中，GM-CSF聯合化療，能夠增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減輕化療的副作用，提高患者的生活質量。在造血系統疾病治療方面，GM-CSF也發揮著重要作用。對于骨髓移植后的患者，GM-CSF能夠加速骨髓造血功能重建，升高周圍白細胞，減少細菌感染。一般說來，骨髓移植后需三周中性粒細胞才能恢復，此期間極易發生感染，死于感染者約占10％～15％。而應用GM-CSF后，能有效縮短中性粒細胞恢復時間，降低感染風險。對于骨髓異常增生綜合征（MDS）和再生障礙性貧血等骨髓衰竭疾病，GM-CSF可刺激造血的增殖，主要是通過與效應細胞表面的GM-CSF受體結合而發揮其生物學效應。它除刺激干細胞、祖細胞的分化、增殖外，還有類似巨核細胞克隆刺激因子的活性，增加白細胞介素-3（IL-3）對巨核細胞克隆形成效用，協同促紅細胞生成素刺激紅細胞增殖。GM-CSF還在其他疾病的治療中發揮作用。在支氣管哮喘的治療中，GM-CSF能夠增加肺泡巨噬細胞的數量和功能，促進炎癥細胞吞噬和清除。在感染性疾病中，GM-CSF能夠增強免疫細胞的功能，加強免疫反應，促進病原體的清除。這些應用案例充分展示了GM-CSF在疾病治療中的重要價值和廣闊前景。2.2BZLF1概述2.2.1BZLF1的基因特性BZLF1基因，作為EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）的即刻早期基因，在EB病毒的生命周期中占據著舉足輕重的地位。從基因序列特征來看，BZLF1基因全長約1.8kb，由3個外顯子和2個內含子組成。其編碼的蛋白Zta，是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，含有352個氨基酸。Zta蛋白具有多個功能結構域，包括N端的轉錄激活結構域、中部的DNA結合結構域和C端的二聚化結構域。這些結構域協同作用，使得Zta蛋白能夠特異性地結合到DNA上，調控基因的轉錄表達。BZLF1基因的表達調控機制十分復雜，涉及多個層面。在轉錄水平上，BZLF1基因的啟動子區域（Zp）起著關鍵作用。Zp區域包含多個順式作用元件，如AP-1、Oct-1、NF-κB等結合位點。這些順式作用元件能夠與相應的轉錄因子相互作用，從而調控BZLF1基因的轉錄起始和轉錄效率。在EBV感染細胞的過程中，細胞內的一些信號通路被激活，導致AP-1等轉錄因子的表達上調，進而結合到Zp區域，促進BZLF1基因的轉錄。此外，BZLF1基因的表達還受到表觀遺傳調控，如DNA甲基化和組蛋白修飾等。研究發現，BZLF1基因啟動子區域的高甲基化狀態會抑制其轉錄活性，而低甲基化狀態則有利于基因的表達。在轉錄后水平，BZLF1基因的表達也受到多種因素的調控。mRNA的穩定性是影響基因表達的重要因素之一。一些RNA結合蛋白能夠與BZLF1mRNA結合，影響其穩定性和翻譯效率。HuR蛋白可以與BZLF1mRNA的3'UTR區域結合，增加mRNA的穩定性，從而促進BZLF1基因的表達。微小RNA（miRNA）也參與了BZLF1基因表達的調控。某些miRNA可以通過與BZLF1mRNA的互補配對，抑制其翻譯過程，或者促進mRNA的降解。研究表明，miR-155可以靶向BZLF1mRNA，抑制其表達，從而影響EBV的裂解感染過程。2.2.2BZLF1與EB病毒及相關疾病的關系BZLF1在EB病毒的生命周期中扮演著至關重要的角色，是EBV從潛伏期進入裂解期的關鍵調控因子。在EBV的潛伏期，病毒基因組處于沉默狀態，僅表達少量的潛伏蛋白，如EBNA1、LMP1等。當受到某些刺激因素，如細胞因子、化學物質等的作用時，BZLF1基因被激活表達。Zta蛋白能夠結合到EBV基因組上的多個位點，激活一系列病毒基因的表達，包括早期基因和晚期基因，從而啟動EBV的裂解復制周期。Zta蛋白可以結合到BRLF1基因的啟動子區域，激活BRLF1基因的表達，BRLF1基因編碼的Rta蛋白也是EBV裂解周期的重要調控因子，它與Zta蛋白協同作用，進一步促進EBV的裂解復制。在裂解復制過程中，EBV大量繁殖，產生新的病毒顆粒，最終導致被感染細胞的死亡。BZLF1與多種EB病毒相關疾病的發生發展密切相關。鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，在我國南方地區發病率較高。大量研究表明，EBV感染與鼻咽癌的發生密切相關，而BZLF1在鼻咽癌的發生發展中起著重要作用。在鼻咽癌組織中，BZLF1基因的表達水平明顯高于正常組織，且其表達水平與鼻咽癌的分期、轉移等密切相關。研究發現，BZLF1可以通過激活一系列細胞信號通路，促進鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲。BZLF1可以激活PI3K/Akt信號通路，上調MMP-2和MMP-9的表達，從而促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲。淋巴瘤也是一種與EBV感染相關的惡性腫瘤，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等。在這些淋巴瘤中，EBV的感染率較高，且BZLF1基因的表達與淋巴瘤的發生發展密切相關。在Burkitt淋巴瘤中，BZLF1基因的表達可以誘導細胞凋亡，但是在一些情況下，BZLF1基因的異常表達也可能導致淋巴瘤細胞的增殖和存活。研究表明，BZLF1可以通過激活NF-κB信號通路，抑制淋巴瘤細胞的凋亡，促進其增殖。此外，BZLF1還可以通過調節免疫細胞的功能，影響淋巴瘤的免疫逃逸。BZLF1可以抑制T細胞的活化和增殖，降低機體對淋巴瘤細胞的免疫監視作用，從而促進淋巴瘤的發生發展。2.3重組腺病毒表達載體原理2.3.1腺病毒載體的特點腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，在自然界中廣泛分布。完整的病毒顆粒呈二十面體對稱結構，直徑70-100nm，衣殼含有240個六鄰體（hexon）、12個五鄰體（penton）、12根纖毛（fiber）及一些小蛋白等。哺乳動物腺病毒的基因組DNA長約36kb，基因組的兩端各有約100bp的反向末端重復序列（ITR），ITR與末端蛋白（TP）相結合，與基因組復制及早期基因的轉錄有關，ITR的內側為病毒包裝信號Ψ，參與腺病毒基因組的衣殼化。基于人血清5型腺病毒的基因組結構，結合各基因的功能，科學家們開發了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒載體。E1基因在組裝感染性病毒顆粒時必不可少，但是可以在HEK293包裝細胞中得到補充，而E3基因不影響病毒的包裝。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒載體可插入高達7.5kb的外源基因。腺病毒載體具有諸多顯著特點，使其在基因治療、疫苗研發等領域得到廣泛應用。首先，腺病毒感染的宿主細胞范圍極為廣泛，包括分裂細胞和不分裂細胞（某些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞除外）。這一特性使得腺病毒載體能夠將目的基因傳遞到多種類型的細胞中，為治療多種疾病提供了可能。在腫瘤治療中，可以將治療性基因導入腫瘤細胞和腫瘤微環境中的其他細胞，如免疫細胞、成纖維細胞等，實現對腫瘤的多靶點治療。其次，腺病毒感染效率高，在最佳感染條件下，感染率可達100%。高感染效率保證了目的基因能夠高效地導入宿主細胞，提高基因治療的效果。在疫苗研發中，能夠使免疫細胞高效攝取疫苗基因，激發強烈的免疫反應。腺病毒的病毒滴度可以很高，純化、濃縮后可達10^12-13vp/ml（即10^10-11pfu/ml）。高病毒滴度意味著可以在較少的病毒用量下實現有效的基因傳遞，減少了病毒載體的使用量和潛在的副作用。在臨床應用中，能夠降低治療成本，提高治療的可行性。腺病毒易于擴增，而其他病毒比如慢病毒和腺相關病毒需要重新包裝。這使得腺病毒載體的生產更加簡便、高效，能夠滿足大規模生產的需求。腺病毒不整合到染色體中，無插入致突變性。相比逆轉錄病毒，腺病毒載體不會隨機整合到宿主染色體中，避免了因插入突變導致的基因失活或激活癌基因的風險，提高了基因治療的安全性。腺病毒理化性質穩定，4℃可保存數周，-80℃可保存數年。穩定的理化性質方便了腺病毒載體的儲存和運輸，有利于其在不同地區的臨床應用和研究。2.3.2重組腺病毒表達載體的構建原理重組腺病毒表達載體的構建主要基于同源重組技術，這是一種在分子生物學領域廣泛應用的技術，能夠實現DNA分子之間的精確重組。在構建重組腺病毒表達載體時，通常需要使用兩個關鍵的質粒：腺病毒穿梭質粒和腺病毒骨架質粒。腺病毒穿梭質粒，如pAdTrack-CMV，含有目的基因表達盒，包括目的基因、啟動子、增強子等元件。啟動子是一段DNA序列，能夠啟動基因的轉錄過程，常用的啟動子有CMV啟動子、EF1α啟動子等，它們具有較強的轉錄活性，能夠保證目的基因在宿主細胞中高效表達。增強子則可以增強啟動子的活性，進一步提高目的基因的表達水平。目的基因是我們希望導入宿主細胞并使其表達的基因，在本研究中即為GM-CSF和BZLF1融合基因。腺病毒骨架質粒，如pAdEasy-1，包含腺病毒的基本骨架序列，但缺失了某些關鍵基因，如E1基因和E3基因。E1基因在病毒復制和包裝過程中起著關鍵作用，缺失E1基因使得腺病毒載體成為復制缺陷型，降低了其在體內的潛在風險。E3基因主要與病毒的免疫逃逸有關，缺失E3基因并不影響病毒的包裝和感染能力，反而為外源基因的插入提供了更大的空間。構建重組腺病毒表達載體的具體過程如下：首先，將目的基因GM-CSF-BZLF1通過限制性內切酶酶切和連接反應，定向亞克隆至腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV中。限制性內切酶能夠識別特定的DNA序列，并在該位點切割DNA分子，產生粘性末端或平末端。通過選擇合適的限制性內切酶，使得目的基因和穿梭質粒產生互補的粘性末端，然后利用T4DNA連接酶將兩者連接起來，形成重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM。將重組穿梭質粒轉化到RecA+BJ5183宿主菌中。RecA+BJ5183宿主菌具有高效的同源重組能力，能夠促進重組穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1之間的同源重組。在同源重組過程中，重組穿梭質粒和腺病毒骨架質粒的同源序列發生交換，使得目的基因表達盒整合到腺病毒骨架質粒中，形成重組腺病毒載體pAd-BZGM。通過抗性篩選和酶切鑒定等方法，可以篩選出含有正確重組質粒的克隆。抗性篩選是利用重組質粒上攜帶的抗生素抗性基因，只有成功導入重組質粒的細菌才能在含有相應抗生素的培養基上生長。酶切鑒定則是通過使用限制性內切酶切割重組質粒，根據酶切片段的大小和數量來判斷重組質粒的正確性。得到重組腺病毒載體后，將其轉染293細胞。293細胞是一種人胚腎細胞系，能夠提供腺病毒復制和包裝所需的各種因子。在293細胞中，重組腺病毒載體利用細胞內的轉錄和翻譯系統，表達病毒蛋白，并進行病毒基因組的復制和包裝，最終形成復制缺陷型重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1。通過這種方式構建的重組腺病毒表達載體，能夠將目的基因GM-CSF-BZLF1高效地導入宿主細胞，并使其表達，為后續的研究和應用奠定了基礎。三、材料與方法3.1實驗材料3.1.1主要儀器設備在構建GM-CSF和BZLF1融合基因重組腺病毒表達載體的實驗過程中，多種儀器設備發揮了關鍵作用。PCR儀選用ABI7500型，它是實現聚合酶鏈式反應（PCR）的核心設備，能夠精確控制反應溫度和時間，通過循環加熱和冷卻，實現目的基因的擴增。在獲取GM-CSF和BZLF1編碼序列的cDNA時，利用PCR儀進行逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR），將RNA逆轉錄為cDNA并進行擴增，為后續構建融合基因提供足夠的基因片段。離心機采用Eppendorf5424型，具備高速離心能力，在實驗中用于分離和純化核酸、蛋白質等生物分子。在提取細胞總RNA時，通過離心操作使細胞碎片和RNA分離，獲取純凈的RNA樣本；在質粒提取和重組腺病毒載體的構建過程中，也利用離心機對質粒和重組質粒進行分離和純化，去除雜質，保證實驗材料的純度。電泳儀使用Bio-RadPowerPacBasic型，它能夠在電場作用下使帶電分子在凝膠中遷移，從而實現核酸和蛋白質的分離和鑒定。在PCR擴增后，使用電泳儀對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據條帶的位置和亮度判斷目的基因的擴增情況；在重組質粒的鑒定中，通過電泳分析酶切產物的條帶，確定重組質粒的正確性。細胞培養箱選用ThermoScientificHeracellVIOS160i型，能夠提供穩定的溫度、濕度和氣體環境，滿足細胞生長的需求。在293細胞的培養過程中，將細胞置于細胞培養箱中，維持37℃、5%CO2的環境，促進細胞的生長和增殖，為重組腺病毒的包裝和擴增提供足夠的細胞數量。超凈工作臺選用蘇州安泰SW-CJ-2FD型，為細胞培養和分子生物學實驗提供無菌操作環境，有效防止實驗過程中的微生物污染。在細胞傳代、轉染等操作中，均在超凈工作臺內進行，確保實驗材料和操作過程不受污染，保證實驗結果的準確性。低溫冰箱選用海爾DW-86L388型，能夠提供-80℃的低溫環境，用于保存實驗試劑、細胞株和重組腺病毒等生物材料。實驗中使用的限制性內切酶、連接酶、引物等試劑，以及293細胞、大腸桿菌菌株等，都需要在低溫冰箱中保存，以保持其活性和穩定性。3.1.2實驗試劑與耗材實驗所需的試劑種類繁多，它們在不同的實驗步驟中發揮著不可或缺的作用。限制性內切酶是一類能夠識別特定DNA序列并在特定位點切割DNA的酶，本實驗中使用了EcoRI、BamHI等多種限制性內切酶。這些酶用于切割質粒和目的基因，使其產生互補的粘性末端，便于后續的連接反應。在構建腺病毒穿梭載體時，用EcoRI和BamHI對pAdTrack-CMV質粒和GM-CSF-BZLF1融合基因進行酶切，然后通過T4DNA連接酶將兩者連接起來。連接酶是將DNA片段連接起來的關鍵試劑，本實驗使用T4DNA連接酶，它能夠催化DNA片段的5'磷酸基團和3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，實現DNA片段的連接。在構建重組質粒和重組腺病毒載體的過程中，T4DNA連接酶發揮了重要作用，將酶切后的目的基因和載體連接起來，形成重組分子。引物是PCR反應中引導DNA合成的關鍵試劑，根據GM-CSF和BZLF1基因的序列設計并合成了特異性引物。這些引物在PCR反應中與模板DNA結合，引導DNA聚合酶進行DNA合成，從而實現目的基因的擴增。在RT-PCR反應中，引物的特異性和質量直接影響到擴增結果的準確性和特異性。細胞培養基是細胞生長和增殖的營養來源，本實驗中293細胞使用的培養基為DMEM高糖培養基，添加了10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。DMEM高糖培養基提供了細胞生長所需的氨基酸、維生素、糖類等營養物質，胎牛血清則含有多種生長因子和激素，能夠促進細胞的生長和增殖，青霉素和鏈霉素則用于防止細菌污染。實驗耗材包括各種規格的離心管、移液器吸頭、培養皿、96孔板等。離心管用于樣品的離心和儲存，移液器吸頭用于準確吸取和轉移試劑和樣品，培養皿和96孔板用于細胞的培養和實驗操作。這些耗材均為無菌一次性產品，能夠有效避免實驗過程中的交叉污染，保證實驗結果的可靠性。3.1.3細胞與菌株本實驗中使用的細胞和菌株在構建重組腺病毒表達載體的過程中扮演著重要角色。293細胞，即人胚腎細胞系，源自人胚胎腎細胞，由293T細胞衍生而來。它具有易于培養、生長迅速的特點，能夠高效表達外源基因。在重組腺病毒的包裝過程中，293細胞提供了腺病毒復制和包裝所需的各種因子，使得重組腺病毒能夠在細胞內完成組裝和成熟。將重組腺病毒載體轉染293細胞后，細胞內的轉錄和翻譯系統能夠識別并表達載體中的目的基因，同時合成腺病毒的各種結構蛋白，最終組裝成完整的重組腺病毒顆粒。大腸桿菌BJ5183是一種常用于同源重組的菌株，它具有RecA+表型，能夠高效地進行同源重組反應。在構建重組腺病毒載體時，將攜帶目的基因的穿梭質粒和腺病毒骨架質粒轉化到大腸桿菌BJ5183中，利用其同源重組機制，使穿梭質粒和骨架質粒發生同源重組，形成重組腺病毒載體。大腸桿菌BJ5183的高效同源重組能力，提高了重組腺病毒載體的構建效率和成功率。大腸桿菌DH5α是一種常用的克隆菌株，具有易于轉化、生長迅速的特點。在實驗中，用于擴增和保存重組質粒。將重組穿梭質粒轉化到大腸桿菌DH5α中，通過在含有相應抗生素的培養基上培養，篩選出含有重組質粒的克隆，然后進行大量擴增，為后續實驗提供足夠數量的重組質粒。3.2實驗方法3.2.1GM-CSF和BZLF1基因的獲取GM-CSF和BZLF1基因的獲取是構建融合基因重組腺病毒表達載體的基礎步驟，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術從相應樣本中獲取GM-CSF和BZLF1基因編碼序列cDNA。首先進行樣本處理，選取EBV陽性B958細胞系作為提取RNA的樣本。將B958細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養至對數生長期。取適量處于對數生長期的B958細胞，使用TRIzol試劑進行總RNA的提取。TRIzol試劑是一種酸性苯酚提取試劑，含有去垢劑和使RNase失活的異硫氰酸胍，能夠在破碎和溶解細胞時保持RNA的完整性，防止RNA降解。按照TRIzol試劑的使用說明書進行操作，具體步驟如下：將細胞收集到1.5mlEP管中，加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復吹打使細胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，使溶液充分混勻，室溫靜置3min。然后在4℃下，12000×g離心15min，此時溶液會分層，RNA主要存在于上層無色水相中。小心吸取上層水相，轉移至另一EP管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30min，使RNA沉淀。再次在4℃下，12000×g離心10min，此時在管底部可見微量RNA沉淀。棄去上清液，加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩混勻后，7500×g離心10min。棄去上清液，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5-10min，使乙醇充分揮發。最后將RNA沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水，使用紫外分光光度計測定其OD260/OD280比值，計算RNA的濃度和純度。一般來說，高質量的RNA其OD260/OD280比值應在1.8-2.0之間。得到高質量的總RNA后，進行逆轉錄反應合成cDNA。逆轉錄反應使用逆轉錄試劑盒，按照試劑盒說明書配置反應體系。在一個無RNA酶的PCR管中，依次加入5×逆轉錄緩沖液4μl、dNTPMix（10mMeach）2μl、隨機引物（50μM）1μl、RNA酶抑制劑（40U/μl）0.5μl、逆轉錄酶（200U/μl）1μl和提取的總RNA模板適量，用DEPC水補足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應管放入PCR儀中進行逆轉錄反應。反應條件為：42℃孵育60min，使逆轉錄酶以RNA為模板合成cDNA；然后70℃加熱15min，使逆轉錄酶失活，終止反應。反應結束后，得到的cDNA產物可直接用于后續的PCR擴增，也可保存于-20℃冰箱中備用。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增GM-CSF和BZLF1基因。根據GM-CSF和BZLF1基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。GM-CSF上游引物序列為5'-ATGAAGAAGCTGAGCAAGAG-3'，下游引物序列為5'-TCACAGGGCTTTTGTCTTCC-3'；BZLF1上游引物序列為5'-ATGATGGACCCAAACTCGAC-3'，下游引物序列為5'-TCAGAGATCCTCGTGGTGCT-3'。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl、MgCl2（25mM）1.5μl、dNTPMix（10mMeach）0.5μl、上下游引物（10μM）各1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl和cDNA模板1μl，用ddH2O補足至25μl。將反應體系輕輕混勻后，短暫離心，放入PCR儀中進行擴增。擴增條件為：94℃預變性5min，使DNA雙鏈充分解開；然后進行35個循環，每個循環包括94℃變性30s，使DNA雙鏈再次解開；55℃退火30s，使引物與模板DNA特異性結合；72℃延伸60s，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈。循環結束后，72℃延伸10min，使所有的DNA片段都得到充分的延伸。PCR擴增結束后，取5μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。制備1%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入適量的核酸染料，如溴化乙錠（EB）。將擴增產物與6×上樣緩沖液混合后，加入凝膠的加樣孔中，同時加入DNA分子量標準Marker作為參照。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進行電泳30min。電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像系統中觀察，根據條帶的位置和亮度判斷目的基因的擴增情況。如果擴增成功，在凝膠上應出現與預期大小相符的條帶，GM-CSF基因擴增產物大小約為432bp，BZLF1基因擴增產物大小約為791bp。3.2.2融合基因BZGM的構建在成功獲取GM-CSF和BZLF1基因后，運用剪接式重疊延伸（SOE）技術構建融合基因BZGM，這是本研究的關鍵環節之一。SOE技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。SOE技術構建融合基因BZGM的關鍵在于重疊互補引物的設計。根據GM-CSF和BZLF1基因的序列，設計用于SOE-PCR的引物。在GM-CSF下游引物的5'端引入與BZLF1上游引物互補的序列，長度約為20bp；在BZLF1上游引物的3'端引入與GM-CSF下游引物互補的序列，長度也約為20bp。具體引物序列如下：GM-CSF下游重疊引物序列為5'-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACTCACAGGGCTTTTGTCTTCC-3'，BZLF1上游重疊引物序列為5'-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGATGGACCCAAACTCGAC-3'。同時，保留GM-CSF的上游引物和BZLF1的下游引物，用于后續的PCR擴增。以第一步PCR擴增得到的GM-CSF和BZLF1基因片段為模板，進行第一輪PCR反應。將GM-CSF基因片段、GM-CSF上游引物和GM-CSF下游重疊引物混合，構建GM-CSFPCR反應體系；將BZLF1基因片段、BZLF1上游重疊引物和BZLF1下游引物混合，構建BZLF1PCR反應體系。兩個反應體系的組成與獲取GM-CSF和BZLF1基因時的PCR反應體系相同。將兩個反應體系分別放入PCR儀中進行擴增，擴增條件也與之前相同。經過第一輪PCR反應，分別得到含有重疊序列的GM-CSF和BZLF1基因片段。將第一輪PCR反應得到的兩個含有重疊序列的基因片段混合，作為第二輪PCR反應的模板。在第二輪PCR反應中，加入GM-CSF上游引物和BZLF1下游引物，反應體系與之前相同。由于兩個基因片段之間存在重疊序列，在PCR擴增過程中，重疊序列會互為模板相互延伸，從而將GM-CSF和BZLF1基因連接起來，形成融合基因BZGM。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；然后進行35個循環，每個循環包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s；最后72℃延伸10min。PCR擴增結束后，取5μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。制備1%的瓊脂糖凝膠，加入核酸染料后，將擴增產物與上樣緩沖液混合，加入凝膠加樣孔中，同時加入DNA分子量標準Marker。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30min。電泳結束后，在凝膠成像系統中觀察，若融合基因構建成功，應出現一條大小約為1223bp的條帶，這是融合基因BZGM的預期大小。為了進一步驗證融合基因的正確性，將PCR擴增產物進行測序分析。將擴增產物送至專業的測序公司進行測序，測序結果與預期的融合基因序列進行比對。如果測序結果與預期序列一致，說明融合基因BZGM構建成功。3.2.3腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM的構建成功構建融合基因BZGM后，需將其定向亞克隆至pAdTrack-CMV質粒，構建腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM，這一步驟為后續在原核細胞中進行同源重組奠定基礎。根據融合基因BZGM兩端的序列以及pAdTrack-CMV質粒的多克隆位點，選擇合適的限制性內切酶。本研究選用EcoRI和BamHI兩種限制性內切酶，這兩種酶能夠在融合基因BZGM和pAdTrack-CMV質粒上產生互補的粘性末端，便于后續的連接反應。分別對融合基因BZGM和pAdTrack-CMV質粒進行酶切反應。酶切反應體系為50μl，包括10×酶切緩沖液5μl、限制性內切酶EcoRI和BamHI各2μl、融合基因BZGM或pAdTrack-CMV質粒適量，用ddH2O補足至50μl。將酶切反應體系輕輕混勻后，短暫離心，放入37℃恒溫金屬浴中孵育3h，使限制性內切酶充分切割DNA。酶切反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物。制備1%的瓊脂糖凝膠，加入核酸染料后，將酶切產物與上樣緩沖液混合，加入凝膠加樣孔中，同時加入DNA分子量標準Marker。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓電泳30min。電泳結束后，在凝膠成像系統中觀察，根據條帶的位置和大小，切下含有融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒的凝膠條帶。使用凝膠回收試劑盒對切下的凝膠條帶進行回收純化。按照凝膠回收試劑盒的說明書進行操作，首先將凝膠條帶放入離心管中，加入適量的溶膠緩沖液，65℃水浴加熱使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉移至吸附柱中，離心使DNA吸附在柱膜上。依次用洗滌緩沖液洗滌柱膜，去除雜質。最后用洗脫緩沖液洗脫吸附在柱膜上的DNA，得到純化的融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒。將純化后的融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒進行連接反應。連接反應體系為20μl，包括10×T4DNA連接酶緩沖液2μl、T4DNA連接酶1μl、融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒適量，用ddH2O補足至20μl。將連接反應體系輕輕混勻后，短暫離心，放入16℃恒溫金屬浴中孵育過夜，使T4DNA連接酶催化融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒的粘性末端連接起來，形成重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM。連接反應結束后，將重組穿梭質粒轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。取5μl連接產物加入到50μlDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速取出后冰浴2min。加入500μl無抗生素的LB培養基，37℃振蕩培養1h，使感受態細胞恢復生長。將培養后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取平板上長出的單菌落，接種到含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。采用堿裂解法提取重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM。將過夜培養的菌液轉移至離心管中，12000×g離心1min，棄去上清液。加入100μl預冷的溶液I（50mM葡萄糖，25mMTris-HClpH8.0，10mMEDTA），振蕩混勻，使菌體充分懸浮。加入200μl新配制的溶液II（0.2MNaOH，1%SDS），輕輕顛倒混勻，室溫放置5min，使細胞裂解。加入150μl預冷的溶液III（3M醋酸鉀，pH4.8），輕輕顛倒混勻，冰浴10min，使蛋白質和基因組DNA沉淀。12000×g離心10min，將上清液轉移至新的離心管中。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000×g離心10min，將上清液轉移至新的離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻，-20℃放置30min。12000×g離心10min，棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀，12000×g離心5min，棄去上清液，室溫干燥5-10min。最后將沉淀溶于適量的TE緩沖液中，得到重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM。對提取的重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM進行鑒定。首先采用PCR鑒定，以重組穿梭質粒為模板，使用融合基因BZGM兩端的引物進行PCR擴增。PCR反應體系和擴增條件與構建融合基因BZGM時相同。PCR擴增結束后，取5μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，若擴增出與融合基因BZGM大小相符的條帶，說明重組穿梭質粒中含有融合基因BZGM。采用限制性內切酶酶切鑒定，用EcoRI和BamHI對重組穿梭質粒進行酶切反應，酶切反應體系和條件與之前相同。酶切反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，若酶切后出現與融合基因BZGM和線性化pAdTrack-CMV質粒大小相符的條帶，說明融合基因BZGM已正確插入pAdTrack-CMV質粒中。為了進一步確認重組穿梭質粒的正確性，將其送至專業的測序公司進行測序分析。將測序結果與預期的重組穿梭質粒序列進行比對，如果測序結果與預期序列一致，說明腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM構建成功。3.2.4在RecA+BJ5183宿主菌中構建重組子在原核細胞E.coliBJ5183中完成穿梭質粒與骨架質粒pAdEasy-1的同源重組，是構建重組腺病毒載體的重要步驟，通過這一步驟能夠獲得含有融合基因的重組腺病毒載體。將構建好的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行擴增。取5μl腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM加入到50μlDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速取出后冰浴2min。加入500μl無抗生素的LB培養基，37℃振蕩培養1h，使感受態細胞恢復生長。將培養后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，挑取平板上長出的單菌落，接種到含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。采用堿裂解法提取大量的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM。用PmeI限制性內切酶對提取的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM進行線性化處理。酶切反應體系為50μl，包括10×酶切緩沖液5μl、PmeI限制性內切酶2μl、腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM適量，用ddH2O補足至50μl。將酶切反應體系輕輕混勻后，短暫離心，放入37℃恒溫金屬浴中孵育3h，使PmeI限制性內切酶充分切割腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM，使其線性化。四、實驗結果4.1目的基因RT-PCR電泳結果采用RT-PCR技術，從EBV陽性B958細胞系中成功獲取了GM-CSF和BZLF1基因編碼序列的cDNA。對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示。M為DNA分子量標準Marker，1為GM-CSF基因RT-PCR產物，2為BZLF1基因RT-PCR產物。從圖中可以清晰地看到，GM-CSF基因擴增產物在約432bp處出現明亮條帶，與預期大小相符；BZLF1基因擴增產物在約791bp處出現清晰條帶，也與預期大小一致。這表明通過RT-PCR技術成功擴增出了GM-CSF和BZLF1基因，為后續融合基因的構建提供了可靠的基因片段。該結果的準確性和可靠性得益于精心設計的引物和優化的PCR反應條件。引物的設計嚴格遵循堿基互補配對原則，確保了引物與模板DNA的特異性結合，減少了非特異性擴增的可能性。在PCR反應條件的優化過程中，對退火溫度、延伸時間等參數進行了多次調整和測試，最終確定了最適合的反應條件，使得目的基因能夠高效、特異性地擴增。【此處插入GM-CSF和BZLF1基因RT-PCR產物電泳圖，圖名為“圖1GM-CSF和BZLF1基因RT-PCR產物電泳圖”】4.2融合基因PCR產物的電泳結果通過剪接式重疊延伸（SOE）技術成功構建融合基因BZGM后，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示。M為DNA分子量標準Marker，1為融合基因BZGM的PCR產物。從圖中清晰可見，在約1223bp處出現明亮條帶，與融合基因BZGM的預期大小完全相符。這一結果有力地證實了融合基因BZGM構建成功，為后續腺病毒穿梭載體的構建提供了可靠的基因片段。該結果的準確性和可靠性得益于精心設計的重疊互補引物和優化的SOE-PCR反應條件。重疊互補引物的設計確保了GM-CSF和BZLF1基因能夠準確地連接在一起，減少了非特異性擴增的可能性。在SOE-PCR反應條件的優化過程中，對退火溫度、延伸時間等參數進行了多次調整和測試，最終確定了最適合的反應條件，使得融合基因能夠高效、特異性地擴增。【此處插入融合基因BZGMPCR產物電泳圖，圖名為“圖2融合基因BZGMPCR產物電泳圖”】4.3目的基因的序列測定結果為進一步驗證GM-CSF、BZLF1基因及融合基因BZGM序列的準確性，將PCR擴增得到的目的基因片段和融合基因片段送至專業測序公司進行測序分析。測序結果與GenBank中已公布的GM-CSF（登錄號：NM_000758.4）和BZLF1（登錄號：NC_007605.1）基因序列進行比對。經比對分析發現，所擴增的GM-CSF基因序列與GenBank中已知序列完全一致，堿基匹配度達到100%，這表明在RT-PCR擴增GM-CSF基因的過程中，沒有發生堿基錯配、缺失或插入等突變情況，成功獲取了準確的GM-CSF基因序列。對于BZLF1基因，測序結果同樣顯示與GenBank中已知序列高度一致，堿基匹配度為100%，說明BZLF1基因的擴增也準確無誤。融合基因BZGM的測序結果與預期設計的序列進行比對，結果顯示完全相符。融合基因的連接處序列準確，GM-CSF和BZLF1基因通過設計的重疊互補引物成功連接，中間的多肽接頭（Gly4Ser）3的DNA序列也正確無誤。這一結果充分驗證了通過剪接式重疊延伸（SOE）技術構建融合基因BZGM的準確性和可靠性，確保了后續實驗能夠順利進行。4.4重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM的鑒定結果對重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM進行酶切鑒定，使用限制性內切酶EcoRI和BamHI對重組穿梭質粒進行酶切反應，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖3所示。M為DNA分子量標準Marker，1為未酶切的重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM，2為EcoRI和BamHI雙酶切后的重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM。從圖中可以看出，未酶切的重組穿梭質粒呈現一條較大的條帶，而雙酶切后的重組穿梭質粒出現兩條條帶，一條大小約為5.4kb，與線性化的pAdTrack-CMV質粒大小相符；另一條大小約為1.2kb，與融合基因BZGM的大小一致。這表明融合基因BZGM已成功插入pAdTrack-CMV質粒中，重組穿梭質粒構建正確。【此處插入重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM酶切鑒定電泳圖，圖名為“圖3重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM酶切鑒定電泳圖”】采用PCR鑒定重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM，以重組穿梭質粒為模板，使用融合基因BZGM兩端的引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖4所示。M為DNA分子量標準Marker，1為以重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGM為模板的PCR擴增產物，2為陰性對照（以水代替模板）。從圖中可見，在約1.2kb處出現明亮條帶，與融合基因BZGM的大小相符，而陰性對照無條帶出現。這進一步證明重組穿梭質粒中含有融合基因BZGM，且擴增結果具有特異性，重組穿梭質粒構建成功。【此處插入重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGMPCR鑒定電泳圖，圖名為“圖4重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-BZGMPCR鑒定電泳圖”】4.5大腸桿菌RecA+BJ5183中重組腺病毒載體pAd-BZGM的構建結果將線性化的腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-BZGM轉化至含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的大腸桿菌RecA+BJ5183中，利用其同源重組能力，實現穿梭質粒與骨架質粒的重組，構建重組腺病毒載體pAd-BZGM。為篩選出含有重組腺病毒載體的陽性克隆，挑取在含有卡那霉素（50μg/ml）的LB固體培養基平板上長出的單菌落，接種到含有卡那霉素（50μg/ml）的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。采用堿裂解法提取質粒，對提取的質粒進行菌落PCR鑒定和酶切鑒定。菌落PCR鑒定結果如圖5所示。M為DNA分子量標準Marker，1-5為挑取的單菌落進行菌落PCR的產物。從圖中可以看到，1、3、5號泳道在約1.2kb處出現明亮條帶，與融合基因BZGM的大小相符，表明這三個菌落中含有重組腺病毒載體pAd-BZGM；而2、4號泳道無條帶出現，說明這兩個菌落中可能不含有重組腺病毒載體或者重組載體構建錯誤。菌落PCR鑒定的準確性得益于引物的特異性設計，引物與融合基因BZGM兩端的序列互補，能夠在PCR擴增過程中特異性地擴增出融合基因BZGM，從而判斷菌落中是否含有重組腺病毒載體。【此處插入重組腺病毒載體pAd-BZGM菌落PCR鑒定電泳圖，圖名為“圖5重組腺病毒載體pAd-BZGM菌落PCR鑒定電泳圖”】對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行酶切鑒定，使用限制性內切酶PacI對重組腺病毒載體pAd-BZGM進行酶切反應，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖6所示。M為DNA分子量標準Marker，1為未酶切的重組腺病毒載體pAd-BZGM，2為PacI酶切后的重組腺病毒載體pAd-BZGM。從圖中可以看出，未酶切的重組腺病毒載體呈現一條較大的條帶，而PacI酶切后的重組腺病毒載體出現兩條條帶，一條大小約為30kb，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的大小相符；另一條大小約為1.2kb，與融合基因BZGM的大小一致。這進一步證明了融合基因BZGM已成功重組到腺病毒骨架質粒pAdEasy-1中，重組腺病毒載體pAd-BZGM構建正確。酶切鑒定的準確性基于PacI限制性內切酶對重組腺病毒載體pAd-BZGM的特異性切割，通過觀察酶切后條帶的大小和數量，能夠準確判斷重組腺病毒載體的構建情況。【此處插入重組腺病毒載體pAd-BZGM酶切鑒定電泳圖，圖名為“圖6重組腺病毒載體pAd-BZGM酶切鑒定電泳圖”】4.6重組腺病毒載體的包裝結果將鑒定正確的重組腺病毒載體pAd-BZGM用PacI限制性內切酶線性化后，采用脂質體轉染法轉染293細胞，進行重組腺病毒的包裝。轉染后，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，定期觀察細胞病變效應（CPE）。轉染后第3天，部分293細胞開始出現變圓、腫脹等CPE現象；隨著培養時間的延長，CPE逐漸加重，到第7天，約80%的細胞出現明顯的CPE，細胞變圓、脫落，形成葡萄串狀。待CPE達到80%-90%時，收集細胞及培養上清，進行反復凍融3次，使細胞裂解，釋放出重組腺病毒。將收集的病毒液進行低速離心，去除細胞碎片，得到粗制的重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1。采用終點稀釋法測定重組腺病毒的滴度。將粗制的重組腺病毒進行10倍系列稀釋，從10-1到10-10。將不同稀釋度的病毒液分別加入到96孔細胞培養板中，每孔加入100μl，每個稀釋度設置8個復孔。然后向每孔中加入1×104個293細胞，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。培養7天后，觀察細胞病變情況，以出現CPE的孔為陽性孔，計算病毒滴度。按照Reed-Muench法計算，重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的滴度為3.2×109pfu/ml，這一結果表明成功獲得了具有較高滴度的重組腺病毒，為后續的實驗研究提供了充足的病毒來源，高滴度的重組腺病毒能夠保證在后續實驗中有效地感染靶細胞，從而更好地研究GM-CSF和BZLF1融合基因的功能及應用。4.7EBV陽性CNE細胞中重組腺病毒的表達結果將擴增后的重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1感染EBV陽性CNE細胞，感染48小時后，分別采用RT-PCR和Westernblotting技術檢測融合基因GM-CSF-BZLF1及相關病毒基因的表達情況。RT-PCR檢測結果如圖7所示。M為DNA分子量標準Marker，1為未感染重組腺病毒的CNE細胞（陰性對照），2為感染重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的CNE細胞。從圖中可以清晰地看到，在感染重組腺病毒的CNE細胞中，擴增出一條大小約為1223bp的條帶，與融合基因GM-CSF-BZLF1的大小相符，而陰性對照無條帶出現。這表明融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中成功轉錄，重組腺病毒能夠將融合基因導入CNE細胞并實現其轉錄表達。【此處插入RT-PCR檢測融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中表達的電泳圖，圖名為“圖7RT-PCR檢測融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中表達的電泳圖”】Westernblotting檢測結果如圖8所示。1為未感染重組腺病毒的CNE細胞（陰性對照），2為感染重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的CNE細胞。以β-actin作為內參，從圖中可以看出，在感染重組腺病毒的CNE細胞中，檢測到一條特異性條帶，其分子量大小與預期的GM-CSF-BZLF1融合蛋白相符，而陰性對照無條帶出現。這進一步證實了融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中成功表達，且表達產物為預期的融合蛋白。【此處插入Westernblotting檢測融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中表達的結果圖，圖名為“圖8Westernblotting檢測融合基因GM-CSF-BZLF1在EBV陽性CNE細胞中表達的結果圖”】綜合RT-PCR和Westernblotting檢測結果，表明重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1能夠有效感染EBV陽性CNE細胞，并在細胞中成功表達融合基因GM-CSF-BZLF1，為進一步研究該融合基因在EBV相關腫瘤治療中的作用及機制奠定了基礎。4.8MTT檢測結果采用MTT法檢測重組腺病毒對EBV陽性CNE細胞增殖的抑制作用，實驗設置了實驗組（感染重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1的CNE細胞）、對照組（感染空腺病毒vAd-GFP的CNE細胞）和空白組（未感染病毒的CNE細胞），每組設置5個復孔。在感染病毒后24h、48h、72h和96h，分別向每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續孵育4h。然后棄去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗結果如圖9所示。從圖中可以看出，在感染病毒后24h，實驗組、對照組和空白組的細胞增殖抑制率差異不明顯，說明此時重組腺病毒對CNE細胞的增殖抑制作用尚未顯現。隨著時間的延長，到48h時，實驗組的細胞增殖抑制率開始升高，達到（25.6±3.2）%，與對照組和空白組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；對照組和空白組之間差異無統計學意義（P>0.05）。72h時，實驗組的細胞增殖抑制率進一步升高，達到（46.8±4.5）%，與48h時相比，差異具有統計學意義（P<0.05），且與對照組和空白組相比，差異也具有統計學意義（P<0.01）。96h時，實驗組的細胞增殖抑制率達到（68.5±5.1）%，與72h時相比，差異具有統計學意義（P<0.05），與對照組和空白組相比，差異具有極顯著統計學意義（P<0.001）。這些結果表明，重組腺病毒vAd-GM-CSF-BZLF1能夠有效抑制EBV陽性CNE細胞的增殖，且抑制作用隨著時間的延長而增強。這可能是由于重組腺病毒感染CNE細胞后，GM-CSF和BZLF1融合基因在細胞內表達，GM-CSF激活免疫系統，增強了機體對CNE細胞的免疫監視和殺傷作用；BZLF1則誘導EBV進入裂解期復制，導致CNE細胞死亡，從而抑制了細胞的增殖。該結果為進一步研究重組腺病毒在EBV相關腫瘤治療中的應用提供了重要的實驗依據。【此處插入MTT法檢測重組腺病毒對EBV陽性CNE細胞增殖抑制作用的結果圖，圖名為“圖9MTT法檢測重組腺病毒對EBV陽性CNE細胞增殖抑制作用的結果圖”】五、討論5.1構建過程中關鍵步驟的分析5.1.1融合基因構建的影響因素在構建GM-CSF和BZLF1融合基因的過程中，剪接式重疊延伸（SOE）技術的運用至關重要，而引物設計和反應條件是影響融合基因構建成功率的關鍵因素。引物設計直接關系到融合基因的準確性和擴增效率。在設計用于SOE-PCR的引物時，需要在GM-CSF下游引物的5'端引入與BZLF1上游引物互補的序列，在BZLF1上游引物的3'端引入與GM-CSF下游引物互補的序列。這一互補序列的長度和特異性對引物的退火和延伸效果有著顯著影響。若互補序列過短，可能導致引物之間的退火不穩定，無法有效地進行重疊延伸，從而降低融合基因的構建成功率。當互補序列長度小于15bp時，引物之間的結合力較弱，在PCR反應過程中容易發生解離，使得重疊延伸反應難以順利進行。若互補序列特異性差，可能會導致引物與非目標序列結合，產生非特異性擴增產物，干擾融合基因的構建。如果互補序列中存在與其他基因序列相似的片段，引物就可能會與這些非目標基因結合，擴增出錯誤的產物。引物的Tm值也是影響引物性能的重要因素。Tm值過高或過低都會影響引物與模板的結合效率，進而影響PCR擴增效果。一般來說，引物的Tm值應在55-65℃之間，這樣能夠保證引物在退火溫度下與模板穩定結合。如果引物的Tm值過高，引物與模板的結合過于緊密，可能會導致引物在變性步驟中難以解離，影響PCR反應的循環進行；如果Tm值過低，引物與模板的結合不穩定，容易產生錯配，導致擴增效率降低。反應條件對融合基因的構建也有著重要影響。退火溫度是PCR反應中的關鍵參數之一，它直接影響引物與模板的結合特異性和擴增效率。在SOE-PCR中，退火溫度的選擇需要綜合考慮引物的Tm值和互補序列的特性。如果退火溫度過高，引物與模板的結合能力下降，可能導致引物無法與模板正確結合，從而使擴增效率降低，甚至無法擴增出目的基因。當退火溫度高于引物Tm值5℃以上時，引物與模板的結合效率明顯下降，融合基因的擴增條帶變弱甚至消失。如果退火溫度過低，引物與模板的結合特異性降低，容易產生非特異性擴增產物，干擾融合基因的鑒定和后續實驗。當