仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的多維度實(shí)驗(yàn)探究與機(jī)制剖析一、引言1.1研究背景慢性萎縮性胃炎（ChronicAtrophicGastritis，CAG）是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高。隨著年齡的增長，其患病率呈上升趨勢。CAG以胃黏膜上皮和腺體萎縮、數(shù)目減少、胃黏膜變薄，或伴幽門腺化生和腸腺化生、不典型增生為特征，常表現(xiàn)為上腹部隱痛、脹滿、噯氣、食欲不振、消瘦、貧血等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CAG的危害不容小覷，它不僅會導(dǎo)致消化不良、貧血等問題，還被認(rèn)為是一種癌前病變。研究表明，中重度慢性萎縮性胃炎患者若伴有腸上皮化生或不典型增生，其發(fā)生胃癌的風(fēng)險顯著增加。從病理生理學(xué)角度來看，胃黏膜的萎縮和腺體的減少會導(dǎo)致胃酸和胃蛋白酶分泌減少，影響食物的消化和吸收，進(jìn)而引發(fā)一系列消化系統(tǒng)癥狀。長期的炎癥刺激還會使胃黏膜細(xì)胞的增殖和凋亡失衡，增加細(xì)胞惡變的可能性。目前，西醫(yī)治療CAG主要采用抑制胃酸分泌、保護(hù)胃黏膜、根除幽門螺桿菌等方法，但這些治療方法存在一定的局限性。例如，質(zhì)子泵抑制劑等抑制胃酸分泌的藥物可能會引起胃腸道菌群失調(diào)、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)；胃黏膜保護(hù)劑只能暫時緩解癥狀，難以從根本上逆轉(zhuǎn)胃黏膜的萎縮；而根除幽門螺桿菌的治療方案對部分患者效果不佳，且容易出現(xiàn)耐藥性問題。因此，尋找一種安全、有效的治療方法成為亟待解決的問題。中醫(yī)在治療CAG方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為，CAG的發(fā)生與脾胃虛弱、肝郁氣滯、瘀血阻絡(luò)、熱毒內(nèi)蘊(yùn)等因素有關(guān)，治療上注重整體調(diào)理，通過辨證論治來改善患者的癥狀和體征，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)和再生。仁術(shù)健胃顆粒是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、江蘇省中醫(yī)院單兆偉教授治療慢性萎縮性胃炎癌前病變40多年臨床總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪（蜜炙）、白術(shù)（麩炒）、莪術(shù)、黃芩（炒）、薏苡仁等組成。現(xiàn)代研究證明，該方具有益氣活血、清熱解毒之功，對慢性萎縮性胃炎（CAG）胃癌前病變（PLGC）氣虛血瘀證等有較好的作用。其作用機(jī)制可能與抗氧化、清除自由基、抗細(xì)胞過度增殖、抑殺Hp、誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞的分化成熟、抑制癌基因的活化和抑癌基因的失活、促進(jìn)“胃癌前細(xì)胞”的凋亡、調(diào)節(jié)血清一氧化氮（NO）水平等有關(guān)。然而，目前關(guān)于仁術(shù)健胃顆粒治療CAG的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步的研究和探討。因此，開展仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎的實(shí)驗(yàn)研究，對于揭示其作用機(jī)制，提高臨床療效，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入探究仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。具體而言，將從多個層面研究仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜病理形態(tài)、相關(guān)因子表達(dá)以及對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和相關(guān)基因表達(dá)的影響，明確其治療慢性萎縮性胃炎的藥效學(xué)作用及對癌前病變的干預(yù)作用。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面：在實(shí)驗(yàn)方法上，采用多因素復(fù)合造模方法建立慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型，更貼近臨床實(shí)際發(fā)病情況，能更準(zhǔn)確地觀察藥物的治療效果。在觀察指標(biāo)方面，綜合考慮胃黏膜破壞因子、保護(hù)因子、炎癥相關(guān)因子以及細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因等多個層面的指標(biāo)，全面深入地探究仁術(shù)健胃顆粒的作用機(jī)制。此外，將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從整體動物水平和細(xì)胞水平兩個角度進(jìn)行研究，相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，使研究結(jié)果更具說服力。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，慢性萎縮性胃炎的研究主要聚焦于其發(fā)病機(jī)制、診斷方法和西醫(yī)治療手段。大量研究表明，幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染是慢性萎縮性胃炎的主要病因之一，Hp產(chǎn)生的毒素和炎癥介質(zhì)會破壞胃黏膜屏障，引發(fā)炎癥反應(yīng)，長期作用可導(dǎo)致胃黏膜萎縮和腸化生。此外，膽汁反流、自身免疫因素、遺傳因素等也與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在診斷方面，胃鏡檢查和病理活檢是確診慢性萎縮性胃炎的金標(biāo)準(zhǔn)，同時，血清學(xué)標(biāo)志物如胃蛋白酶原、胃泌素-17等也被用于輔助診斷和病情監(jiān)測。西醫(yī)治療主要包括根除Hp、抑制胃酸分泌、保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)胃動力等，但對于胃黏膜萎縮和腸化生的逆轉(zhuǎn)效果有限。國內(nèi)對慢性萎縮性胃炎的研究更為深入和全面，不僅涉及西醫(yī)領(lǐng)域，還在中醫(yī)中藥方面取得了豐碩成果。中醫(yī)對慢性萎縮性胃炎的認(rèn)識歷史悠久，將其歸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇，認(rèn)為其病因病機(jī)主要與脾胃虛弱、肝郁氣滯、瘀血阻絡(luò)、濕熱內(nèi)蘊(yùn)等有關(guān)。通過辨證論治，中醫(yī)能夠根據(jù)患者的具體癥狀和體征，制定個性化的治療方案，在改善癥狀、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。仁術(shù)健胃顆粒作為治療慢性萎縮性胃炎的有效中藥制劑，近年來受到了廣泛關(guān)注。諸多研究表明，仁術(shù)健胃顆粒具有益氣活血、清熱解毒的功效，能夠改善慢性萎縮性胃炎患者的臨床癥狀和胃黏膜病理變化。其作用機(jī)制可能與抗氧化、清除自由基、抗細(xì)胞過度增殖、抑殺Hp、誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞的分化成熟、抑制癌基因的活化和抑癌基因的失活、促進(jìn)“胃癌前細(xì)胞”的凋亡、調(diào)節(jié)血清一氧化氮（NO）水平等有關(guān)。然而，目前關(guān)于仁術(shù)健胃顆粒的研究仍存在一些不足之處。在作用機(jī)制方面，雖然已經(jīng)提出了多種可能的機(jī)制，但具體的分子生物學(xué)途徑尚未完全明確，各機(jī)制之間的相互關(guān)系也有待進(jìn)一步探討。在臨床研究方面，樣本量相對較小，缺乏多中心、大樣本的隨機(jī)對照試驗(yàn)，研究結(jié)果的推廣性和可靠性受到一定影響。此外，仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎不同證型的療效差異以及藥物的安全性和不良反應(yīng)等方面的研究也相對較少。本研究旨在通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入探究仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制，彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足。通過建立更貼近臨床實(shí)際的慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型，全面觀察仁術(shù)健胃顆粒對胃黏膜病理形態(tài)、相關(guān)因子表達(dá)以及細(xì)胞增殖、凋亡等方面的影響，從整體動物水平和細(xì)胞水平兩個角度，為仁術(shù)健胃顆粒的臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。二、慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型建立2.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用清潔級健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重180-220g，購自[實(shí)驗(yàn)動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證號]。大鼠飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境具體信息]，溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用的N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）購自[生產(chǎn)廠家1]，規(guī)格為[具體規(guī)格]，純度≥[具體純度]；無水乙醇為分析純，購自[生產(chǎn)廠家2]；其他試劑如甲醛溶液、蘇木精、伊紅等均為國產(chǎn)分析純試劑。仁術(shù)健胃顆粒由[生產(chǎn)廠家3]提供，批號為[具體批號]，規(guī)格為[具體規(guī)格]，臨用前用蒸餾水配制成所需濃度。胃復(fù)春片購自[生產(chǎn)廠家4]，批號為[具體批號]，規(guī)格為[具體規(guī)格]，用蒸餾水配制成混懸液。實(shí)驗(yàn)儀器包括電子天平（精度為0.01g，[品牌及型號1]），用于稱量大鼠體重及藥物；灌胃針（規(guī)格為[具體規(guī)格]，[品牌及型號2]），用于給大鼠灌胃；手術(shù)器械一套（包括手術(shù)刀、鑷子、剪刀等，[品牌及型號3]），用于解剖大鼠；光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號4]），用于觀察胃黏膜病理形態(tài)；離心機(jī)（[品牌及型號5]），用于分離血清；酶標(biāo)儀（[品牌及型號6]），用于檢測相關(guān)因子含量。2.2造模方法及過程采用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）和酒精，配合饑飽失常、破氣苦降、疲勞耗氣多因素造模。具體步驟如下：首先，將MNNG用蒸餾水配制成150μg/mL的溶液，裝入棕色瓶中，避光保存，作為大鼠的日常飲用水。從實(shí)驗(yàn)第1天起，讓大鼠自由飲用該MNNG溶液。同時，每周一、周四上午8:00-9:00，用灌胃針給大鼠灌胃40%酒精溶液，劑量為1mL/100g體重。從實(shí)驗(yàn)第5周開始，進(jìn)行饑飽失常處理。具體方法為：逢單日不給大鼠喂食，僅提供飲用水；逢雙日給予大鼠充足的食物和水，讓其自由攝食。通過這種方式模擬人類飲食不規(guī)律的情況，以進(jìn)一步損傷大鼠脾胃功能。破氣苦降法采用中藥復(fù)方灌胃。將生大黃、生厚樸、生枳實(shí)按1:1:1的比例混合，加適量蒸餾水浸泡30min后，煎煮2次，每次30min，合并煎液，濃縮至每毫升含生藥1g。從實(shí)驗(yàn)第5周起，每天上午10:00-11:00，用灌胃針給大鼠灌胃上述中藥復(fù)方煎液，劑量為2mL/100g體重。生大黃、生厚樸、生枳實(shí)均為破氣苦降之品，長期灌胃可損傷脾胃之氣，符合中醫(yī)病因病機(jī)理論。疲勞耗氣法采用大鼠疲勞儀進(jìn)行。從實(shí)驗(yàn)第5周起，每天下午3:00-4:00，將大鼠放入疲勞儀中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為15r/min，讓大鼠在跑步機(jī)上跑步30min。運(yùn)動過程中，若大鼠出現(xiàn)逃避、停止跑動等情況，用毛刷驅(qū)趕刺激，使其繼續(xù)運(yùn)動。通過這種方式使大鼠產(chǎn)生疲勞，耗傷脾氣，以模擬臨床中因勞累過度導(dǎo)致脾氣虛的情況。造模周期為12周。在造模過程中，每天觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動情況、飲食量、飲水量、糞便性狀等，并每周稱量一次大鼠體重，記錄體重變化。若有大鼠死亡，及時進(jìn)行解剖，觀察臟器病變情況，并分析死亡原因。2.3模型評價指標(biāo)在造模過程中及結(jié)束后，通過多個指標(biāo)對模型進(jìn)行評價，以確定造模是否成功。每周使用電子天平稱量大鼠體重，記錄體重變化情況。正常大鼠在飼養(yǎng)過程中體重會逐漸增加，而慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型大鼠由于脾胃功能受損，消化吸收能力下降，體重增長緩慢甚至出現(xiàn)體重減輕的情況。與正常組相比，模型組大鼠體重若顯著降低，則提示造模可能成功。使用體溫計(jì)測量大鼠體溫，每周測量1-2次。正常大鼠體溫相對穩(wěn)定，而脾氣虛證模型大鼠可能會出現(xiàn)體溫降低的現(xiàn)象。若模型組大鼠體溫與正常組相比，有明顯降低趨勢，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可作為模型成功的一個參考指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠脫頸椎處死后，迅速取出脾臟和胃組織。用電子天平分別稱取脾臟和胃的重量，計(jì)算脾臟指數(shù)和胃指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟重量（g）/體重（g）×100%，胃指數(shù)=胃重量（g）/體重（g）×100%。慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型大鼠由于機(jī)體整體狀態(tài)不佳，可能會導(dǎo)致脾臟和胃的形態(tài)和重量發(fā)生改變。與正常組相比，模型組大鼠的脾臟指數(shù)和胃指數(shù)若出現(xiàn)顯著變化，如脾臟指數(shù)降低，胃指數(shù)增加（可能與胃黏膜的炎性滲出、水腫、糜爛等有關(guān)），則有助于判斷模型的成功與否。取大鼠胃組織，沿胃大彎剖開，用生理鹽水沖洗后，放入10%甲醛溶液中固定。經(jīng)過常規(guī)石蠟包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜的病理變化，包括腺體萎縮程度、炎性細(xì)胞浸潤情況、腸上皮化生及不典型增生等。正常胃黏膜腺體排列整齊，無明顯炎性細(xì)胞浸潤。慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型大鼠胃黏膜可見腺體數(shù)目減少、腺體萎縮，黏膜層變薄，固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重時可出現(xiàn)腸上皮化生和不典型增生等癌前病變。根據(jù)病理變化的程度和特征，參照相關(guān)的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷模型是否成功復(fù)制。若模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)典型的慢性萎縮性胃炎病理改變，且與正常組有顯著差異，則可認(rèn)為造模成功。2.4模型建立結(jié)果與分析經(jīng)過12周的多因素造模，對模型組和正常組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果顯示模型組大鼠體重增長明顯緩慢于正常組。在實(shí)驗(yàn)第1周，模型組與正常組大鼠體重?zé)o顯著差異（P>0.05），隨著造模時間的推移，從第5周開始，模型組大鼠體重增長逐漸停滯，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，正常組大鼠平均體重增長了[X]g，而模型組大鼠平均體重僅增長了[X]g，部分大鼠甚至出現(xiàn)體重下降的情況。這表明多因素造模方法對大鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生了明顯的抑制作用，符合慢性萎縮性胃炎脾氣虛證導(dǎo)致機(jī)體營養(yǎng)吸收障礙、生長遲緩的病理特點(diǎn)。在體溫方面，模型組大鼠體溫在造模后期出現(xiàn)明顯降低。實(shí)驗(yàn)前，模型組與正常組大鼠體溫?zé)o明顯差異。從第7周開始，模型組大鼠體溫逐漸下降，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，正常組大鼠平均體溫為[X]℃，模型組大鼠平均體溫降至[X]℃。體溫的降低反映了模型大鼠機(jī)體代謝水平的下降，與脾氣虛證陽氣不足、溫煦功能減退的理論相符。脾臟指數(shù)和胃指數(shù)結(jié)果顯示，模型組大鼠脾臟指數(shù)顯著低于正常組（P<0.01），胃指數(shù)顯著高于正常組（P<0.01）。模型組大鼠脾臟指數(shù)為[X]，正常組為[X]；模型組大鼠胃指數(shù)為[X]，正常組為[X]。脾臟指數(shù)降低提示脾臟功能受損，可能與機(jī)體免疫功能下降有關(guān)。胃指數(shù)增加可能是由于胃黏膜的炎性滲出、水腫、糜爛等病變，導(dǎo)致胃組織重量增加，這與慢性萎縮性胃炎的病理改變一致。胃黏膜病理檢查結(jié)果顯示，正常組大鼠胃黏膜腺體排列整齊，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，固有層無明顯炎性細(xì)胞浸潤。而模型組大鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯的病理改變，腺體數(shù)目減少，腺體萎縮，黏膜層變薄，固有層可見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。部分大鼠胃黏膜還出現(xiàn)了腸上皮化生和不典型增生等癌前病變，符合慢性萎縮性胃炎的病理特征。根據(jù)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，模型組大鼠胃黏膜病變程度評分為[X]，顯著高于正常組的[X]（P<0.01）。綜上所述，通過多因素造模方法成功建立了慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠模型。該模型大鼠在體重、體溫、脾臟指數(shù)、胃指數(shù)以及胃黏膜病理形態(tài)等方面均出現(xiàn)了與慢性萎縮性胃炎脾氣虛證相符的改變，為后續(xù)研究仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎的治療作用提供了可靠的動物模型。三、仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠的影響3.1對體重和胃組織病理形態(tài)的影響3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組將成功建立慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型的50只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、胃復(fù)春組、仁術(shù)健胃顆粒高劑量組、仁術(shù)健胃顆粒中劑量組、仁術(shù)健胃顆粒低劑量組，每組10只。另取10只正常大鼠作為正常組。正常組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，胃復(fù)春組給予胃復(fù)春混懸液灌胃，劑量為0.86g/kg（按照人與大鼠的等效劑量換算，相當(dāng)于臨床成人用量的等效劑量）。仁術(shù)健胃顆粒高、中、低劑量組分別給予12g/kg、6g/kg、3g/kg的仁術(shù)健胃顆粒溶液灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)給藥5周。在給藥期間，每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動及糞便等一般情況。3.1.2體重變化觀察與分析在給藥前及給藥后的每周同一時間，使用電子天平稱量大鼠體重，記錄體重變化情況。給藥前，各組大鼠體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。隨著給藥時間的延長，正常組大鼠體重持續(xù)穩(wěn)定增長，每周體重增長較為均勻。模型組大鼠體重增長緩慢，在給藥期間體重幾乎無明顯變化，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。胃復(fù)春組大鼠體重在給藥后逐漸增加，但增長幅度相對較小。仁術(shù)健胃顆粒各劑量組大鼠體重在給藥后均有不同程度的增加，其中高劑量組和中劑量組體重增長較為明顯。在給藥第3周時，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組和中劑量組大鼠體重與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。至給藥結(jié)束時，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組大鼠體重與正常組接近，顯著高于模型組（P<0.01）；中劑量組大鼠體重也明顯高于模型組（P<0.05）；低劑量組大鼠體重雖有增加，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明仁術(shù)健胃顆粒能夠促進(jìn)慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠體重的增長，且高、中劑量效果較為顯著，提示仁術(shù)健胃顆粒可能通過改善脾胃功能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而增加大鼠體重。3.1.3胃組織病理形態(tài)觀察在給藥5周結(jié)束后，將大鼠禁食不禁水12h，然后用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉。迅速打開腹腔，取出胃組織，沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗干凈，觀察胃黏膜的大體形態(tài)，包括色澤、厚度、有無糜爛、潰瘍及出血點(diǎn)等。正常組大鼠胃黏膜色澤紅潤，表面光滑，胃壁柔軟，無明顯異常。模型組大鼠胃黏膜色澤蒼白，明顯變薄，表面粗糙，可見散在的糜爛灶和出血點(diǎn)，胃壁較硬。胃復(fù)春組大鼠胃黏膜色澤有所改善，糜爛灶和出血點(diǎn)減少，但仍可見部分粗糙區(qū)域。仁術(shù)健胃顆粒各劑量組大鼠胃黏膜病變均有不同程度的減輕。高劑量組胃黏膜色澤接近正常，糜爛灶和出血點(diǎn)基本消失，表面較為光滑；中劑量組胃黏膜色澤明顯好轉(zhuǎn)，糜爛灶和出血點(diǎn)明顯減少；低劑量組胃黏膜病變也有一定程度的減輕，但仍可見少量糜爛灶和粗糙區(qū)域。隨后，將胃組織固定于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜的病理變化，包括腺體萎縮程度、炎性細(xì)胞浸潤情況、腸上皮化生及不典型增生等。正常組大鼠胃黏膜腺體排列整齊，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，固有層無明顯炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠胃黏膜腺體數(shù)目明顯減少，腺體萎縮，黏膜層變薄，固有層可見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域可見腸上皮化生和不典型增生。胃復(fù)春組大鼠胃黏膜腺體萎縮程度有所減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，腸上皮化生和不典型增生的范圍也有所縮小。仁術(shù)健胃顆粒高劑量組大鼠胃黏膜腺體萎縮明顯改善，腺體數(shù)目增多，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少，腸上皮化生和不典型增生基本消失；中劑量組胃黏膜腺體萎縮減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，腸上皮化生和不典型增生范圍縮小；低劑量組胃黏膜病變也有一定程度的改善，但仍可見部分腺體萎縮和炎性細(xì)胞浸潤，腸上皮化生和不典型增生依然存在。通過對胃組織病理形態(tài)的觀察，進(jìn)一步證明仁術(shù)健胃顆粒對慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠的胃黏膜具有保護(hù)和修復(fù)作用，能夠改善胃黏膜的病理變化，且高劑量效果最為顯著。3.2對胃粘膜破壞因子ET、NOS和MTL的影響3.2.1檢測方法與原理在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12h，然后用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉，迅速腹主動脈取血，將血液收集于離心管中。在4℃條件下，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，分離出血清，將血清分裝后保存于-80℃冰箱待測。內(nèi)皮素（ET）是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的生物活性肽，具有強(qiáng)烈的血管收縮作用，在調(diào)節(jié)胃黏膜血流量和胃黏膜細(xì)胞的生長、凋亡等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中ET的水平。ELISA試劑盒購自[生產(chǎn)廠家6]，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。其原理是基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)。將已知的ET抗體包被在酶標(biāo)板上，加入待檢測的血清樣本，血清中的ET會與包被抗體結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的ET抗體，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，加入底物顯色。底物在酶的催化下發(fā)生顏色變化，通過酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中ET的含量。一氧化氮合酶（NOS）是催化L-精氨酸生成一氧化氮（NO）的關(guān)鍵酶，NO在胃黏膜的生理和病理過程中具有雙重作用，適量的NO對胃黏膜有保護(hù)作用，而過量的NO則可能導(dǎo)致胃黏膜損傷。采用比色法檢測血清中NOS的活性。實(shí)驗(yàn)使用的NOS檢測試劑盒購自[生產(chǎn)廠家7]。其檢測原理是利用NOS催化L-精氨酸生成NO的過程中，會產(chǎn)生NADPH的氧化，通過檢測NADPH的氧化量來間接反映NOS的活性。在反應(yīng)體系中加入血清樣本、底物L(fēng)-精氨酸、輔酶NADPH等，NOS催化反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，加入顯色劑，顯色劑與反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NOS的活性。胃動素（MTL）是一種由胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的肽類激素，主要作用是促進(jìn)胃腸蠕動和排空，調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動功能。采用放射免疫分析法（RIA）檢測血清中MTL的含量。RIA試劑盒購自[生產(chǎn)廠家8]。該方法的原理是利用放射性核素標(biāo)記的MTL（標(biāo)記抗原）和未標(biāo)記的MTL（待測抗原）與特異性抗體發(fā)生競爭性結(jié)合反應(yīng)。在反應(yīng)體系中加入已知量的標(biāo)記抗原、待測血清樣本和特異性抗體，標(biāo)記抗原和待測抗原會競爭與抗體結(jié)合。反應(yīng)平衡后，通過分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的抗原，測定結(jié)合態(tài)標(biāo)記抗原的放射性強(qiáng)度。根據(jù)放射性強(qiáng)度與待測抗原濃度之間的反比關(guān)系，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中MTL的含量。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組大鼠血清中ET、NOS和MTL水平處于相對穩(wěn)定的正常范圍。慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型組大鼠血清中ET、NOS和MTL水平與正常組相比，均顯著升高（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)為，模型組ET水平為[X1]pg/mL，正常組為[X2]pg/mL；模型組NOS活性為[X3]U/mL，正常組為[X4]U/mL；模型組MTL含量為[X5]pg/mL，正常組為[X6]pg/mL。這表明慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型大鼠胃黏膜受到損傷，相關(guān)破壞因子水平失衡，ET、NOS和MTL的升高可能參與了胃黏膜損傷的病理過程。ET的升高可能導(dǎo)致胃黏膜血管強(qiáng)烈收縮，減少胃黏膜的血液供應(yīng)，影響胃黏膜細(xì)胞的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而加重胃黏膜的損傷。NOS活性升高，可能使NO生成過多，過量的NO具有細(xì)胞毒性作用，可損傷胃黏膜細(xì)胞。MTL水平升高可能導(dǎo)致胃腸運(yùn)動功能紊亂，進(jìn)一步影響胃的消化和排空功能，加重胃黏膜的負(fù)擔(dān)。經(jīng)過仁術(shù)健胃顆粒治療后，各劑量組大鼠血清中ET、NOS和MTL水平均有不同程度的降低。其中，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組（12g/kg）大鼠血清ET水平顯著降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），降低至[X7]pg/mL。這表明高劑量的仁術(shù)健胃顆粒能夠有效抑制ET的釋放，減輕胃黏膜血管的收縮，改善胃黏膜的血液供應(yīng)，從而對胃黏膜起到保護(hù)作用。仁術(shù)健胃顆粒中劑量組（6g/kg）和低劑量組（3g/kg）大鼠血清NOS活性顯著降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中劑量組NOS活性降低至[X8]U/mL，低劑量組降低至[X9]U/mL。說明仁術(shù)健胃顆粒能夠調(diào)節(jié)NOS的活性，減少NO的過量生成，減輕NO對胃黏膜細(xì)胞的損傷。仁術(shù)健胃顆粒高劑量組和中劑量組大鼠血清MTL含量顯著降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量組MTL含量降低至[X10]pg/mL，中劑量組降低至[X11]pg/mL。提示仁術(shù)健胃顆粒能夠調(diào)節(jié)MTL的分泌，改善胃腸運(yùn)動功能，緩解胃腸運(yùn)動紊亂對胃黏膜的不良影響。胃復(fù)春組大鼠血清中ET、NOS和MTL水平也有所降低，但與仁術(shù)健胃顆粒高劑量組相比，降低幅度相對較小。綜上所述，仁術(shù)健胃顆粒能夠調(diào)節(jié)慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠血清中胃黏膜破壞因子ET、NOS和MTL的水平，使其趨于正常。這可能是仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制之一，通過降低ET、NOS和MTL的水平，減輕胃黏膜血管收縮、細(xì)胞損傷和胃腸運(yùn)動紊亂，從而保護(hù)胃黏膜，促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)和再生。3.3對胃粘膜保護(hù)因子GAS、SS和SIgA的影響3.3.1檢測指標(biāo)與意義胃泌素（Gastrin，GAS）是一種重要的胃腸激素，主要由胃竇和十二指腸的G細(xì)胞分泌。它具有廣泛的生理作用，能夠強(qiáng)烈刺激胃酸分泌，促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的增殖和修復(fù)，增強(qiáng)胃黏膜的屏障功能。在慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展過程中，GAS水平的變化起著重要作用。當(dāng)胃黏膜發(fā)生萎縮時，G細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致GAS分泌不足，胃酸分泌相應(yīng)減少，影響食物的消化和吸收，同時胃黏膜的修復(fù)和保護(hù)能力也會下降。因此，檢測GAS水平可以反映胃黏膜的功能狀態(tài)和胃酸分泌情況，對于評估慢性萎縮性胃炎的病情和治療效果具有重要意義。生長抑素（Somatostatin，SS）是一種由胃腸道、胰腺等多種組織分泌的肽類激素。它對胃腸道的生理功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，主要通過抑制胃酸、胃蛋白酶、胃泌素等的分泌，減少胃腸蠕動和消化液的分泌，從而降低胃腸道的代謝和功能活動，對胃黏膜起到保護(hù)作用。在慢性萎縮性胃炎時，胃黏膜的炎癥反應(yīng)可能會導(dǎo)致SS分泌失調(diào)，影響胃黏膜的保護(hù)機(jī)制。檢測SS水平有助于了解胃黏膜的炎癥狀態(tài)和保護(hù)機(jī)制的變化，為慢性萎縮性胃炎的治療提供理論依據(jù)。分泌型免疫球蛋白A（SecretoryImmunoglobulinA，SIgA）是黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，由黏膜固有層中的漿細(xì)胞合成和分泌。它廣泛分布于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜表面，是抵御病原體入侵的第一道防線。在胃腸道中，SIgA能夠與病原體結(jié)合，阻止其黏附于黏膜上皮細(xì)胞，中和毒素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，對維持胃腸道黏膜的免疫平衡和正常生理功能起著重要作用。慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜的免疫功能可能會受到影響，導(dǎo)致SIgA分泌減少，使胃黏膜對病原體的抵抗力下降，容易引發(fā)感染和炎癥。因此，檢測SIgA水平可以評估胃黏膜的免疫功能，為慢性萎縮性胃炎的診斷和治療提供參考。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組大鼠血清中GAS、SS和SIgA水平處于正常范圍。慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型組大鼠血清中GAS和SS水平與正常組相比，明顯降低（P<0.05，P<0.01）；SIgA水平也顯著降低（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)為，模型組GAS水平為[X1]pg/mL，正常組為[X2]pg/mL；模型組SS水平為[X3]pg/mL，正常組為[X4]pg/mL；模型組SIgA水平為[X5]mg/L，正常組為[X6]mg/L。這表明慢性萎縮性胃炎脾氣虛證導(dǎo)致胃黏膜保護(hù)因子失衡，GAS和SS分泌減少，削弱了對胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)作用；SIgA水平降低，使胃黏膜的免疫防御功能下降，容易受到病原體的侵襲，進(jìn)一步加重胃黏膜的損傷。經(jīng)過仁術(shù)健胃顆粒治療后，各劑量組大鼠血清中GAS、SS和SIgA水平均有不同程度的升高。其中，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組（12g/kg）和中劑量組（6g/kg）大鼠血清GAS水平顯著升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量組GAS水平升高至[X7]pg/mL，中劑量組升高至[X8]pg/mL。這說明高、中劑量的仁術(shù)健胃顆粒能夠有效促進(jìn)G細(xì)胞分泌GAS，增加胃酸分泌，改善胃的消化功能，同時促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的增殖和修復(fù)，增強(qiáng)胃黏膜的屏障功能。仁術(shù)健胃顆粒高劑量組和中劑量組大鼠血清SS水平也顯著升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量組SS水平升高至[X9]pg/mL，中劑量組升高至[X10]pg/mL。提示仁術(shù)健胃顆粒能夠調(diào)節(jié)SS的分泌，通過抑制胃酸、胃蛋白酶等的過度分泌，減輕胃黏膜的損傷，發(fā)揮對胃黏膜的保護(hù)作用。仁術(shù)健胃顆粒各劑量組大鼠血清SIgA水平均有升高，其中高劑量組和中劑量組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高劑量組SIgA水平升高至[X11]mg/L，中劑量組升高至[X12]mg/L。表明仁術(shù)健胃顆粒能夠增強(qiáng)胃黏膜的免疫功能，促進(jìn)SIgA的分泌，提高胃黏膜對病原體的抵抗力，減少感染和炎癥的發(fā)生。胃復(fù)春組大鼠血清中GAS、SS和SIgA水平也有所升高，但與仁術(shù)健胃顆粒高劑量組相比，升高幅度相對較小。綜上所述，仁術(shù)健胃顆粒能夠調(diào)節(jié)慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠血清中胃黏膜保護(hù)因子GAS、SS和SIgA的水平，使其趨于正常。這可能是仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的重要作用機(jī)制之一，通過升高GAS、SS和SIgA水平，增強(qiáng)胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)能力，調(diào)節(jié)胃酸分泌，改善胃的消化功能，增強(qiáng)胃黏膜的免疫防御功能，從而達(dá)到治療慢性萎縮性胃炎的目的。3.4對胃組織COX-2、MMP-2和EGFR的影響3.4.1蛋白表達(dá)檢測方法在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，大鼠經(jīng)麻醉處死后，迅速取出胃組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。將胃組織切成約1cm×1cm×0.5cm大小的組織塊，放入凍存管中，迅速置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測胃組織中環(huán)氧合酶2（COX-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和表皮生長因子受體（EGFR）的蛋白表達(dá)水平。具體步驟如下：首先，從-80℃冰箱中取出胃組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分研磨，使組織完全裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃條件下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，在100℃沸水中煮5min，使蛋白變性。接著，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白樣品加入到上樣孔中，同時加入蛋白分子量Marker作為參照。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。采用半干轉(zhuǎn)法或濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白分子量大小和膜的類型進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，在室溫下封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗孵育。一抗分別為兔抗大鼠COX-2多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-2多克隆抗體和兔抗大鼠EGFR多克隆抗體，抗體稀釋度根據(jù)說明書進(jìn)行調(diào)整。將PVDF膜放入含有一抗的孵育液中，4℃搖床孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與二抗孵育，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，稀釋度為1:5000。在室溫下孵育1h后，用TBST緩沖液再次洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色。將顯色液均勻滴加到PVDF膜上，在暗室中曝光，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算COX-2、MMP-2和EGFR蛋白的相對表達(dá)量。此外，還可采用免疫組織化學(xué)法對胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析。將胃組織固定于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為4μm。切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用高溫高壓法或檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，使抗原決定簇充分暴露。然后用3%過氧化氫溶液孵育切片10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。接著用正常山羊血清封閉切片30min，減少非特異性染色。之后，將切片與一抗孵育，一抗種類和稀釋度同WesternBlot實(shí)驗(yàn)。4℃孵育過夜后，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5min。再將切片與二抗孵育，二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育30min。PBS洗滌后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）孵育30min。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平較低。慢性萎縮性胃炎脾氣虛證模型組大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平顯著升高，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)為，模型組COX-2蛋白相對表達(dá)量為[X1]，正常組為[X2]；模型組MMP-2蛋白相對表達(dá)量為[X3]，正常組為[X4]；模型組EGFR蛋白相對表達(dá)量為[X5]，正常組為[X6]。這表明在慢性萎縮性胃炎脾氣虛證狀態(tài)下，胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR的表達(dá)上調(diào)，可能參與了胃黏膜損傷、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和分化異常等病理過程。COX-2是花生四烯酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其過度表達(dá)可導(dǎo)致前列腺素合成增加，引起炎癥反應(yīng)和血管擴(kuò)張，加重胃黏膜的損傷。MMP-2是一種蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，其表達(dá)升高可能與胃黏膜的結(jié)構(gòu)破壞和重塑有關(guān)。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其過度表達(dá)可激活下游信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和存活，可能與慢性萎縮性胃炎的癌前病變過程相關(guān)。經(jīng)過仁術(shù)健胃顆粒治療后，各劑量組大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平均有不同程度的降低。其中，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組（12g/kg）大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平顯著降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。COX-2蛋白相對表達(dá)量降低至[X7]，MMP-2蛋白相對表達(dá)量降低至[X8]，EGFR蛋白相對表達(dá)量降低至[X9]。仁術(shù)健胃顆粒中劑量組（6g/kg）和低劑量組（3g/kg）大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平也有所降低，但與模型組相比，部分指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），部分差異不顯著（P>0.05）。胃復(fù)春組大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR蛋白表達(dá)水平也有所下降，但與仁術(shù)健胃顆粒高劑量組相比，降低幅度相對較小。綜上所述，仁術(shù)健胃顆粒能夠抑制慢性萎縮性胃炎脾氣虛證大鼠胃組織中COX-2、MMP-2和EGFR的表達(dá)，且高劑量效果更為顯著。這可能是仁術(shù)健胃顆粒治療慢性萎縮性胃炎的重要作用機(jī)制之一，通過降低COX-2、MMP-2和EGFR的表達(dá)，減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，從而對胃黏膜起到保護(hù)和修復(fù)作用，預(yù)防和延緩慢性萎縮性胃炎向癌前病變的發(fā)展。四、仁術(shù)健胃顆粒對MC的影響4.1對MC的增殖和P16表達(dá)的影響4.1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)人胚胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（MC）在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代。選取15只健康的SPF級新西蘭大白兔，隨機(jī)分為5組，每組3只。分別為生理鹽水組、維A酸組、仁術(shù)健胃顆粒低劑量組、仁術(shù)健胃顆粒中劑量組、仁術(shù)健胃顆粒高劑量組。生理鹽水組灌胃等量的生理鹽水；維A酸組灌胃0.5mg/mL的維A酸溶液；仁術(shù)健胃顆粒低、中、高劑量組分別灌胃0.25g/mL、0.5g/mL、1g/mL的仁術(shù)健胃顆粒溶液，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃3天。在末次灌胃3小時后，經(jīng)耳緣靜脈取血，將血液收集于離心管中，37℃靜置1小時，然后于4℃、3000r/min條件下離心15分鐘，分離出血清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，即得到含藥血清，保存于-80℃冰箱備用。將培養(yǎng)的MC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞分為6組，分別為GES-1細(xì)胞組、MC細(xì)胞組、維A酸組、仁術(shù)健胃顆粒低劑量組、仁術(shù)健胃顆粒中劑量組、仁術(shù)健胃顆粒高劑量組。GES-1細(xì)胞組加入含生理鹽水組含藥血清培養(yǎng)；MC細(xì)胞組加入含生理鹽水組含藥血清培養(yǎng)；維A酸組加入維A酸組含藥血清培養(yǎng)；仁術(shù)健胃顆粒低、中、高劑量組分別加入相應(yīng)組含藥血清培養(yǎng)，每組設(shè)6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，進(jìn)行后續(xù)檢測。4.1.2細(xì)胞增殖檢測結(jié)果采用MTT法檢測各組MC細(xì)胞的增殖情況。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時，向每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），OD值越高，表明細(xì)胞增殖越活躍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GES-1細(xì)胞組的OD值最低，表明其細(xì)胞增殖活性較低。MC細(xì)胞組的OD值明顯高于GES-1細(xì)胞組（P<0.01），說明MNNG誘導(dǎo)的MC細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。維A酸組和仁術(shù)健胃顆粒各劑量組的OD值均明顯低于MC細(xì)胞組（P<0.05），表明維A酸和仁術(shù)健胃顆粒含藥血清均能抑制MC細(xì)胞的增殖。其中，10％含藥血清仁術(shù)健胃顆粒高劑量組MC細(xì)胞增殖OD值明顯低于維A酸組（P<0.05），說明仁術(shù)健胃顆粒高劑量組對MC細(xì)胞增殖的抑制作用優(yōu)于維A酸組。具體數(shù)據(jù)為，GES-1細(xì)胞組OD值為[X1]，MC細(xì)胞組OD值為[X2]，維A酸組OD值為[X3]，仁術(shù)健胃顆粒低劑量組OD值為[X4]，仁術(shù)健胃顆粒中劑量組OD值為[X5]，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組OD值為[X6]。這表明仁術(shù)健胃顆粒能夠有效抑制MC細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的仁術(shù)健胃顆粒抑制作用更為顯著。4.1.3P16表達(dá)檢測與分析采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組MC細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)。將培養(yǎng)的MC細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組加入相應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS沖洗后，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用高溫高壓法或檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，使抗原決定簇充分暴露。用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。接著用正常山羊血清封閉30分鐘，減少非特異性染色。之后，將蓋玻片與兔抗人P16多克隆抗體孵育，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。再將蓋玻片與生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育，室溫孵育30分鐘。PBS洗滌后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）孵育30分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色。隨機(jī)選取5個高倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算P16陽性細(xì)胞百分率。結(jié)果顯示，GES-1細(xì)胞組P16蛋白陽性表達(dá)率較高。MC細(xì)胞組P16蛋白陽性表達(dá)率明顯低于GES-1細(xì)胞組（P<0.01），表明MNNG致GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后，P16表達(dá)下降。維A酸組和仁術(shù)健胃顆粒各劑量組P16蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于MC細(xì)胞組（P<0.05），說明維A酸和仁術(shù)健胃顆粒含藥血清均能升高M(jìn)C細(xì)胞中P16的表達(dá)。具體數(shù)據(jù)為，GES-1細(xì)胞組P16陽性細(xì)胞百分率為[X7]%，MC細(xì)胞組為[X8]%，維A酸組為[X9]%，仁術(shù)健胃顆粒低劑量組為[X10]%，仁術(shù)健胃顆粒中劑量組為[X11]%，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組為[X12]%。這表明仁術(shù)健胃顆粒能夠促進(jìn)MC細(xì)胞中P16的表達(dá)，可能通過上調(diào)P16的表達(dá)來抑制MC細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮對胃癌前病變的干預(yù)作用。P16作為一種重要的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。當(dāng)P16表達(dá)下降時，細(xì)胞周期調(diào)控失衡，細(xì)胞增殖加速。仁術(shù)健胃顆粒通過提高P16的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞周期的正常調(diào)控，進(jìn)而抑制MC細(xì)胞的異常增殖。4.2對MC的凋亡與Fas、Survivin的影響4.2.1細(xì)胞凋亡檢測方法采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測各組MC細(xì)胞的凋亡率。具體步驟如下：將處于對數(shù)生長期的MC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。然后按照之前的分組，分別加入相應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5分鐘。向細(xì)胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，在FL1/FL2雙參數(shù)散點(diǎn)圖上分析細(xì)胞凋亡情況。其中，AnnexinV-FITC可以與凋亡早期細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，PI則可以穿透凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，使細(xì)胞核染色。根據(jù)細(xì)胞對AnnexinV-FITC和PI的結(jié)合情況，可以將細(xì)胞分為四個象限：AnnexinV?/PI?為活細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GES-1細(xì)胞組凋亡率較低，為[X1]%。MC細(xì)胞組凋亡率明顯低于GES-1細(xì)胞組（P<0.01），僅為[X2]%，說明MNNG致GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞凋亡受到抑制。維A酸組和仁術(shù)健胃顆粒各劑量組凋亡率均明顯高于MC細(xì)胞組（P<0.05）。其中，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組凋亡率為[X3]%，中劑量組為[X4]%，低劑量組為[X5]%，維A酸組凋亡率為[X6]%。仁術(shù)健胃顆粒高劑量組凋亡率明顯高于維A酸組（P<0.05）。這表明仁術(shù)健胃顆粒能夠促進(jìn)MC細(xì)胞的凋亡，且高劑量的促進(jìn)作用更為顯著。其機(jī)制可能是仁術(shù)健胃顆粒含藥血清中的有效成分能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，激活凋亡相關(guān)蛋白酶，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。隨著仁術(shù)健胃顆粒劑量的增加，對凋亡信號通路的激活作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。4.2.3Fas、Survivin表達(dá)研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組MC細(xì)胞中Fas和Survivin蛋白的表達(dá)。將培養(yǎng)的MC細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組加入相應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS沖洗后，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用高溫高壓法或檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，使抗原決定簇充分暴露。用3%過氧化氫溶液孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。接著用正常山羊血清封閉30分鐘，減少非特異性染色。之后，將蓋玻片與兔抗人Fas多克隆抗體或兔抗人Survivin多克隆抗體孵育，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。再將蓋玻片與生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育，室溫孵育30分鐘。PBS洗滌后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）孵育30分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。在光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物呈棕黃色。隨機(jī)選取5個高倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，計(jì)算Fas和Survivin陽性細(xì)胞百分率。結(jié)果顯示，GES-1細(xì)胞組Fas蛋白陽性表達(dá)率較高，為[X7]%，Survivin蛋白陽性表達(dá)率較低，為[X8]%。MC細(xì)胞組Fas蛋白陽性表達(dá)率明顯低于GES-1細(xì)胞組（P<0.01），僅為[X9]%，Survivin蛋白陽性表達(dá)率明顯高于GES-1細(xì)胞組（P<0.01），達(dá)到[X10]%，表明MNNG致GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后，F(xiàn)as表達(dá)下降，Survivin表達(dá)升高。維A酸組和仁術(shù)健胃顆粒各劑量組Fas蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于MC細(xì)胞組（P<0.05），Survivin蛋白陽性表達(dá)率均明顯低于MC細(xì)胞組（P<0.05）。其中，仁術(shù)健胃顆粒高劑量組Fas蛋白陽性表達(dá)率為[X11]%，Survivin蛋白陽性表達(dá)率為[X12]%；中劑量組Fas蛋白陽性表達(dá)率為[X13]%，Survivin蛋白陽性表達(dá)率為[X14]%；低劑量組Fas