NanoporeDirectRNASequencing技術白皮書一、引言｜RNA世界的新紀元RNA，作為連接遺傳信息與功能執行的關鍵分子，早已不再只是DNA到蛋白質的“信使”。近年來，大量研究表明，RNA分子的轉錄起始、剪接變異、poly(A)尾長度以及化學修飾共同構成了高度動態、復雜調控的“轉錄組景觀”。正因如此，RNA測序（RNA-seq）已成為揭示基因調控、疾病機制與生物復雜性的核心技術之一。然而，當前主流的RNA測序技術，如Illumina平臺的二代短讀長測序，依賴于逆轉錄和PCR擴增，不可避免地引入了序列偏倚、定量誤差，甚至會錯失重要的RNA修飾信息。此外，短讀長拼接重構全長轉錄本仍存在算法局限，特別是在多重剪接和融合轉錄本研究中尤為突出。DirectRNA-seq（直接RNA測序，簡稱DRS）由OxfordNanoporeTechnologies（ONT）推出，首次實現了在不經逆轉錄、不依賴擴增的條件下，直接測序天然RNA分子的能力。該技術不僅保留RNA分子的天然序列信息，還可同步獲取其poly(A)尾長度和修飾狀態，為解析真實轉錄組提供了前所未有的視角。我們正處在一個從“看懂轉錄”到“讀懂RNA”的新紀元。而DirectRNA-seq，正是打開這個新時代的關鍵鑰匙。本文旨在深入探討DRS的技術原理、應用場景及其在現代生命科學研究中的獨特價值，以期為科研人員提供全面的參考。二、技術原理｜直讀RNA，不經轉錄在傳統RNA測序中，RNA分子必須先被逆轉錄為cDNA，并經過PCR擴增，才能進入測序流程。這一過程中，許多關鍵的原始信息被丟失或扭曲，例如RNA上的化學修飾、poly(A)尾的真實長度，以及剪接體間的微妙差異。DRS則打破了這一壁壘。■工作原理概覽DRS利用OxfordNanopore的納米孔技術，通過檢測RNA分子通過納米孔時產生的電流變化，實現對天然RNA的實時測序。具體流程如下（見圖1）：Poly(A)+RNA富集：從總RNA中選擇含poly(A)尾的mRNA；接頭連接：將適配接頭連接至RNA3'端，方便電動驅動及酶復合物裝載；馬達酶引導測序：馬達酶（MotorProtein）將RNA分子緩慢推進穿過納米孔；電信號采集與解碼：納米孔讀取每個核苷酸通過時的電流信號，軟件將其解碼為堿基序列；同時獲取RNA修飾與poly(A)長度信息：由于未逆轉錄，修飾保留在原始分子上，poly(A)尾長度亦可直接從信號模式中推算。?全流程不經逆轉錄，不經擴增

?信號源來自原始RNA，最大程度保留生物信息原貌圖1：NanoporeDRS流程三、技術優勢｜重構轉錄組的七大突破DirectRNA-seq（DRS）從分子本體出發，繞開逆轉錄和擴增步驟，以單分子、原位測序的方式提供一系列獨特信息維度。相比cDNA-basedRNA測序技術，DRS在以下七個方面具備顯著優勢：??1.直接檢測RNA修飾納米孔測序可識別RNA分子通過孔道時產生的微弱電流變化，這使得DRS具備從原始信號中識別天然修飾（如m6A、m5C、Ψ等）的能力。與抗體富集或化學標記相比，該方法無需額外實驗步驟、不依賴序列上下文，更適合進行全轉錄組范圍內修飾圖譜繪制。技術亮點：基于深度學習模型可定位單堿基分辨率修飾可同時識別多種修飾類型數據來源更接近生理狀態??2.精準測量poly(A)尾長度DRS獨特的電信號可用于精確識別RNA3′端腺苷鏈的長度，達到單分子、原位、無酶依賴的poly(A)長度測量。這為研究RNA穩定性、轉錄后調控及RNA衰變路徑提供了可靠參數。技術亮點：無需tailing或酶切修飾同步獲取序列與尾長信息適用于動態體系與多異構體比較??3.識別融合轉錄本DRS輸出單條完整的RNA長讀長，天然跨越剪接和重排結構，可清晰解析染色體重排產生的融合轉錄本或轉錄跳躍事件，避免短讀長技術中因拼接算法失誤帶來的假陽性。技術亮點：可定位融合位點與兩側結構精準判斷轉錄單位完整性對參考基因組依賴更低，適合未充分注釋區域?4.全長轉錄本結構解析無需拼接重構，DRS可直接輸出覆蓋完整5′-UTR、CDS至3′-UTR區域的原始讀段，有效捕獲復雜剪接變體、保留異構體結構，適用于研究組織特異性表達與調控多樣性。技術亮點：保留天然剪接事件全貌解析復雜的多重異構體顯著提升isoform層級解析能力?5.無需逆轉錄與PCR擴增DRS跳過RT和PCR步驟，避免了擴增偏倚、酶切誤差和模板選擇偏好，更真實反映RNA表達量與結構。對富含二級結構的RNA分子、GC含量極端或低表達轉錄本特別友好。技術亮點：表達定量更準確無擴增假剪接、TSOartifact兼容非聚腺苷化或非編碼RNA?6.發掘新基因與新轉錄本借助長讀長與無參考拼接能力，DRS可直接識別未注釋區域的活躍轉錄事件，包括noveltranscript、intergenicRNA與重定位表達單位，適用于非模式物種或腫瘤異質性分析。技術亮點：低注釋背景下的denovo能力強適合泛轉錄組注釋與表達圖譜構建跨物種、跨組織一致適用?7.原始電信號數據可擴展挖掘DRS保留每條RNA分子的原始納米孔電流軌跡，為機器學習模型提供了“可訓練”的原子層級信號空間。該特性為未來探索未知修飾、結構、翻譯信號等潛在生物特征提供了豐富素材。技術亮點：支持自定義修飾識別模型開發可用于新功能RNA的信號追蹤與AI/ML算法深度兼容，具備前瞻性拓展空間四、應用場景｜從基礎研究到轉化前沿1.表觀轉錄組學：單分子單堿基分辨率揭示RNA修飾的功能與機制RNA分子除了攜帶遺傳信息外，還通過一系列復雜的化學修飾來擴展其功能和調控潛力，這些修飾統稱為“表觀轉錄組學”。目前已發現的RNA修飾種類超過170種，其中N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ，Pseudouridine）是研究最為廣泛且功能重要的修飾。傳統檢測RNA修飾的方法往往依賴于抗體富集（如meRIP-seq）、化學處理或間接推斷，這些方法通常需要大量起始材料，分辨率有限，且無法在單分子水平上同時識別修飾類型和位置。NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術通過檢測RNA分子通過納米孔時電流信號的微小變化，能夠直接識別多種RNA修飾，并在單分子、全長轉錄本水平上提供修飾位點和豐度信息，極大地革新了表觀轉錄組學研究。（1）N6-甲基腺苷(m6A)修飾的單分子分析m6A是真核生物中最常見且最豐富的mRNA內部修飾，在mRNA的剪接、穩定性和翻譯等多種生物學過程中發揮著關鍵作用。DRS通過分析電流信號的特征，能夠直接識別RNA鏈上的m6A修飾，無需額外的化學處理或抗體富集步驟，從而提供無偏倚的修飾圖譜。例如，2024年發表在《NatureMicrobiology》的研究利用NanoporeDRS對全長HIV-1RNA進行了單分子水平的表觀轉錄組學分析[1]。這項研究的關鍵之處在于：高分辨率m6A景觀繪制：DRS能夠提供HIV-1RNA上m6A修飾的高分辨率圖譜，揭示了病毒RNA上的修飾景觀，突出顯示了三個主要m6A位點。m6A功能冗余性揭示：通過分析帶有不同m6A組合的全長DRS讀段，研究發現，盡管某個特定m6A位點發生突變，其他m6A位點仍能發揮功能冗余性。例如，研究展示了單突變和三突變HIV-1RNA的全長DRS讀段的m6A分析，發現即使在單目標位點去除m6A修飾后，轉錄本表達和剪接沒有顯著變化。這表明m6A修飾可能存在功能冗余性或代償機制。m6A對剪接調控的洞察：更重要的是，該研究揭示了m6A修飾與HIV-1RNA剪接之間的復雜關系。DRS能夠同時捕獲m6A修飾信息和轉錄本剪接模式，使得研究人員能夠在單分子水平上關聯m6A修飾狀態與特定的剪接異構體，從而揭示m6A如何影響病毒的基因表達。（2）5-甲基胞嘧啶(m5C)修飾的直接檢測m5C是mRNA和非編碼RNA上另一種重要的修飾，參與RNA的穩定性、翻譯和結構形成。傳統上，m5C的單堿基分辨率檢測常依賴于亞硫酸氫鹽測序，但該方法可能導致RNA降解并產生偏差。DRS的直接測序特性使其成為識別m5C的有力工具。2024年發表在《CellDeath&Disease》的研究就利用NanoporedirectRNA測序技術來研究乙型肝炎病毒（HBV）轉錄本上的m5C修飾[2]。這項研究的亮點在于：HBVmRNA上m5C位點的鑒定：通過DRS，研究人員成功鑒定出HBVmRNA上具有功能性的m5C位點。這為理解HBV病毒復制和宿主免疫逃逸的分子機制提供了新的視角。m5C對病毒復制和免疫逃逸的促進作用：該研究發現，HBVmRNA上的m5C修飾不僅對于Aly/REF輸出因子識別以促進病毒mRNA輸出和HBx翻譯至關重要，而且對于抑制RIG-I結合以抑制干擾素-β（IFN-β）的產生也必不可少。DRS的單分子分辨率使得研究人員能夠直接觀察到m5C修飾如何影響病毒RNA的命運和與宿主蛋白的相互作用。（3）假尿苷(ψ)修飾的無偏倚分析假尿苷（ψ）是RNA中最普遍的異構化修飾，通常由假尿苷合酶催化，將尿苷異構化為假尿苷。ψ修飾能夠影響RNA的二級結構、穩定性、與蛋白質的相互作用以及翻譯效率。由于ψ修飾不改變堿基的化學組成，其檢測比甲基化修飾更具挑戰性。然而，DRS能夠識別由ψ修飾引起的納米孔電流信號變化。2024年發表在《CancerResearch》的研究就利用NanoporeDRS來研究癌癥發展過程中mRNA假尿苷化的作用[3]。這項研究揭示了：MYC驅動的mRNA假尿苷化：研究發現MYC促癌基因能夠轉錄性地上調假尿苷合酶PUS7的表達。通過DRS，研究人員能夠觀察到MYC驅動的細胞中mRNA假尿苷化水平的提高。假尿苷化對mRNA翻譯的調控：更重要的是，DRS能夠用于分析特定mRNA（如MCTS1mRNA）上的假尿苷化位點，并進一步揭示假尿苷化如何增強MCTS1mRNA的翻譯。MCTS1是一種非經典翻譯起始因子，它驅動應激誘導的ATF4表達。DRS提供的直接修飾信息使得研究人員能夠將RNA修飾與翻譯效率和細胞應激反應聯系起來，揭示癌細胞通過調控RNA修飾來適應增殖壓力并促進腫瘤發展的分子機制。綜上所述，NanoporeDRS技術在RNA修飾分析方面展現出其革命性潛力。它能夠在單分子水平上直接識別并量化m6A、m5C、ψ等多種重要的RNA修飾，并同步獲取全長轉錄本的序列和豐度信息。這種整合性的分析能力極大地促進了對表觀轉錄組學復雜性的理解，是探索基因表達調控、疾病機制以及開發新型治療策略的強大支柱。圖2：NanoporeDRS檢測RNA修飾2.復雜轉錄結構解析：精準識別剪接異構體與融合轉錄本NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術因其能夠直接測序全長RNA分子而無需逆轉錄和PCR擴增，極大地提升了轉錄本結構解析的準確性和完整性。這使得DRS在精準識別剪接異構體和融合轉錄本方面展現出傳統短讀測序技術無法比擬的優勢，為基因表達研究和疾病診斷提供了重要的工具。（1）精準識別剪接異構體基因的復雜性很大程度上來源于可變剪接，同一個基因通過不同的剪接方式可以產生多種剪接異構體，這些異構體可能在功能上存在顯著差異。傳統短讀測序技術由于讀長限制，往往難以準確捕獲全長轉錄本的剪接模式，尤其是在存在復雜剪接事件或轉錄本較長的情況下。DRS技術通過一次性讀取完整或接近完整的RNA分子，能夠清晰地展示不同外顯子之間的連接關系，從而實現對剪接異構體的全面和精準識別。例如，一項2025年發表在《NatureMethods》的研究系統性地評估了Nanopore長讀長RNA測序在人類細胞系中轉錄本水平分析的能力[4]。該研究通過對七種人類細胞系進行多種RNA測序方案的分析，發現NanoporeDRS能夠更穩健地識別主要剪接異構體。這項工作充分展示了DRS在揭示復雜剪接多樣性方面的強大潛力，為理解基因功能的多樣性提供了關鍵數據。通過捕獲完整的轉錄本信息，DRS能夠識別出短讀長技術可能遺漏的低豐度或復雜剪接事件，例如外顯子跳躍、內含子保留、可變剪接位點使用等，從而更全面地描繪細胞內的轉錄組圖譜。此外，2024年發表在《ProcNatlAcadSciUSA》的研究進一步展示了DRS在特定生物學情境下剪接異構體研究的應用[5]。該研究利用Nanopore測序技術（FLEP-seq2）分析了擬南芥幼苗在不同光照條件下的核RNA，發現了大量光響應的轉錄后剪接（PTS）內含子。這種內含子在細胞核內以未剪接的形式存在，并在特定條件下被快速剪接，從而實現對環境信號的快速響應。DRS的全長測序能力使得研究人員能夠直接檢測并量化這些內含子的保留與剪接狀態，揭示了植物通過精細調控剪接過程來適應環境變化的機制。這表明DRS不僅能識別已知的剪接異構體，還能夠發現新型的剪接調控模式，對于理解基因表達的動態調控具有重要意義。（2）發現融合轉錄本融合轉錄本是由兩個或多個原本不相鄰的基因片段異常連接而形成的嵌合RNA分子，它們常常與癌癥等疾病的發生發展密切相關。由于融合轉錄本通常涉及跨染色體或長距離基因組區域的重排，傳統短讀測序技術在檢測這些事件時面臨挑戰，容易產生假陽性或遺漏真實的融合事件。DRS技術能夠一次性測序跨越融合斷點的長RNA分子，從而提供直接且高置信度的證據來識別融合轉錄本。在上述《NatureMethods》2025年的研究中[4]，除了剪接異構體的分析，SG-NEx數據（包含Nanopore長讀長測序數據）還能夠用于識別融合轉錄本，作者在研究中共識別了106個融合基因。DRS的優勢在于其能夠跨越較長的基因組距離，直接捕獲融合基因的完整轉錄本。這種全長信息對于確認融合事件的真實性、確定融合斷點以及評估融合基因的結構特征至關重要。通過對全長RNA的直接讀取，DRS可以有效避免短讀長測序中因片段化而導致的假陽性結果，并能發現低豐度的融合轉錄本，為癌癥診斷、預后判斷和靶向治療提供了更精準的分子標記。NanoporeDRS技術憑借其獨特的全長RNA測序能力，在轉錄結構解析方面展現出巨大的潛力。無論是對復雜剪接異構體的全面識別，還是對疾病相關融合轉錄本的精確檢測，DRS都提供了前所未有的分辨率和準確性，極大地推動了我們對轉錄組復雜性的理解，并為基礎研究和臨床應用開辟了新的途徑。3.轉錄本定量與poly(A)尾分析NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術不僅能提供全長轉錄本的結構信息，其直接讀取RNA分子的特性也使其在轉錄本的精確定量以及關鍵的poly(A)尾長度分析方面展現出獨特優勢。這些能力對于深入理解基因表達調控機制至關重要。（1）精準轉錄本定量傳統短讀測序技術在轉錄本定量時，由于讀長限制，常常需要依賴基因注釋和復雜的計算模型來推斷全長轉錄本的豐度。這在面對可變剪接異構體或新轉錄本時，容易引入偏差。NanoporeDRS技術通過直接測序全長RNA分子，能夠直接獲取每個轉錄本的完整序列信息，從而實現更精準的轉錄本定量。例如，2025年發表在《AdvancedScience》的研究充分展示了DRS在轉錄本定量方面的強大能力[6]。該研究利用DRS技術分析了小鼠在禁食和進食狀態下多個主要器官的組織特異性RNA圖譜。研究發現，NanoporeDRS能夠揭示數萬個新型轉錄本，并識別數百個具有組織特異性表達的基因。這些發現揭示了傳統短讀長RNA測序無法解析的每個器官內額外的調控通路層級。更重要的是，通過對同一條件下多器官轉錄本表達的分析，該研究進行了比較分析，揭示了轉錄本異構體和調控的顯著差異。DRS的全長測序能力使得研究人員可以直接量化這些新型和已知轉錄本的豐度，避免了短讀長技術因片段化和注釋不完整導致的定量誤差。這種對全長轉錄本的直接定量，為深入理解復雜生物學過程中的基因表達動態提供了更為準確和全面的數據。（2）精準poly(A)尾長度分析真核生物信使RNA(mRNA)的3'端通常帶有一段由腺苷酸組成的poly(A)尾。poly(A)尾的長度是一個重要的轉錄后調控因子，它影響mRNA的穩定性、翻譯效率以及亞細胞定位。傳統方法對poly(A)尾長度的分析通常需要復雜的實驗步驟或間接推斷，且分辨率有限。NanoporeDRS的獨特之處在于它能夠直接測序到mRNA的poly(A)尾，從而實現對poly(A)尾長度的精確測量，這為研究基因表達的轉錄后調控提供了革命性的工具。上述《AdvancedScience》2025年的研究進一步強調了NanoporeDRS在poly(A)尾分析方面的優勢[6]。該研究指出，NanoporeDRS能夠揭示轉錄本poly(A)尾長度和m6A修飾的動態變化。在小鼠禁食和進食的生理條件下，研究人員能夠觀察到不同器官中基因表達如何通過poly(A)尾長度的改變被調控。這種直接的、高分辨率的poly(A)尾長度測量，使得研究人員能夠更深入地探討：生理狀態對poly(A)尾長度的影響：例如，在禁食與進食的代謝轉換過程中，特定基因的poly(A)尾長度可能發生變化，進而影響其mRNA的穩定性和翻譯效率，從而調控細胞和組織的生理響應。組織特異性poly(A)尾長度調控：不同組織在相同刺激下，其基因的poly(A)尾長度調控可能存在差異，這有助于解釋組織特異性功能。另一項2022年發表在《CellReports》的研究則更深入地探討了NanoporeDRS在特定基因poly(A)尾長度調控機制研究中的應用[7]。該研究聚焦于TOP(TerminalOligopyrimidine)mRNA，這類mRNA編碼核糖體蛋白和其他翻譯相關因子，其翻譯受mTOR信號通路的高度調控。研究人員利用NanoporedirectRNAsequencing全面分析了TOP和非TOPmRNA的poly(A)尾長度。該研究的重要發現包括：TOPmRNApoly(A)尾長度與核糖體加載呈正相關：研究表明，TOPmRNA的poly(A)尾長度與核糖體加載（即翻譯效率）之間存在顯著的正相關關系。長poly(A)尾通常與更高的翻譯效率相關聯。poly(A)尾長度隨mTOR活性動態波動：NanoporeDRS數據顯示，TOPmRNA的poly(A)尾長度會隨mTOR活性的變化而動態波動。在mTOR被激活時，TOPmRNA的poly(A)尾變長；當mTOR活性受到抑制時，poly(A)尾則縮短。LARP1在維持長poly(A)尾中的作用：研究進一步揭示了RNA結合蛋白LARP1在mTOR慢性失活條件下維持TOPmRNA長poly(A)尾的重要性。通過DRS，研究人員能夠直接觀察到LARP1如何通過影響脫腺苷化過程來保留TOPmRNA的較長poly(A)尾，從而在mTOR重新激活時促進翻譯的快速恢復。這些發現突顯了NanoporeDRS在解析復雜的轉錄后調控網絡中的獨特優勢。通過直接、高分辨率地測量poly(A)尾長度，DRS為研究mRNA的命運、翻譯調控以及細胞對外界刺激的響應機制提供了前所未有的洞察力。NanoporeDRS技術在轉錄本定量和poly(A)尾分析方面的應用，極大地拓展了我們對基因表達調控的理解。其直接測序全長RNA的能力，不僅提升了轉錄本定量的準確性，更使得對poly(A)尾長度的測量成為可能，為深入探索復雜的生物學過程提供了強大的工具。圖3：DRS通過測量電信號來推算Poly(A)尾的長度4.非編碼RNA的解析近年來，非編碼RNA(ncRNA)的研究日益成為基因表達調控領域的熱點。其中，長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA)因其獨特的結構和多樣的功能，在疾病發生發展、細胞分化、發育等諸多生物學過程中發揮著關鍵作用。然而，由于這些非編碼RNA的豐度通常較低，且結構復雜，傳統測序技術在對其進行全面精準的識別和分析時面臨挑戰。NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術憑借其長讀長和直接測序的特性，為lncRNA和circRNA的研究提供了革新性的技術手段。（1）長鏈非編碼RNA(lncRNA)的全面識別與解析lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子，它們不編碼蛋白質，但通過多種機制參與基因表達調控。由于lncRNA的轉錄本通常結構復雜，且缺乏poly(A)尾（約有20%的lncRNA是非poly(A)化的），傳統基于poly(A)富集的短讀長測序方法往往難以對其進行全面捕獲和精確分析。NanoporeDRS能夠直接測序RNA分子，全面覆蓋包括非poly(A)化lncRNA在內的各類非編碼RNA。2024年發表在《GenomeBiology》的研究針對這一挑戰，開發了一種名為NERD-seq(Non-EnrichedRNADirectSequencing)的新型NanoporedirectRNA測序方法[8]。這項研究的重點在于擴展非編碼RNA的研究范圍。通過片段分選、加poly(A)尾等步驟，NERD-seq能夠更廣泛地捕獲細胞中更多類型的RNA，包括那些不含poly(A)尾的lncRNA。研究結果顯示，與標準DRS方法相比，NERD-seq在捕獲非poly(A)化RNA方面表現出顯著優勢。例如，在人類HEK293細胞和C57BL/6小鼠大腦樣本中，NERD-seq提高了非聚腺苷化RNA的檢測率，并增加了這些RNA的測序深度。這使得研究人員能夠更全面地識別和定量各種lncRNA，包括那些傳統方法難以檢測到的新型或低豐度的lncRNA，從而為深入理解lncRNA在生物學過程中的復雜功能奠定基礎。（2）環狀RNA(circRNA)的精準發現與功能研究circRNA是一類特殊的非編碼RNA，其兩端通過共價鍵連接形成環狀結構，使其不易被核酸外切酶降解，從而表現出更高的穩定性和更長的半衰期。circRNA不具有線性的5'帽和3'poly(A)尾，這使得傳統的mRNA測序方法難以對其進行有效捕獲。NanoporeDRS的長讀長特性在circRNA研究中具有獨特優勢，因為它能夠跨越其獨特的“反向剪接”位點，從而實現circRNA的精確鑒定和其全長結構的解析。2023年發表在《ScienceAdvances》上的研究就充分利用了NanoporedirectRNA測序技術來研究circRNA在HIV-1感染中的作用[9]。該研究通過DRS捕獲了HIV-1感染的T細胞中的circRNA。通過這種方法，研究人員成功鑒定了一種新型的環狀RNA，命名為ciTRAN，并發現其能夠調節HIV-1的轉錄。這項研究的重要發現包括：ciTRAN的精確鑒定與結構解析：DRS能夠直接讀取ciTRAN的完整環狀結構，并精確定位其反向剪接位點。這對于確定circRNA的基因起源和剪接模式至關重要。ciTRAN表達與HIV-1Vpr的關聯：研究發現，HIV-1感染能夠以Vpr依賴的方式誘導ciTRAN的表達。DRS提供的全長信息有助于研究人員將ciTRAN的表達與特定病毒蛋白的功能聯系起來。ciTRAN在病毒轉錄中的調控作用：通過DRS，研究人員能夠深入探討ciTRAN如何與SRSF1（一種已知的HIV-1轉錄抑制蛋白）相互作用，從而防止病毒前病毒的轉錄抑制。這種直接的RNA-RNA或RNA-蛋白相互作用的機制研究，得益于DRS對全長轉錄本的捕獲能力，使得能夠更全面地理解circRNA在病毒-宿主相互作用中的復雜角色。圖4：DRS檢測環狀RNA因此，NanoporeDRS技術在lncRNA和circRNA研究中展現出其不可替代的優勢。通過拓展長鏈非編碼RNA的捕獲范圍，并提供對環狀RNA全長結構的精確解析，DRS為深入探索這些重要非編碼分子在基因調控網絡中的功能和作用機制提供了強有力的支持，極大地推動了非編碼RNA領域的研究進展。5.新轉錄單元與基因組注釋盡管高通量測序技術已經極大地推動了基因組學的研究，但當前大部分的基因組注釋仍然不完整，尤其是在轉錄本水平。許多基因可能存在未被識別的新型轉錄本異構體、轉錄起始位點或終止位點，甚至全新的基因。傳統短讀測序由于讀長有限，難以準確識別這些“隱藏”的轉錄單元，往往需要依賴現有注釋進行推斷。NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術憑借其長讀長和直接測序的優勢，能夠提供全長轉錄本信息，從而在發現新轉錄單元和完善基因組注釋方面發揮關鍵作用。（1）新型轉錄本與基因的發現DRS能夠直接捕獲完整的轉錄本序列，包括其5'端和3'端，這使得它在鑒定新型轉錄起始位點（TSS）、轉錄終止位點（TTS）以及新的可變剪接事件方面具有獨特優勢。通過不依賴于現有注釋的比對，DRS能夠識別出完全未被注釋的轉錄本，甚至推斷出新型基因。例如，2024年發表在《GenomeResearch》的研究就展示了DRS在發現新型基因和轉錄本方面的應用[10]。該研究將DRS和PCRcDNA測序（PCS）應用于腎透明細胞癌（ccRCC）的存檔組織樣本，旨在發現與疾病復發和免疫逃逸相關的新型轉錄本和基因。盡管存檔樣本的RNA質量可能受損，導致平均讀長較低（約400-500bp），但DRS仍然展現了其價值：識別大量新型轉錄本和基因：研究人員利用DRS從這些臨床樣本中鑒定出了大量新型基因和轉錄本，這些在公共數據庫（如GENCODE）中均未被注釋。發現與疾病相關的特定轉錄本：通過對復發和非復發ccRCC患者樣本的比較分析，該研究發現與ccRCC復發和免疫逃逸相關的新型轉錄本和基因。這些發現為疾病的早期診斷、預后判斷和靶向治療提供了潛在的生物標志物和作用靶點。這表明DRS能夠超越現有的基因組注釋，揭示與疾病狀態密切相關的新型分子。前面提到的2025年發表在《AdvancedScience》的研究也強調了DRS在發現新型轉錄本方面的能力[6]。該研究利用DRS分析了小鼠多個器官在禁食和進食條件下的RNA圖譜，結果表明，NanoporeDRS能夠揭示數萬個新型轉錄本。這些新型轉錄本的發現進一步證明了哺乳動物基因組中轉錄組復雜性遠超現有注釋的范圍，而DRS正是揭示這種復雜性的關鍵工具。（2）完善基因組注釋DRS捕獲的全長轉錄本信息可以直接用于修訂和完善基因組注釋。通過將全長讀長比對到基因組上，可以精確地確定轉錄本的邊界（包括TSS和TTS），驗證已注釋的剪接位點，糾正錯誤的基因模型，并添加新的異構體信息。這對于構建更準確、更全面的基因組和轉錄組參考數據庫至關重要。2025年發表在《NucleicAcidsResearch》的研究提供了一個典范案例，展示了DRS如何用于全面提升模式生物的基因組注釋水平。該研究通過整合深度的表觀遺傳學和轉錄組學數據，包括NanoporedirectRNAsequencing數據，對模式纖毛蟲嗜熱四膜蟲（Tetrahymenathermophila）進行了綜合基因組注釋[11]。DRS在轉錄本邊界識別中的應用：研究人員利用NanoporeDRS數據來識別精確的轉錄起始位點（TSS）和轉錄終止位點（TTS）。由于嗜熱四膜蟲的轉錄本通常無內含子且結構相對簡單，DRS的長讀長能夠直接覆蓋整個基因編碼區和UTR（非翻譯區），從而提供比短讀長測序更精確的轉錄本邊界信息。驗證和修正現有注釋：DRS的全長數據被用于驗證和修正現有的基因模型和注釋。通過比對DRS讀長與預測的基因模型，研究人員能夠糾正潛在的注釋錯誤，并識別出此前未知的轉錄本異構體。構建高質量的注釋數據庫：最終，這些DRS數據與其他高通量測序數據（如染色質可及性、組蛋白修飾等）的整合，極大地提高了嗜熱四膜蟲基因組的注釋質量和完整性，構建了一個高質量的轉錄組和基因組注釋數據庫。這對于研究嗜熱四膜蟲的基因調控、染色質生物學以及作為模式生物的廣泛應用具有里程碑意義。這些研究共同證明，NanoporeDRS技術是發現和驗證新型轉錄單元、糾正現有基因模型以及構建更精確、更全面的基因組注釋的強有力方法。隨著測序技術的不斷進步和成本的降低，DRS將在未來基因組學和轉錄組學的研究中扮演越來越重要的角色。6.動態轉錄圖譜監測：結構、表達量與修飾變化的同步洞察生物系統是高度動態的，其轉錄組在生理變化、環境刺激或疾病進展過程中會發生復雜而迅速的響應。為了全面理解這些動態變化，需要一種能夠同時捕捉轉錄本結構、表達量和轉錄后修飾信息的技術。NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術因其能夠在一個測序流程中直接讀取RNA分子，并同時提供全長序列、豐度信息以及潛在的堿基修飾信號，成為觀察和解析動態轉錄圖譜的理想工具，尤其適用于研究對象在受影響前后的連續檢測。（1）整合多維度信息，全面解析動態響應傳統測序方法通常需要多個獨立的實驗流程來獲取轉錄本結構（如短讀長RNA-seq）、表達量（如定量RT-qPCR）和RNA修飾（如m6AmeRIP-seq）數據。這不僅增加了實驗的復雜性和成本，也可能因不同實驗流程間的差異而引入偏差。DRS的“一站式”解決方案克服了這些限制，能夠從單個實驗中提供對轉錄組的全面動態視圖。例如，2024年發表在《NatureCommunications》的研究充分展現了DRS在動態轉錄圖譜觀察方面的強大能力[12]。該研究對SpaceXInspiration4任務的四名宇航員在七個時間點（包括飛行前、返回當天和飛行后恢復期）的血樣進行了縱向的全血長讀長直接RNA測序。這項研究的關鍵優勢在于：實時捕捉生理應激下的轉錄組動態：宇航員經歷的太空飛行是極端的生理應激事件。DRS能夠定量映射化學結構和表達水平的變化，從而揭示太空飛行對人體生理，特別是造血和免疫系統，在分子和細胞層面的影響。研究報告了關鍵基因通路的改變，包括紅細胞調節、應激誘導和免疫變化的動態。同步檢測基因表達與m6A修飾變化：這是首次在宇航員血液中進行基于納米孔的直接RNA測序，也是首次報告太空飛行相關的m6ARNA修飾增加。DRS的獨特能力使其能夠在同一測序數據中同時識別轉錄本的表達量變化和N6-甲基腺苷（m6A）修飾的變化。研究發現太空飛行導致m6A修飾的增加，這可能調控了血液系統細胞的轉錄響應，表明DRS能夠提供整合的轉錄后調控信息。這種同步觀察的能力對于理解復雜的生物學機制至關重要，因為基因表達的調控往往涉及多層面的協同作用。（2）揭示細胞應激響應中的RNA衰變機制細胞在面臨壓力時會迅速調整其基因表達程序，其中RNA的穩定性（衰變）是關鍵的調控環節。DRS可以追蹤mRNA分子從完整狀態到降解產物的全過程，從而揭示在細胞應激條件下mRNA衰變的動態模式和相關機制。2024年發表在《eLife》的研究則進一步利用全長DRS來揭示細胞應激下的mRNA衰變機制[13]。這項研究的重要發現挑戰了傳統觀念：識別應激顆粒依賴的mRNA縮短：研究發現，細胞在應激反應中會觸發一系列通路，導致mRNA的廣泛改變。通過全長DRS，研究人員觀察到在細胞應激狀態下mRNA會發生顯著的縮短。令人驚訝的是，這種mRNA的縮短并不需要poly(A)尾的縮短。揭示mRNA降解的新范式：傳統認為mRNA降解始于poly(A)尾的縮短。然而，DRS的精確全長讀取能力使得該研究能夠發現一種新的mRNA衰變過程，即應激顆粒依賴的RNA衰變。這種衰變模式似乎獨立于經典的poly(A)尾縮短途徑，揭示了細胞如何通過將mRNA轉移到應激顆粒中來促進其降解，從而實現對基因表達的快速調控。這些研究共同證明，NanoporeDRS技術在觀察生物體在動態變化中的轉錄圖譜方面具有無可比擬的優勢。它能夠在一個實驗中同時提供轉錄本結構、表達量和多種RNA修飾信息，極大地提升了我們對復雜生物學響應機制的理解，為探索疾病發生發展、環境適應以及生理應激等過程中的分子事件提供了全面而深入的視角。五、獨特定位｜DRS的核心價值NanoporedirectRNAsequencing(DRS)作為一項新興的測序技術，在轉錄組學研究中展現出獨特的優勢。其直接讀取RNA分子的能力，使其在多個方面超越了傳統的轉錄組測序方法，并在RNA修飾分析領域開辟了新途徑。本節將從與其他轉錄組測序技術的比較以及在RNA修飾檢測方面的獨特性兩個維度，深入闡述DRS的優勢。（1）與其他轉錄組測序技術的比較：全長、無偏倚的轉錄本圖譜傳統的轉錄組測序方法，如短讀長RNA-seq和基于cDNA的長讀長測序（如NanoporecDNA測序和PacBioIso-seq），各有其應用場景和技術局限。短讀長RNA-seq因其高通量而廣泛應用，但難以解析全長轉錄本結構；而基于cDNA的長讀長測序雖然提供了全長信息，但不可避免地引入了逆轉錄和PCR擴增帶來的偏差。DRS則通過其獨特的直接測序特性，規避了這些問題，能夠提供更接近真實情況的全長、無偏倚的轉錄組圖譜。特性/測序技術短讀長RNA-seq(如Illumina)NanoporecDNA測序PacBioIso-seq(HiFi測序)NanoporeDirectRNASequencing(DRS)測序原理RNA→cDNA片段→測序RNA→cDNA→測序RNA→cDNA→測序RNA直接測序，無需逆轉錄或PCR擴增讀長短讀長(50-300bp)長讀長(可達幾十kb)長讀長(數kb-數十kb)無限制長讀長(可達數十kb)全長轉錄本捕獲否，需推斷是是是，直接捕獲剪接異構體識別挑戰大，依賴推斷較好較好精準識別，包括復雜和新型異構體融合轉錄本發現挑戰大，易假陽性較好較好高效且高置信度新型基因/轉錄本發現挑戰大，易遺漏較好較好高效，超越現有注釋定量準確性易受片段化和推斷偏差影響可能有逆轉錄/PCR偏差可能有逆轉錄/PCR偏差更準確，偏差更小RNA修飾檢測無法直接檢測，需間接方法無法檢測（修飾丟失）無法檢測（修飾丟失）可直接檢測多種修飾實驗流程復雜，多步驟較復雜，多步驟較復雜，多步驟更簡化，步驟少下表詳細對比了DRS與其他轉錄組測序技術的一些關鍵差異：（2）在檢測RNA修飾方面的優勢：革新表觀轉錄組學研究傳統的RNA修飾檢測方法，特別是基于免疫共沉淀的技術（如MeRIP-seq），在RNA修飾研究中發揮了重要作用，但也存在諸多局限。NanoporeDRS的出現，為RNA修飾的分析帶來了革命性的變化。下表詳細對比了DRS與常見基于免疫共沉淀的RNA修飾檢測技術在核心性能指標上的差異：特性/檢測技術基于免疫共沉淀的測序(如MeRIP-seq)NanoporeDirectRNASequencing(DRS)檢測原理抗體富集修飾片段→片段測序直接測序RNA，通過電流信號特征識別修飾是否需要抗體是否修飾特異性依賴抗體特異性，可能存在交叉反應或低敏感度基于物理信號特征，理論上可識別多種修飾起始材料量通常需要大量RNA相對較低分辨率區域性（數百堿基），無法精確定位單個堿基接近堿基分辨率單分子信息無法提供是，可在單分子水平判斷修飾狀態定量能力相對定量，易受偏差影響可實現修飾位點的定量同時檢測多種修飾困難，通常每種修飾需獨立實驗潛力巨大，有望在一個流程中同時檢測多種修飾與全長轉錄本關聯困難，因片段化失去全長信息可將修飾與全長轉錄本結構、豐度關聯發現新型修飾困難具有發現新型或未知修飾的潛力偏差來源抗體特異性、片段化、PCR擴增無逆轉錄和PCR偏差，主要依賴信號識別算法DRS在RNA修飾檢測方面的優勢是革命性的：“無抗體”和“無化學處理”：DRS直接利用納米孔對RNA分子進行物理檢測，無需特異性抗體或復雜的化學轉化步驟，極大地簡化了實驗流程，降低了成本，并減少了引入偏差的可能性。單分子分辨率和精確位點識別：DRS能夠真正實現對RNA修飾的單分子分析，從而揭示修飾在單個轉錄本上的異質性及其精確位置。這為理解修飾的亞化學計量學特性和功能多樣性提供了前所未有的深度。整合全長轉錄組信息：DRS能夠同時提供RNA修飾信息和其所在的全長轉錄本的序列、剪接、表達量等信息，使得研究人員能夠直接探索RNA修飾對轉錄本命運（如剪接、穩定性、翻譯）的影響，從而構建更完整的基因表達調控網絡。NanoporeDRS憑借其直接測序、長讀長和單分子修飾檢測的獨特能力，在轉錄組學研究中展現出無與倫比的優勢。它不僅在轉錄組學的基本分析（如轉錄本識別和定量）上具備了超越傳統方法的優勢，更在RNA修飾這一前沿領域提供了獨一無二的直測能力。這種綜合性的優勢使得DRS成為當前和未來轉錄組學和表觀轉錄組學研究中不可或缺的強大工具。六、結語NanoporedirectRNAsequencing(DRS)技術的問世，標志著RNA研究進入了一個“直讀時代”。它突破了傳統測序方法對逆轉錄和PCR擴增的依賴，實現了對天然RNA分子進行直接、全長測序的革命性飛躍。這一核心技術原理的突破，賦予了DRS在轉錄組學研究中無與倫比的獨特優勢和廣泛的應用潛力。DRS的應用場景涵蓋了從基因組注釋的完善到復雜基因調控網絡的解析。無論是對全長轉錄本和可變剪接異構體的精準識別，Poly(A)尾長度的動態測量，非編碼RNA（如lncRNA和circRNA）的全面捕獲與解析，還是新型轉錄單元的發現與基因組注釋的更新，DRS都展現出其卓越的能力，能夠提供傳統短讀長或基于cDNA的長讀長測序難以企及的深度和準確性。更重要的是，DRS能夠在一個測序流程中同步觀察轉錄本的結構、表達量與多種RNA修飾的動態變化，為我們理解生物體在不同生理或病理狀態下的復雜分子響應提供了前所未有的全景視圖。尤其在RNA修飾分析領域，DRS的出現更是具有里程碑意義。它擺脫了對修飾特異性抗體或繁瑣化學處理的依賴，實現了在單分子水平上對N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)和假尿苷(ψ)等重要RNA修飾的直接、高分辨率檢測。這種能力使得研究人員能夠以前所未有的細節探索這些表觀轉錄組修飾的精確位置、豐度以及它們對RNA功能和命運的影響，從而揭示更深層次的基因表達調控機制。綜上所述，NanoporeDRS憑借其直接性、全長讀取、減少偏差以及整合多維度信息的獨特優勢，正成為推動當前和未來轉錄組學和表觀轉錄組學研究不可或缺的強大工具。它不僅提高了我們對轉錄組復雜性的認知，也為疾病診斷、預后判斷、靶向治療以及基礎生命科學研究開辟了全新的道路。隨著測序通量和準確性的不斷提升，以及生物信息學分析工具的日益完善，DRS必將持續引領RNA研究邁向更精準、更全面的新紀元，為生命科學的探索帶來更多突破性的發現。參考文獻：Baek,Y.,etal.(2024).Single-moleculeepitranscriptomicanalysisofHIV-1RNAidentifiesm6A-dependentsplicingregulation.NatureMicrobiology,9,Article31./10.1038/s41564-023-01588-6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