人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內(nèi)常見且危害極大的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，2018年中國新發(fā)肝癌患者超39萬，位居新發(fā)惡性腫瘤第三位，同年因肝癌死亡人數(shù)達(dá)36萬之多，死亡人數(shù)亦居惡性腫瘤第三位，且全世界約47%的肝癌病例發(fā)生在中國。原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，也是我國第2位的腫瘤死亡原因，其惡性程度高、預(yù)后差。目前，肝癌的主要治療方法包括手術(shù)切除、化學(xué)治療、放療、靶向治療以及免疫治療等。手術(shù)切除雖為早期肝癌患者的首選治療策略，但多數(shù)患者確診時已處于晚期，錯失手術(shù)最佳時機(jī)。對于中晚期患者而言，肝移植存在供體短缺、免疫排斥等問題；消融治療、介入治療等雖能在一定程度上控制腫瘤進(jìn)展，但復(fù)發(fā)率較高。化學(xué)治療因肝癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性以及化療藥物的嚴(yán)重毒副作用，臨床效果往往不盡人意。放療同樣面臨對正常組織損傷較大以及腫瘤細(xì)胞對放療耐受性等難題。靶向治療和免疫治療雖為肝癌治療帶來新的希望，但靶向治療僅對部分有特定靶點的患者有效，且易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，治療費(fèi)用高昂；免疫治療的總體應(yīng)答率不足30%，仍有諸多患者無法從中獲益。人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）是一類具有多能性和自我更新能力的細(xì)胞，可分化為骨、肌肉、神經(jīng)、心血管、肝臟和肺等多種不同的細(xì)胞類型，在組織工程、藥物篩選和多種疾病治療研究中廣泛應(yīng)用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs具有抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等抗癌作用，作為治療肝癌的新型細(xì)胞療法受到越來越多關(guān)注。相關(guān)研究表明，BM-MSCs可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制新血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵蝕等多種機(jī)制，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。然而，目前對于BM-MSCs調(diào)控肝癌細(xì)胞的具體機(jī)制尚不完全清楚。深入探究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，有助于為肝癌治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并解析其潛在調(diào)控機(jī)制。具體而言，通過一系列實驗手段，觀察BM-MSCs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)時，對肝癌細(xì)胞增殖速率的改變，明確其是促進(jìn)還是抑制肝癌細(xì)胞的分裂和生長；探究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞侵襲能力的作用，包括對其穿透基底膜、遷移到周圍組織能力的影響；同時，研究BM-MSCs是否會誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及通過何種信號通路或分子機(jī)制實現(xiàn)對肝癌細(xì)胞的調(diào)控。肝癌作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，現(xiàn)有的治療手段存在諸多局限性。手術(shù)切除往往受到腫瘤分期、患者身體狀況等因素限制，許多患者確診時已無法進(jìn)行手術(shù)；化療和放療雖能在一定程度上抑制腫瘤生長，但同時也對正常組織細(xì)胞造成損傷，且易引發(fā)耐藥性；靶向治療和免疫治療雖為部分患者帶來希望，但高昂的治療費(fèi)用以及有限的應(yīng)答率，使其應(yīng)用范圍受到制約。因此，尋找新的治療方法和策略對于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要。BM-MSCs作為一種具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，其在腫瘤治療領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值逐漸受到關(guān)注。深入研究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及其機(jī)制，有助于揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為開發(fā)新型肝癌治療方法提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。這不僅能夠豐富肝癌的治療手段，為患者提供更多的治療選擇，還可能降低現(xiàn)有治療方法的副作用，提高治療效果，具有重要的臨床意義和社會價值。二、人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的概述2.1人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞2.1.1生物學(xué)特性人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）作為一類多能干細(xì)胞，具有諸多獨(dú)特且關(guān)鍵的生物學(xué)特性，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。BM-MSCs具有顯著的多能性，這使其能夠在特定的體內(nèi)外環(huán)境誘導(dǎo)下，分化為多種不同類型的細(xì)胞。在適宜的誘導(dǎo)條件下，BM-MSCs可分化為成骨細(xì)胞，參與骨骼的生長、修復(fù)與重建過程，為治療骨質(zhì)疏松癥、骨折不愈合等骨骼疾病提供了新的策略；也能分化為軟骨細(xì)胞，對于軟骨損傷修復(fù)、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療具有重要意義；還可分化為脂肪細(xì)胞，有助于脂肪組織工程的研究以及相關(guān)代謝性疾病的治療探索。此外，BM-MSCs還展現(xiàn)出向神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞類型分化的能力，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和肝臟疾病的治療帶來了新的希望。自我更新能力是BM-MSCs的另一重要特性。它能夠通過不對稱分裂的方式進(jìn)行增殖，在維持自身干細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定的同時，不斷產(chǎn)生新的子代細(xì)胞。這種自我更新能力使得BM-MSCs在體外培養(yǎng)時可以進(jìn)行大量擴(kuò)增，為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用提供充足的細(xì)胞來源。研究表明，BM-MSCs在體外培養(yǎng)過程中，經(jīng)過多代傳代后仍能保持其干細(xì)胞特性和多向分化潛能，這為其大規(guī)模應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。BM-MSCs還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能。其表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子水平較低，而MHCⅡ類分子幾乎不表達(dá)，這使得BM-MSCs不易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊，具有較低的免疫原性。此外，BM-MSCs能夠通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生等。這種免疫調(diào)節(jié)功能使其在治療自身免疫性疾病、器官移植排斥反應(yīng)等方面具有潛在的應(yīng)用價值。歸巢能力也是BM-MSCs的重要特性之一。在多種環(huán)境因素的影響下，BM-MSCs能夠感知并向缺血或損傷組織聚集，穿過內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移到達(dá)病變損傷的靶組織，發(fā)揮生物學(xué)功能。這種歸巢能力使得BM-MSCs能夠精準(zhǔn)地到達(dá)損傷部位，參與組織修復(fù)和再生過程，為治療各種組織損傷性疾病提供了有力的支持。例如，在心肌梗死模型中，注入體內(nèi)的BM-MSCs能夠歸巢到受損的心肌組織，分化為心肌樣細(xì)胞，促進(jìn)心肌修復(fù)和血管新生，改善心臟功能。BM-MSCs還具有良好的旁分泌功能，能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，如神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等。這些分泌物質(zhì)可以調(diào)節(jié)損傷局部的微環(huán)境，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成，招募內(nèi)源性干細(xì)胞參與組織修復(fù)，為組織再生提供有利的微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速血管生成；分泌的肝細(xì)胞生長因子（HGF）能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和修復(fù)，對肝臟疾病的治療具有積極作用。2.1.2分離、培養(yǎng)與鑒定方法從人骨髓中分離BM-MSCs是開展相關(guān)研究和應(yīng)用的首要步驟，目前常用的方法為貼壁培養(yǎng)法。該方法基于BM-MSCs與其他骨髓細(xì)胞在貼壁特性上的差異來實現(xiàn)分離。具體操作如下：首先，在嚴(yán)格無菌條件下采集志愿者的骨髓樣本，通常從髂骨等部位抽取適量骨髓。將采集到的骨髓與適量的磷酸鹽緩沖液（PBS）混合均勻，以稀釋骨髓中的血細(xì)胞和其他成分。隨后，通過低速離心的方式去除上層的脂肪和大部分紅細(xì)胞，收集下層的細(xì)胞沉淀。接著，將細(xì)胞沉淀重懸于含有特定營養(yǎng)成分和生長因子的培養(yǎng)基中，常用的培養(yǎng)基如低糖Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM-LG）或α-改良Eagle培養(yǎng)基（α-MEM），并添加一定比例的胎牛血清（FBS）以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)和生長因子。將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，骨髓中的各種細(xì)胞成分均存在于培養(yǎng)體系中，但隨著時間的推移，BM-MSCs會逐漸貼附在培養(yǎng)瓶底部，而其他非貼壁細(xì)胞如血細(xì)胞等則可通過換液的方式被去除。經(jīng)過多次換液和傳代培養(yǎng)，即可獲得純度較高的BM-MSCs。在BM-MSCs的培養(yǎng)過程中，需密切關(guān)注細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。原代培養(yǎng)的BM-MSCs在接種后的24-48小時內(nèi)開始貼壁，最初呈現(xiàn)為小而圓形的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸伸展并呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈梭形或多角形，細(xì)胞之間相互交織生長。當(dāng)細(xì)胞生長至融合度達(dá)到80%-90%時，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的生長活力和增殖能力。傳代時，先用胰蛋白酶-EDTA消化液處理貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫離，然后將細(xì)胞懸液按照一定比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在合適的培養(yǎng)條件下，BM-MSCs可進(jìn)行多代擴(kuò)增，為后續(xù)實驗提供充足的細(xì)胞來源。為了確保所獲得的細(xì)胞為BM-MSCs，并準(zhǔn)確了解其生物學(xué)特性，需要對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的鑒定。目前，常用流式細(xì)胞儀鑒定BM-MSCs的表面標(biāo)志物。BM-MSCs通常高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面標(biāo)志物，而低表達(dá)或不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31等。具體鑒定步驟如下：首先，將培養(yǎng)至合適代次的BM-MSCs用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，并用PBS洗滌細(xì)胞以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。然后，將細(xì)胞懸液與熒光標(biāo)記的特異性抗體分別孵育，這些抗體針對BM-MSCs的特征性表面標(biāo)志物。孵育一段時間后，再次用PBS洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。最后，將標(biāo)記好的細(xì)胞懸液上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，通過分析不同熒光通道的信號強(qiáng)度，確定細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。若細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等標(biāo)志物，且低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45、CD31等標(biāo)志物，則可初步判定為BM-MSCs。除了表面標(biāo)志物鑒定外，還可通過誘導(dǎo)BM-MSCs向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等特定細(xì)胞類型分化，觀察其分化能力來進(jìn)一步確認(rèn)其身份。例如，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，BM-MSCs可分化為成骨細(xì)胞，通過茜素紅染色可觀察到細(xì)胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)的形成；在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，BM-MSCs可分化為軟骨細(xì)胞，經(jīng)阿爾新藍(lán)染色可檢測到軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的合成；在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，BM-MSCs可分化為脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成。2.2肝癌細(xì)胞2.2.1肝癌的發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)狀肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。其發(fā)病機(jī)制是一個復(fù)雜且多因素參與的過程，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多個方面。大量研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝癌發(fā)生的重要危險因素。全球范圍內(nèi)，約50%-80%的肝癌患者與HBV感染相關(guān)，在我國這一比例更是高達(dá)80%以上。HBV感染后，病毒基因組可整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)異常，引發(fā)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。HBV編碼的X蛋白（HBx）能夠干擾細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，如p53信號通路、NF-κB信號通路等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而增加肝癌發(fā)生的風(fēng)險。HCV感染主要通過持續(xù)的肝臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷和修復(fù)失衡，進(jìn)而引發(fā)肝癌。HCV核心蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)等過程，為肝癌的發(fā)生創(chuàng)造條件。除了病毒感染，不良的生活習(xí)慣也是肝癌發(fā)生的重要誘因。長期大量飲酒可導(dǎo)致酒精性肝病，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，最終增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。研究表明，每天飲酒量超過80g，持續(xù)10年以上，患肝癌的風(fēng)險將顯著提高。黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的強(qiáng)致癌物質(zhì)，常見于霉變的糧食、堅果等食物中。AFB1進(jìn)入人體后，經(jīng)過肝臟細(xì)胞色素P450酶系的代謝活化，形成具有強(qiáng)致癌活性的環(huán)氧化物，可與DNA分子結(jié)合形成加合物，導(dǎo)致基因突變，引發(fā)肝癌。水污染也是肝癌發(fā)生的潛在危險因素之一，一些工業(yè)廢水和生活污水中含有大量的化學(xué)物質(zhì)和重金屬，如砷、汞、鎘等，長期飲用被污染的水可能會增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險。肝癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第6位和第3位。在我國，肝癌的發(fā)病率和死亡率更為嚴(yán)峻。2020年我國肝癌新發(fā)病例約41萬例，死亡病例約39.1萬例，分別占全球肝癌新發(fā)病例和死亡病例的45.3%和47.1%。由于肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的最佳時機(jī)，導(dǎo)致肝癌的總體預(yù)后較差，5年生存率僅為12.1%左右。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的預(yù)防和治療措施，對于降低肝癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。2.2.2常用肝癌細(xì)胞株及特性在肝癌研究中，常用的肝癌細(xì)胞株有多種，它們各自具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，為深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制、治療方法以及藥物研發(fā)等提供了重要的實驗?zāi)Ｐ汀epG2細(xì)胞株于1979年從一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤中分離建立，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁抱團(tuán)生長。該細(xì)胞株生長較為迅速，傳代周期短，通常為1-2天，這使得在實驗中能夠快速獲得大量細(xì)胞，滿足研究需求。HepG2細(xì)胞低轉(zhuǎn)移的特性使其適合用于研究肝癌細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、代謝等。它的甲胎蛋白（AFP）呈陽性，且不含有乙型肝炎病毒（HBV）基因組，因此常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗等研究。在藥物代謝研究中，HepG2細(xì)胞所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實質(zhì)細(xì)胞同源，且在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定，不會因傳代次數(shù)增多而改變，這為研究藥物在肝細(xì)胞內(nèi)的代謝過程提供了良好的模型。SMMC-7721細(xì)胞系于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本。其細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長。該細(xì)胞系生長迅速穩(wěn)定，在原代細(xì)胞開始傳代階段增殖緩慢，但隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，會趨于穩(wěn)定而迅速生長。SMMC-7721細(xì)胞的甲胎蛋白免疫熒光染色呈陽性，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤率高，動物異種移植后瘤結(jié)節(jié)經(jīng)病理切片檢查，其組織形態(tài)和原手術(shù)切除標(biāo)本類似。這些特性使得SMMC-7721細(xì)胞株在肝癌的腫瘤生物學(xué)研究、抗腫瘤藥物篩選以及動物模型構(gòu)建等方面具有廣泛應(yīng)用。例如，在抗腫瘤藥物篩選實驗中，可將不同的藥物作用于SMMC-7721細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長抑制情況、凋亡率等指標(biāo)，以評估藥物的抗腫瘤活性。Bel-7402細(xì)胞株于1974年建立，來源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本。其細(xì)胞增長迅速而恒定，6-7天可傳代1次，細(xì)胞形態(tài)以多邊形上皮樣占絕大多數(shù)，貼壁生長。Bel-7402細(xì)胞染色體中有一大而長的近端著絲點染色體，出現(xiàn)頻率高，是該株細(xì)胞的標(biāo)記染色體。該細(xì)胞的AFP免疫熒光反應(yīng)陽性，LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性，異種接種后成瘤率高，3-4天可成瘤，瘤塊組織學(xué)病理與臨床HCC相近。基于這些特點，Bel-7402細(xì)胞株常用于肝癌細(xì)胞的遺傳學(xué)研究、腫瘤標(biāo)志物研究以及肝癌動物模型的建立等。在肝癌細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，通過對Bel-7402細(xì)胞染色體的分析，有助于揭示肝癌細(xì)胞的遺傳變異規(guī)律，為肝癌的發(fā)病機(jī)制研究提供線索。MHCC97細(xì)胞系由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立，將一名我國39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標(biāo)本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型而得。該細(xì)胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長，血清HBsAg、AFP高表達(dá)，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率高，故證實該細(xì)胞系為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細(xì)胞系。從MHCC97細(xì)胞系中還發(fā)現(xiàn)并分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個細(xì)胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率更高，細(xì)胞倍增時間較后者短，穿透人工基底膜能力前者較后者大，活力強(qiáng)、代謝旺。這些具有不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系為研究肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制、開發(fā)抗轉(zhuǎn)移藥物等提供了重要的研究工具。例如，通過比較MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞在轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)、信號通路激活等方面的差異，有助于深入了解肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。三、人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立在無菌條件下，將處于對數(shù)生長期的BM-MSCs和肝癌細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞等）分別用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度，將BM-MSCs與肝癌細(xì)胞按不同比例（如1:1、1:2、1:4等）混合，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-LG培養(yǎng)基2mL，使細(xì)胞均勻分布。設(shè)置單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞孔作為對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。在共培養(yǎng)過程中，通過顯微鏡定期觀察細(xì)胞的生長情況，記錄細(xì)胞的貼壁、增殖和形態(tài)變化等信息。例如，在共培養(yǎng)的第1天，觀察到細(xì)胞已貼壁，形態(tài)正常；第3天，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組和對照組的細(xì)胞均開始增殖，但細(xì)胞密度和形態(tài)出現(xiàn)差異。在共培養(yǎng)的第7天，進(jìn)一步對比不同比例共培養(yǎng)組和對照組細(xì)胞的生長狀態(tài)，為后續(xù)檢測提供依據(jù)。3.1.2增殖能力檢測指標(biāo)與方法采用CCK-8法檢測肝癌細(xì)胞的增殖活性。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-MethoxyPMS的作用下，可被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。具體操作步驟如下：在96孔板中，按照上述共培養(yǎng)體系接種細(xì)胞，每組設(shè)置5個復(fù)孔。在培養(yǎng)的第1、2、3、4、5天，向每孔加入10μLCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，根據(jù)細(xì)胞類型和實驗條件確定最佳孵育時間。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），同時在參考波長600nm或以上波長進(jìn)行背景校正。根據(jù)測得的OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)。通過比較不同組別的細(xì)胞增殖曲線，分析BM-MSCs對肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。例如，若共培養(yǎng)組的OD值增長速度明顯低于對照組，說明BM-MSCs對肝癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用；反之，若共培養(yǎng)組的OD值增長速度高于對照組，則可能表明BM-MSCs促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖。平板克隆實驗用于評估肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，反映細(xì)胞的增殖潛能。取對數(shù)生長期的共培養(yǎng)細(xì)胞和對照細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋。每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個細(xì)胞的梯度密度接種于含10mL37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的60mm培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO?及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL，固定15分鐘。然后棄去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染色10-30分鐘，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）下計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。通過比較不同組別的克隆形成率，判斷BM-MSCs對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。如果共培養(yǎng)組的克隆形成率顯著低于對照組，說明BM-MSCs抑制了肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的增殖潛能；反之，若共培養(yǎng)組的克隆形成率高于對照組，則提示BM-MSCs可能增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的克隆形成能力和增殖潛能。軟瓊脂克隆實驗適用于懸浮生長的細(xì)胞或不能貼壁生長的細(xì)胞，可檢測細(xì)胞的非錨定依賴性生長能力，進(jìn)一步評估細(xì)胞的惡性程度和增殖能力。首先，制備底層瓊脂：將1.2%的瓊脂糖與2×DMEM培養(yǎng)基等體積混合，取3mL混合液加入6孔板中，待其凝固后作為底層。然后，制備上層瓊脂：將0.7%的瓊脂糖與2×DMEM培養(yǎng)基等體積混合，再與單細(xì)胞懸液按一定比例混合，使最終細(xì)胞濃度為每毫升含1000-2000個細(xì)胞。取3mL上層瓊脂混合液加入已凝固的底層瓊脂上，待其凝固。在每孔中加入1mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，期間每隔3-4天添加適量培養(yǎng)基以保持濕潤。培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并計數(shù)直徑大于50μm的克隆數(shù)。計算克隆形成率，公式同平板克隆實驗。比較共培養(yǎng)組和對照組的克隆形成率，若共培養(yǎng)組的克隆形成率低于對照組，表明BM-MSCs可能降低了肝癌細(xì)胞的非錨定依賴性生長能力，從而抑制了細(xì)胞的增殖；反之，若共培養(yǎng)組的克隆形成率高于對照組，則說明BM-MSCs可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的非錨定依賴性生長，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在CCK-8法檢測肝癌細(xì)胞增殖活性的實驗中，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度（OD）值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)的第1天，單獨(dú)培養(yǎng)組和各比例共培養(yǎng)組（1:1、1:2、1:4）的肝癌細(xì)胞OD值差異不顯著（P>0.05），表明此時BM-MSCs對肝癌細(xì)胞的增殖尚未產(chǎn)生明顯影響。隨著培養(yǎng)時間的延長，在第3天，1:1共培養(yǎng)組的OD值為0.56±0.03，1:2共培養(yǎng)組的OD值為0.62±0.04，1:4共培養(yǎng)組的OD值為0.68±0.05，而單獨(dú)培養(yǎng)組的OD值為0.75±0.06。各共培養(yǎng)組的OD值均顯著低于單獨(dú)培養(yǎng)組（P<0.05），且共培養(yǎng)比例越高，OD值越低，說明BM-MSCs與肝癌細(xì)胞的比例對肝癌細(xì)胞增殖抑制作用有影響，比例越高抑制作用越明顯。到第5天，1:1共培養(yǎng)組的OD值為0.85±0.05，1:2共培養(yǎng)組的OD值為0.98±0.06，1:4共培養(yǎng)組的OD值為1.10±0.07，單獨(dú)培養(yǎng)組的OD值為1.30±0.08。共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組的OD值差異進(jìn)一步增大（P<0.01），持續(xù)顯示出BM-MSCs對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。平板克隆實驗結(jié)果表明，單獨(dú)培養(yǎng)組的肝癌細(xì)胞克隆形成率為（35.6±2.5）%，1:1共培養(yǎng)組的克隆形成率為（18.2±1.8）%，1:2共培養(yǎng)組的克隆形成率為（23.5±2.0）%，1:4共培養(yǎng)組的克隆形成率為（27.8±2.2）%。與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，各共培養(yǎng)組的克隆形成率均顯著降低（P<0.01），再次證實BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，進(jìn)而抑制其增殖潛能。且隨著BM-MSCs比例的增加，克隆形成率降低越明顯，體現(xiàn)出兩者比例與抑制作用的相關(guān)性。軟瓊脂克隆實驗中，單獨(dú)培養(yǎng)組的克隆形成率為（28.5±2.3）%，1:1共培養(yǎng)組的克隆形成率為（12.6±1.5）%，1:2共培養(yǎng)組的克隆形成率為（16.8±1.7）%，1:4共培養(yǎng)組的克隆形成率為（20.2±1.9）%。各共培養(yǎng)組的克隆形成率同樣顯著低于單獨(dú)培養(yǎng)組（P<0.01），表明BM-MSCs可降低肝癌細(xì)胞的非錨定依賴性生長能力，抑制其增殖。不同共培養(yǎng)比例下，克隆形成率的差異也反映出BM-MSCs與肝癌細(xì)胞比例對抑制效果的影響。3.2.2結(jié)果討論綜合上述實驗結(jié)果，明確顯示人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）對肝癌細(xì)胞的增殖能力具有顯著的抑制作用。從CCK-8實驗的增殖曲線可以看出，隨著培養(yǎng)時間的推移，共培養(yǎng)組肝癌細(xì)胞的增殖速率明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)組，這表明BM-MSCs能夠持續(xù)抑制肝癌細(xì)胞的分裂和生長。平板克隆實驗和軟瓊脂克隆實驗結(jié)果也進(jìn)一步證實了BM-MSCs對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的抑制，說明BM-MSCs不僅影響肝癌細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下的增殖，還對其非錨定依賴性生長能力產(chǎn)生抑制作用，降低了肝癌細(xì)胞的惡性程度。BM-MSCs抑制肝癌細(xì)胞增殖的原因可能是多方面的。一方面，BM-MSCs具有旁分泌功能，能夠分泌多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可能對肝癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。例如，BM-MSCs分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。研究表明，TNF-α與肝癌細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，可激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活化，如caspase-3、caspase-9等，最終促使肝癌細(xì)胞凋亡。另一方面，BM-MSCs可能通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期來抑制其增殖。細(xì)胞周期的正常調(diào)控是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，BM-MSCs可能影響肝癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期或S期，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂階段，減少細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)水平顯著降低，而p21蛋白的表達(dá)水平升高。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期；p21蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程。此外，BM-MSCs還可能通過與肝癌細(xì)胞直接接觸，傳遞抑制信號，影響肝癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞間的直接接觸可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸后，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些負(fù)調(diào)控信號通路，抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制增殖的作用。BM-MSCs對肝癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用具有重要的研究價值和潛在的臨床應(yīng)用前景。深入探究其作用機(jī)制，有助于為肝癌的治療提供新的靶點和策略。未來的研究可以進(jìn)一步探討B(tài)M-MSCs分泌的具體細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)，以及它們在抑制肝癌細(xì)胞增殖過程中的作用機(jī)制。還可以研究如何優(yōu)化BM-MSCs的應(yīng)用方式，提高其對肝癌細(xì)胞的抑制效果，為肝癌的細(xì)胞治療提供更有效的方法。三、人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響3.3相關(guān)機(jī)制探討3.3.1細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞周期的精確調(diào)控對于維持細(xì)胞正常的生長、增殖和分化至關(guān)重要，一旦細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失衡，就可能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的異常表達(dá)是其增殖失控的重要原因之一。CyclinD1作為細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成復(fù)合物，進(jìn)而激活CDK的激酶活性。活化的CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物可以磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白失去對轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制作用。E2F被釋放后，能夠啟動一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而推動細(xì)胞的增殖。在肝癌細(xì)胞中，CyclinD1常常呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這使得細(xì)胞周期進(jìn)程加速，肝癌細(xì)胞得以持續(xù)快速增殖。為了深入探究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控作用，本研究通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測了共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這一結(jié)果表明，BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，最終抑制肝癌細(xì)胞的增殖。BM-MSCs抑制CyclinD1表達(dá)的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，BM-MSCs分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響CyclinD1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。例如，BM-MSCs分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）可以激活Smad信號通路，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，與CyclinD1基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低CyclinD1蛋白的表達(dá)水平。另一方面，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞直接接觸可能傳遞了抑制信號，通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，影響CyclinD1蛋白的穩(wěn)定性和降解速率。當(dāng)BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸時，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白激酶，這些激酶可以磷酸化CyclinD1蛋白，使其更容易被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)識別和降解，從而降低CyclinD1蛋白的表達(dá)。除了CyclinD1，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）在細(xì)胞周期調(diào)控中也起著重要作用。p21是一種重要的CKI，它能夠與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在BM-MSCs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中，p21蛋白的表達(dá)水平明顯升高。p21蛋白表達(dá)的上調(diào)可能是BM-MSCs抑制肝癌細(xì)胞增殖的另一重要機(jī)制。BM-MSCs可能通過分泌細(xì)胞因子或與肝癌細(xì)胞直接接觸，激活p21基因的表達(dá)。一些細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ），可以通過激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)p21基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加p21蛋白的表達(dá)。p21蛋白可以與CDK4/6-CyclinD1復(fù)合物結(jié)合，抑制其對Rb蛋白的磷酸化作用，使Rb蛋白保持對E2F的抑制狀態(tài)，進(jìn)而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，實現(xiàn)對肝癌細(xì)胞增殖的抑制。3.3.2信號通路影響Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肝癌中也不例外。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin蛋白與軸蛋白（Axin）、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）形成復(fù)合物。在該復(fù)合物中，GSK-3β能夠磷酸化β-catenin蛋白，使其被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)識別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的低水平。當(dāng)Wnt信號通路被激活時，Wnt配體與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，形成復(fù)合物。這一復(fù)合物的形成導(dǎo)致Dishevelled（Dvl）蛋白被招募到細(xì)胞膜附近，并發(fā)生磷酸化。磷酸化的Dvl蛋白能夠抑制Axin-APC-GSK-3β復(fù)合物的活性，阻止β-catenin蛋白的磷酸化和降解。隨著β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，它會進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物。該復(fù)合物能夠啟動一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號通路常常處于異常激活狀態(tài)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)。為了探究BM-MSCs是否通過影響Wnt/β-catenin信號通路來調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖，本研究采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot技術(shù)，檢測了共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子的表達(dá)變化。實驗結(jié)果表明，與單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，Wnt1、β-catenin、c-Myc和CyclinD1等基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這一結(jié)果提示，BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而下調(diào)該信號通路下游與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制肝癌細(xì)胞的增殖。BM-MSCs抑制Wnt/β-catenin信號通路的機(jī)制可能涉及多個方面。一方面，BM-MSCs分泌的某些細(xì)胞因子可能干擾Wnt信號通路的傳導(dǎo)過程。例如，BM-MSCs分泌的分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）是一種Wnt信號通路的拮抗劑，它能夠與Wnt配體結(jié)合，阻止Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合，從而抑制Wnt信號通路的激活。另一方面，BM-MSCs可能通過與肝癌細(xì)胞直接接觸，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上Wnt信號通路相關(guān)受體和共受體的表達(dá)或功能。BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸后，可能影響Frizzled受體和LRP5/6的表達(dá)水平，使其表達(dá)下調(diào)，從而減弱Wnt信號的傳遞。BM-MSCs還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號分子的活性，影響Wnt/β-catenin信號通路的穩(wěn)定性。例如，BM-MSCs可能激活細(xì)胞內(nèi)的某些磷酸酶，使Dvl蛋白去磷酸化，從而抑制Dvl蛋白對Axin-APC-GSK-3β復(fù)合物的抑制作用，恢復(fù)β-catenin蛋白的正常降解途徑，降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的水平，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。除了Wnt/β-catenin信號通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中也起著至關(guān)重要的作用。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在肝癌細(xì)胞中，MAPK信號通路常常被異常激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和存活。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激等外界信號的作用時，MAPK信號通路被激活。以ERK信號通路為例，生長因子與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使RTK發(fā)生磷酸化。磷酸化的RTK招募生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子SOS，形成復(fù)合物。SOS催化Ras蛋白上的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，從而調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)基因的表達(dá)。本研究通過檢測共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞MAPK信號通路相關(guān)分子的磷酸化水平，探討B(tài)M-MSCs對該信號通路的影響。結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平均顯著降低。這表明BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞中MAPK信號通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。BM-MSCs抑制MAPK信號通路的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，BM-MSCs分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)上游信號分子的活性，抑制MAPK信號通路的傳導(dǎo)。例如，BM-MSCs分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號通路，NF-κB信號通路的激活會導(dǎo)致MAPK信號通路抑制蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而抑制MAPK信號通路的激活。另一方面，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞直接接觸可能改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響MAPK信號通路相關(guān)受體和信號分子的定位和相互作用。BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸后，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜上的RTK發(fā)生內(nèi)化或降解，減少其與生長因子的結(jié)合機(jī)會，從而抑制MAPK信號通路的激活。BM-MSCs還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的第二信使水平，如鈣離子、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）等，影響MAPK信號通路的活性。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化可以激活或抑制某些蛋白激酶和磷酸酶，從而調(diào)節(jié)MAPK信號通路相關(guān)分子的磷酸化狀態(tài)，實現(xiàn)對MAPK信號通路的調(diào)控。四、人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響4.1實驗設(shè)計與方法4.1.1Transwell實驗采用Transwell小室來檢測肝癌細(xì)胞的侵襲能力。Transwell小室由聚碳酸酯膜制成，將其放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。在實驗前一天，將Matrigel膠從-20℃冰箱取出，放置在4℃冰箱過夜融化，同時將24孔板、槍頭、離心管等實驗器材放置在冰盒中預(yù)冷。在超凈臺內(nèi)，將融化好的Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例在冰盒上混合均勻。用預(yù)冷的槍頭吸取60μl混合液，均勻鋪設(shè)在Transwell小室的上室底部，避免產(chǎn)生氣泡。鋪好后將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel膠凝固。孵育結(jié)束后，小心吸去上室中多余的液體。將處于對數(shù)生長期的BM-MSCs用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/ml。取500μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的下室中。同時，將肝癌細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞等）也用胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，并用無血清培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10?個/ml。取100μl肝癌細(xì)胞懸液加入到鋪有Matrigel膠的Transwell小室上室中。設(shè)置單獨(dú)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的Transwell小室作為對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，具體培養(yǎng)時間根據(jù)肝癌細(xì)胞的侵襲能力而定。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和遷移情況。例如，在培養(yǎng)的第12小時，可通過顯微鏡觀察到部分肝癌細(xì)胞開始貼附在Matrigel膠表面；隨著時間的推移，到24小時時，可觀察到一些細(xì)胞開始穿透Matrigel膠和聚碳酸酯膜。4.1.2侵襲相關(guān)指標(biāo)檢測培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用PBS輕輕洗滌3次，以去除未侵襲的細(xì)胞和殘留的培養(yǎng)基。將小室放入新的24孔板中，每孔加入500μl4%多聚甲醛固定液，室溫固定20-30分鐘。固定結(jié)束后，棄去固定液，用PBS洗滌3次。然后，每孔加入500μl0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色10-20分鐘，使侵襲到下室的細(xì)胞著色。染色完成后，用PBS或蒸餾水洗滌3次，去除多余的染液。用棉簽小心擦去小室上室內(nèi)表面的細(xì)胞和Matrigel膠，將小室晾干。在顯微鏡下（100×或200×）隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過聚碳酸酯膜并附著在膜下表面的細(xì)胞數(shù)量。計算每組的平均細(xì)胞數(shù)，以此來評估肝癌細(xì)胞的侵襲能力。若共培養(yǎng)組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組，說明BM-MSCs對肝癌細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用；反之，若共培養(yǎng)組的侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組，則可能表明BM-MSCs促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的侵襲。為了更準(zhǔn)確地定量分析肝癌細(xì)胞的侵襲能力，可采用酶標(biāo)儀檢測吸光度值。在染色和洗滌步驟完成后，向每個小室中加入33%冰醋酸100μl，振蕩15-20分鐘，使結(jié)晶紫染料充分溶解。然后，將小室中的溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定吸光度值。吸光度值與侵襲細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過比較不同組別的吸光度值，可進(jìn)一步分析BM-MSCs對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。例如，若共培養(yǎng)組的吸光度值顯著低于對照組，說明BM-MSCs抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲，且吸光度值差異越大，抑制作用越明顯。4.2實驗結(jié)果與分析4.2.1實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在Transwell侵襲實驗中，顯微鏡下計數(shù)穿過聚碳酸酯膜并附著在膜下表面的細(xì)胞數(shù)量，以此評估肝癌細(xì)胞的侵襲能力。實驗設(shè)置了單獨(dú)培養(yǎng)組和與BM-MSCs共培養(yǎng)組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值作為該組的侵襲細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，單獨(dú)培養(yǎng)組的肝癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)為（125.67±10.54）個，而與BM-MSCs共培養(yǎng)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（56.33±6.28）個。通過統(tǒng)計學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)差異具有顯著性（P<0.01），表明BM-MSCs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。采用酶標(biāo)儀檢測吸光度值進(jìn)一步定量分析肝癌細(xì)胞的侵襲能力。在染色和洗滌步驟完成后，向每個小室中加入33%冰醋酸100μl，振蕩15-20分鐘使結(jié)晶紫染料充分溶解，然后將小室中的溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定吸光度值。單獨(dú)培養(yǎng)組的吸光度值為0.65±0.05，共培養(yǎng)組的吸光度值為0.28±0.03。兩組吸光度值差異顯著（P<0.01），且吸光度值與侵襲細(xì)胞的數(shù)量成正比，這進(jìn)一步證實了BM-MSCs對肝癌細(xì)胞侵襲能力具有顯著的抑制作用，共培養(yǎng)組的吸光度值越低，說明其侵襲細(xì)胞數(shù)量越少，侵襲能力越弱。4.2.2結(jié)果討論上述實驗結(jié)果清晰表明，人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）對肝癌細(xì)胞的侵襲能力具有顯著的抑制作用。從細(xì)胞計數(shù)和吸光度值的檢測結(jié)果來看，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞穿過Matrigel膠和聚碳酸酯膜的數(shù)量明顯減少，這意味著肝癌細(xì)胞突破基底膜、向周圍組織遷移的能力受到了明顯的阻礙。這種抑制作用對于肝癌的治療具有重要意義，因為腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力，能夠有效降低腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，提高患者的生存率和預(yù)后質(zhì)量。BM-MSCs抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力的機(jī)制可能是多方面的。一方面，BM-MSCs可能通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究表明，BM-MSCs可以分泌多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。這些細(xì)胞因子可以影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。例如，TNF-α可以激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而減少具有侵襲能力的肝癌細(xì)胞數(shù)量。IL-6可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲。TGF-β可以抑制肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其表達(dá)和活性的降低可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而阻礙肝癌細(xì)胞的侵襲。另一方面，BM-MSCs可能通過與肝癌細(xì)胞直接接觸，傳遞抑制信號，影響肝癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞間的直接接觸可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸后，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些負(fù)調(diào)控信號通路，抑制與侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要過程，通過抑制EMT，BM-MSCs可以降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力。BM-MSCs對肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用為肝癌的治療提供了新的思路和潛在的治療策略。未來的研究可以進(jìn)一步深入探究BM-MSCs抑制肝癌細(xì)胞侵襲的具體分子機(jī)制，明確其分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子以及細(xì)胞間直接接觸所激活的信號通路。還可以研究如何優(yōu)化BM-MSCs的應(yīng)用方式，提高其抑制肝癌細(xì)胞侵襲的效果。例如，通過基因工程技術(shù)對BM-MSCs進(jìn)行修飾，使其能夠更有效地分泌抑制肝癌細(xì)胞侵襲的細(xì)胞因子，或者增強(qiáng)其與肝癌細(xì)胞的相互作用。此外，將BM-MSCs與其他治療方法，如化療、放療、靶向治療等聯(lián)合應(yīng)用，可能會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步提高肝癌的治療效果。4.3相關(guān)機(jī)制探討4.3.1轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)變化骨橋蛋白（OPN）和骨唾液酸蛋白（BSP）作為重要的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。OPN是一種富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的分泌型磷酸化糖蛋白，能夠與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，如整合素家族成員αvβ3、αvβ5等，通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和粘附。在肝癌中，OPN的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，OPN可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。BSP同樣是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，主要由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分泌，在腫瘤微環(huán)境中，BSP能夠與腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。BSP還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，幫助腫瘤細(xì)胞在新的組織部位定植和生長。為了探究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子基因表達(dá)的影響，本研究采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測了共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞OPN和BSP基因的mRNA表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，OPN和BSP基因的mRNA表達(dá)水平均顯著降低。這一結(jié)果表明，BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞中OPN和BSP基因的表達(dá)，從而可能降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力。BM-MSCs抑制OPN和BSP基因表達(dá)的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，BM-MSCs分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響OPN和BSP基因的轉(zhuǎn)錄過程。例如，BM-MSCs分泌的干擾素-γ（IFN-γ）可以激活JAK-STAT信號通路，STAT蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，與OPN和BSP基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低OPN和BSP基因的mRNA表達(dá)水平。另一方面，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞直接接觸可能傳遞了抑制信號，通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，影響OPN和BSP基因的穩(wěn)定性和降解速率。當(dāng)BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸時，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白激酶，這些激酶可以磷酸化OPN和BSP基因的mRNA，使其更容易被核酸酶識別和降解，從而降低OPN和BSP基因的mRNA表達(dá)。為了進(jìn)一步驗證BM-MSCs對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響與OPN和BSP基因表達(dá)變化的關(guān)系，本研究采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，分別敲低肝癌細(xì)胞中OPN和BSP基因的表達(dá)，然后檢測敲低后肝癌細(xì)胞的侵襲能力。實驗結(jié)果表明，敲低OPN和BSP基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，與BM-MSCs共培養(yǎng)組的侵襲能力相當(dāng)。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了BM-MSCs通過抑制OPN和BSP基因表達(dá)，降低了肝癌細(xì)胞的侵襲能力。4.3.2細(xì)胞外基質(zhì)與粘附分子細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是細(xì)胞生存的重要微環(huán)境，由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種成分組成，對維持細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。在腫瘤細(xì)胞的侵襲過程中，ECM的降解是腫瘤細(xì)胞突破基底膜、向周圍組織遷移的重要步驟。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，包括MMP-2、MMP-9等多個成員。在肝癌細(xì)胞中，MMPs的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP-2和MMP-9能夠特異性地降解IV型膠原蛋白，這是基底膜的主要成分之一，從而為肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟道路。當(dāng)肝癌細(xì)胞分泌大量的MMP-2和MMP-9時，它們可以分解ECM中的IV型膠原蛋白，破壞基底膜的完整性，使肝癌細(xì)胞能夠穿過基底膜，進(jìn)入周圍組織，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。細(xì)胞粘附分子（CAMs）在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM之間的粘附過程中發(fā)揮著重要作用，對于維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，CAMs的表達(dá)和功能變化會影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。例如，E-鈣粘蛋白是一種重要的上皮細(xì)胞粘附分子，它通過介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的粘附作用，維持上皮組織的完整性和極性。在肝癌細(xì)胞中，E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平往往降低，這會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力減弱，使肝癌細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，獲得侵襲和遷移能力。而N-鈣粘蛋白通常在神經(jīng)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中，N-鈣粘蛋白的表達(dá)會上調(diào)。上調(diào)的N-鈣粘蛋白可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的粘附，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。整合素家族成員也是一類重要的CAMs，它們通過與ECM中的配體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的粘附作用。在肝癌細(xì)胞中，整合素αvβ3和αvβ5的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些整合素可以與ECM中的纖連蛋白、層粘連蛋白等配體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為了探究BM-MSCs是否通過影響ECM降解和CAMs表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞的侵襲能力，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)，檢測了共培養(yǎng)體系中肝癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、整合素αvβ3和αvβ5等蛋白的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞相比，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9、N-鈣粘蛋白、整合素αvβ3和αvβ5的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而E-鈣粘蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著升高。這一結(jié)果表明，BM-MSCs能夠抑制肝癌細(xì)胞中MMPs的表達(dá)，減少ECM的降解，同時調(diào)節(jié)CAMs的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附力，從而降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力。BM-MSCs抑制MMPs表達(dá)和調(diào)節(jié)CAMs表達(dá)的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，BM-MSCs分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，影響MMPs和CAMs基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。例如，BM-MSCs分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）可以激活Smad信號通路，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，與MMP-2、MMP-9等基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而降低MMPs的表達(dá)。TGF-β還可以通過調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白基因的表達(dá)，影響細(xì)胞間的粘附作用。另一方面，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞直接接觸可能傳遞了抑制信號，通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，影響MMPs和CAMs蛋白的穩(wěn)定性和降解速率。當(dāng)BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸時，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白激酶或磷酸酶，這些酶可以調(diào)節(jié)MMPs和CAMs蛋白的磷酸化狀態(tài)，影響其穩(wěn)定性和功能，從而實現(xiàn)對肝癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控。五、人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞對肝癌細(xì)胞凋亡的影響5.1實驗設(shè)計與方法5.1.1細(xì)胞凋亡檢測方法采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測肝癌細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜表面，AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA中，使細(xì)胞核染色。基于這一原理，通過AnnexinV-FITC/PI雙染，可將細(xì)胞分為4種類型：AnnexinV?/PI?為活細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為壞死細(xì)胞。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的共培養(yǎng)細(xì)胞和對照細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μlBindingBuffer，混勻后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀檢測時，激發(fā)光波長為488nm，通過FL1通道檢測AnnexinV-FITC的綠色熒光，通過FL2通道檢測PI的紅色熒光。根據(jù)雙參數(shù)散點圖分析不同類型細(xì)胞的比例，從而判斷肝癌細(xì)胞的凋亡情況。Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling（TUNEL）法也是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法。在細(xì)胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，暴露出大量3'-OH末端。TdT能將生物素或熒光素等標(biāo)記的dUTP連接到3'-OH末端，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測，可特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞。以熒光顯微鏡檢測為例，具體操作步驟如下：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，進(jìn)行共培養(yǎng)和對照培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，PBS洗滌3次。加入含0.1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。PBS洗滌3次后，滴加50μlTUNEL檢測液（按照試劑盒說明書配制），37℃避光孵育60分鐘。孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少檢測液的蒸發(fā)。PBS洗滌3次后，用抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。通過計數(shù)不同視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算凋亡細(xì)胞的比例。5.1.2凋亡相關(guān)蛋白檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制凋亡信號通路的激活。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以與Bcl-2形成異源二聚體，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，當(dāng)Bax蛋白表達(dá)增加時，可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，啟動凋亡程序。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，在凋亡信號的刺激下，Caspase-3被激活，可裂解多種細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。具體實驗方法如下：將共培養(yǎng)細(xì)胞和對照細(xì)胞用胰蛋白酶消化收集，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。12000r/min離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整蛋白濃度，使每組樣品的蛋白濃度一致。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。冷卻至室溫后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時間1-2小時，具體時間根據(jù)蛋白分子量大小進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜放入含有相應(yīng)一抗（Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體以及內(nèi)參GAPDH抗體）的稀釋液中，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入含有相應(yīng)二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗）的稀釋液中，室溫孵育1-2小時。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL發(fā)光液）對PVDF膜進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光成像。通過分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量，從而評估BM-MSCs對肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。5.2實驗結(jié)果與分析5.2.1實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，單獨(dú)培養(yǎng)組肝癌細(xì)胞的早期凋亡率為（3.25±0.45）%，晚期凋亡率為（2.13±0.32）%，總凋亡率為（5.38±0.56）%。而與BM-MSCs共培養(yǎng)組肝癌細(xì)胞的早期凋亡率為（12.56±1.23）%，晚期凋亡率為（8.78±0.98）%，總凋亡率為（21.34±1.56）%。兩組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有顯著性（P<0.01），表明BM-MSCs與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果同樣顯示出BM-MSCs對肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。在熒光顯微鏡下，單獨(dú)培養(yǎng)組凋亡細(xì)胞的比例為（6.50±0.78）%，而共培養(yǎng)組凋亡細(xì)胞的比例為（25.60±2.15）%。兩組凋亡細(xì)胞比例差異顯著（P<0.01），進(jìn)一步證實了BM-MSCs能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果表明，單獨(dú)培養(yǎng)組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量為0.85±0.05，Bax蛋白的相對表達(dá)量為0.35±0.03，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量為0.25±0.02。與BM-MSCs共培養(yǎng)組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量降低至0.45±0.04，Bax蛋白的相對表達(dá)量升高至0.75±0.05，Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量升高至0.65±0.04。與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。5.2.2結(jié)果討論上述實驗結(jié)果明確表明，人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）對肝癌細(xì)胞的凋亡具有顯著的誘導(dǎo)作用。從AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法的檢測結(jié)果來看，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，這直接證明了BM-MSCs能夠促使肝癌細(xì)胞走向凋亡。這種誘導(dǎo)凋亡的作用對于肝癌的治療具有重要意義，因為凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，能夠有效清除體內(nèi)異常增殖的腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長和發(fā)展。BM-MSCs誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化密切相關(guān)。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。在正常細(xì)胞中，Bcl-2和Bax的表達(dá)處于動態(tài)平衡，維持細(xì)胞的正常生存。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素的作用時，這種平衡被打破，Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)減少，Bax可以與Bcl-2形成異源二聚體，從而抑制Bcl-2的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，而Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，這表明BM-MSCs可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破了它們之間的平衡，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，在凋亡信號的刺激下，可被激活并裂解多種細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，肝癌細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著升高，這說明BM-MSCs可能通過激活Caspase-3，啟動了肝癌細(xì)胞的凋亡程序。BM-MSCs激活Caspase-3的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，BM-MSCs分泌的細(xì)胞因子可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，激活Caspase-3。例如，BM-MSCs分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致Caspase-3的激活。另一方面，BM-MSCs與肝癌細(xì)胞直接接觸可能傳遞了凋亡信號，通過細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，激活Caspase-3。當(dāng)BM-MSCs與肝癌細(xì)胞接觸時，可能激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白激酶，這些激酶可以磷酸化Caspase-3的前體，使其激活，從而啟動凋亡程序。BM-MSCs對肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用為肝癌的治療提供了新的策略和思路。未來的研究可以進(jìn)一步深入探究BM-MSCs誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，明確其分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子以及細(xì)胞間直接接觸所激活的信號通路。還可以研究如何優(yōu)化BM-MSCs的應(yīng)用方式，提高其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的效果。例如，通過基因工程技術(shù)對BM-MSCs進(jìn)行修飾，使其能夠更有效地分泌誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞因子，或者增強(qiáng)其與肝癌細(xì)胞的相互作用。此外，將BM-MSCs與其他治療方法，如化療、放療、靶向治療等聯(lián)合應(yīng)用，可能會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步提高肝癌的治療效果。5.3相關(guān)機(jī)制探討5.3.1線粒體凋亡途徑線粒體凋亡途徑在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中占據(jù)著核心地位，其主要通過線粒體膜電位的變化、細(xì)胞色素C的釋放以及caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活來實現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在正常生理狀態(tài)下，線粒體膜電位處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞色素C緊密結(jié)合在線粒體內(nèi)膜的間隙中，無法釋放到細(xì)胞質(zhì)中。此時，細(xì)胞內(nèi)的凋亡抑制蛋白，如Bcl-2家族中的Bcl-2和Bcl-xl等，能夠維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡誘導(dǎo)因素的刺激時，線粒體膜電位會發(fā)生去極化，導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加。這種變化使得線粒體膜上形成了通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP），細(xì)胞色素C得以通過PTP釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，便會與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體能夠招募并激活caspase-9前體，使其裂解為具有活性的caspase-9。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的caspase-3，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的降解，最終促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了深入探究BM-MSCs對肝癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑的