人工miRNA靶向豬流行性腹瀉病毒的效果及細(xì)胞應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義豬流行性腹瀉（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引發(fā)的一種高度傳染性腸道疾病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。自1971年在英國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，PEDV迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。PEDV主要感染豬的腸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，尤其對(duì)仔豬的危害最為嚴(yán)重，未斷奶仔豬的死亡率可高達(dá)100%。這不僅直接導(dǎo)致仔豬的死亡，還會(huì)影響母豬的繁殖性能和生產(chǎn)性能，如降低母豬的分娩率、增加返情率和流產(chǎn)率等，給豬場(chǎng)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，PEDV的傳播還會(huì)打亂豬場(chǎng)正常的生產(chǎn)節(jié)律，增加保育豬的死淘率，降低中大豬的生長(zhǎng)性能，進(jìn)一步加重了養(yǎng)豬業(yè)的負(fù)擔(dān)。目前，防控PEDV的主要手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)疫苗存在諸多局限性。PEDV是一種RNA病毒，其基因組具有高突變率，這使得病毒能夠快速適應(yīng)環(huán)境變化并逃避宿主的免疫監(jiān)視。傳統(tǒng)疫苗難以有效應(yīng)對(duì)不斷出現(xiàn)的變異毒株，導(dǎo)致疫苗的保護(hù)效果不佳。傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)工藝復(fù)雜且成本高，難以滿(mǎn)足大規(guī)模防控的需求。因此，尋找一種新的治療策略來(lái)治療PEDV感染是必要而且緊迫的。人工miRNA作為一種新興的基因沉默技術(shù)，為PEDV的防控提供了新的思路。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是指細(xì)胞利用外源性或者內(nèi)源性的雙鏈小干擾RNA（siRNA或microRNA）激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物對(duì)同源性mRNA進(jìn)行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)，達(dá)到同源基因的減效表達(dá)或不表達(dá)。在抗病毒感染方面，RNAi幾乎對(duì)所有的病毒復(fù)制都有抑制作用。與傳統(tǒng)的siRNA相比，miRNA僅僅需要和靶基因部分的結(jié)合即可以發(fā)揮作用，因而可以在很大程度上避免因?yàn)椴《咀儺悓?dǎo)致的RNAi治療失敗。miRNA與其靶標(biāo)不需要嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)，病毒突變逃避miRNA特異性沉默可能更加難以實(shí)現(xiàn)，這將對(duì)容易發(fā)生變異的病毒的治療更有優(yōu)勢(shì)。因此，人工miRNA有望成為一種有效的抗PEDV策略。本研究旨在探討人工miRNA對(duì)PEDV的抑制效果及其在細(xì)胞上的初步應(yīng)用，為PEDV的防控提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。通過(guò)篩選出能有效抑制PEDV復(fù)制的人工miRNA，并研究其作用機(jī)制，有望開(kāi)發(fā)出新型的抗PEDV生物制劑，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻(xiàn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀豬流行性腹瀉（PED）作為一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大的疾病，一直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。自1971年在英國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，PEDV在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重的打擊。中國(guó)于1973年陸續(xù)有PED的相關(guān)報(bào)道，并于1984年鑒定出PEDV。此后，中國(guó)PEDV流行毒株一直是低致病性G1a亞型經(jīng)典毒株，直到2010年，PEDV變異毒株傳入我國(guó)，大量豬場(chǎng)爆發(fā)豬流行性腹瀉，造成產(chǎn)房仔豬大量死亡，嚴(yán)重影響豬場(chǎng)的生產(chǎn)成績(jī)和日常管理。根據(jù)PEDV的S基因或其N(xiāo)端高變區(qū)S1區(qū)序列的同源性，可將PEDV分為2個(gè)基因型——G1型和G2型，其中G1型又分為Gla和Glb亞型，G2型又分為G2a和G2b亞型。通常把以CV777毒株為代表的經(jīng)典毒株歸為G1a亞型；G1b(S-INEDL)、G2a和G2b亞型都屬于2010年以后新出現(xiàn)的毒株，其中G1b為低致病力變異毒株，G2a和G2b屬于高致病力變異毒株，而G2b為高致病力重組變異毒株。目前，防控PEDV的主要手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)疫苗存在諸多局限性。PEDV是一種RNA病毒，其基因組具有高突變率，這使得病毒能夠快速適應(yīng)環(huán)境變化并逃避宿主的免疫監(jiān)視。傳統(tǒng)疫苗難以有效應(yīng)對(duì)不斷出現(xiàn)的變異毒株，導(dǎo)致疫苗的保護(hù)效果不佳。江蘇省農(nóng)科院李彬研究員團(tuán)隊(duì)的研究表明，PEDVG2a和G2b兩種亞型毒株間的交叉攻毒保護(hù)水平很低，這意味著現(xiàn)有的疫苗可能無(wú)法對(duì)不同亞型的毒株提供全面的保護(hù)。傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)工藝復(fù)雜且成本高，難以滿(mǎn)足大規(guī)模防控的需求。為了尋找更有效的防控手段，科研人員開(kāi)始探索新的治療策略，人工miRNA作為一種新興的基因沉默技術(shù)，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。RNA干擾（RNAi）是指細(xì)胞利用外源性或者內(nèi)源性的雙鏈小干擾RNA（siRNA或microRNA）激發(fā)相關(guān)的酶復(fù)合物對(duì)同源性mRNA進(jìn)行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達(dá)，達(dá)到同源基因的減效表達(dá)或不表達(dá)。在抗病毒感染方面，RNAi幾乎對(duì)所有的病毒復(fù)制都有抑制作用。與傳統(tǒng)的siRNA相比，miRNA僅僅需要和靶基因部分的結(jié)合即可以發(fā)揮作用，因而可以在很大程度上避免因?yàn)椴《咀儺悓?dǎo)致的RNAi治療失敗。miRNA與其靶標(biāo)不需要嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)，病毒突變逃避miRNA特異性沉默可能更加難以實(shí)現(xiàn)，這將對(duì)容易發(fā)生變異的病毒的治療更有優(yōu)勢(shì)。目前，針對(duì)PEDV的人工miRNA研究取得了一定的進(jìn)展。有研究根據(jù)PEDVN基因的保守序列設(shè)計(jì)人工miRNA，用人工miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，在優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率的基礎(chǔ)上，經(jīng)50％組織細(xì)胞感染劑量（TCID50）以及real-timePCR檢測(cè)人工miRNA對(duì)病毒基因及其復(fù)制的抑制效果，從而篩選能有效抑制PEDV的人工miRNA。也有研究從仔豬腸道細(xì)胞和腸道類(lèi)器官水平揭示了豬乳小細(xì)胞外囊泡中重要非編碼RNA（miR-let-7e和miR-27b）對(duì)PEDV的抑制作用及方式。然而，當(dāng)前的研究仍存在一些不足之處。大部分研究還停留在細(xì)胞水平，缺乏在動(dòng)物體內(nèi)的驗(yàn)證，人工miRNA的穩(wěn)定性和安全性也需要進(jìn)一步評(píng)估，人工miRNA的作用機(jī)制尚未完全明確，還需要深入研究。本研究將在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討人工miRNA對(duì)PEDV的抑制效果及其在細(xì)胞上的初步應(yīng)用。通過(guò)篩選出能有效抑制PEDV復(fù)制的人工miRNA，并研究其作用機(jī)制，有望為PEDV的防控提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻(xiàn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在篩選出高效抑制豬流行性腹瀉病毒（PEDV）復(fù)制的人工miRNA，并探究其在細(xì)胞上的應(yīng)用效果，為開(kāi)發(fā)新型抗PEDV生物制劑奠定基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：人工miRNA的設(shè)計(jì)與合成：深入分析PEDV的基因組序列，借助生物信息學(xué)工具，挑選出病毒基因中保守且關(guān)鍵的區(qū)域作為人工miRNA的作用靶點(diǎn)。依據(jù)miRNA的設(shè)計(jì)原則，精心設(shè)計(jì)并合成針對(duì)這些靶點(diǎn)的人工miRNA序列。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，充分考慮miRNA與靶基因的互補(bǔ)配對(duì)情況，以及miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，確保其能夠高效地發(fā)揮基因沉默作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染：選用對(duì)PEDV敏感的細(xì)胞系，如Vero細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法，將合成的人工miRNA導(dǎo)入細(xì)胞中。通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細(xì)胞攝取人工miRNA。轉(zhuǎn)染后，用PEDV感染細(xì)胞，設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，包括正常細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組、感染病毒組以及轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組等，以準(zhǔn)確評(píng)估人工miRNA對(duì)病毒感染的影響。抗病毒效果評(píng)估：運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，全面評(píng)估人工miRNA對(duì)PEDV的抑制效果。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，精確檢測(cè)病毒核酸的復(fù)制水平，通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組中病毒核酸的含量，直觀(guān)地反映人工miRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制程度。利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證人工miRNA的抗病毒作用。借助細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀(guān)察，直觀(guān)地了解病毒感染對(duì)細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的影響，以及人工miRNA對(duì)細(xì)胞病變的抑制作用。作用機(jī)制初步探究：從多個(gè)角度深入探究人工miRNA抗PEDV的作用機(jī)制。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定人工miRNA的靶基因，明確其在病毒生命周期中的作用環(huán)節(jié)。研究人工miRNA對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程的影響，分析其是否通過(guò)降解病毒mRNA或抑制翻譯過(guò)程來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。探討人工miRNA對(duì)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，研究其是否能夠激活宿主細(xì)胞的免疫防御機(jī)制，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)病毒的抵抗力。1.4研究方法與技術(shù)路線(xiàn)本研究將綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)等多種研究方法，系統(tǒng)地探究人工miRNA對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抑制效果及其在細(xì)胞上的初步應(yīng)用，具體研究方法如下：生物信息學(xué)分析：借助NCBI、Ensembl等權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)，全面獲取PEDV的基因組序列數(shù)據(jù)。運(yùn)用Mfold、RNAstructure等專(zhuān)業(yè)軟件，對(duì)PEDV的基因結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，預(yù)測(cè)mRNA的潛在靶位點(diǎn)，為人工miRNA的設(shè)計(jì)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。利用TargetScan、miRanda等靶基因預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)人工miRNA的潛在靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，深入了解靶基因的生物學(xué)功能和參與的信號(hào)通路，為后續(xù)研究人工miRNA的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用對(duì)PEDV敏感的Vero細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將合成的人工miRNA表達(dá)載體導(dǎo)入Vero細(xì)胞中。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞密度等，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，利用熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細(xì)胞攝取人工miRNA。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用PEDV以一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）進(jìn)行感染，設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，包括正常細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組、感染病毒組以及轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組等。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞和上清液，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。分子生物學(xué)技術(shù)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)病毒核酸的復(fù)制水平。提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以病毒特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組中病毒核酸的Ct值，精確計(jì)算病毒核酸的相對(duì)含量，直觀(guān)地反映人工miRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制程度。利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進(jìn)行雜交，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)病毒蛋白的條帶強(qiáng)度，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證人工miRNA的抗病毒作用。運(yùn)用細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀(guān)察，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)的變化，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，直觀(guān)地了解病毒感染對(duì)細(xì)胞的影響，以及人工miRNA對(duì)細(xì)胞病變的抑制作用。本研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示：人工miRNA設(shè)計(jì)與合成：收集PEDV基因組序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挑選保守區(qū)域作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成人工miRNA。細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒感染：培養(yǎng)Vero細(xì)胞，將人工miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染后用PEDV感染細(xì)胞，設(shè)置不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。抗病毒效果評(píng)估：在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸復(fù)制水平，利用免疫印跡檢測(cè)病毒蛋白表達(dá)，觀(guān)察細(xì)胞病變效應(yīng)評(píng)估人工miRNA抗病毒效果。作用機(jī)制初步探究：通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定靶基因，研究人工miRNA對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，探討其對(duì)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。[此處插入技術(shù)路線(xiàn)圖]圖1技術(shù)路線(xiàn)圖二、人工miRNA與PEDV概述2.1miRNA及人工miRNA介紹2.1.1miRNA的基本概念與特征miRNA（microRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。1993年，科學(xué)家在線(xiàn)蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)了miRNA——lin-4，開(kāi)啟了對(duì)這一領(lǐng)域的研究。miRNA基因在基因組中通常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在，大部分位于基因間隔區(qū)，也有部分位于內(nèi)含子區(qū)域。其轉(zhuǎn)錄過(guò)程由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ介導(dǎo)，首先轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)度約為幾千個(gè)堿基的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）。pri-miRNA具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在Drosha-DGCR8蛋白復(fù)合物的作用下，被剪切成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度約70-90個(gè)堿基的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在Ran-GTP-Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)助下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer-TRBP識(shí)別并進(jìn)一步加工，剪切形成約21-23個(gè)核苷酸的miRNA雙鏈。其中一條鏈會(huì)迅速降解，另一條鏈則被裝載進(jìn)AGO2蛋白中，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），最終生成具有功能的成熟單鏈miRNA。miRNA具有以下顯著特征：其一，長(zhǎng)度較短，約為21-23個(gè)核苷酸，這是其最基本的特征之一；其二，具有高度的保守性，在不同物種間，許多miRNA的序列和功能都相對(duì)保守，反映了其在生物進(jìn)化過(guò)程中的重要性；其三，表達(dá)具有組織特異性和時(shí)空特異性，不同組織和細(xì)胞在不同的發(fā)育階段和生理狀態(tài)下，miRNA的表達(dá)譜存在顯著差異，這表明miRNA在細(xì)胞分化、發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用；其四，一個(gè)miRNA可以通過(guò)與多個(gè)靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，反之，多個(gè)miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一靶基因，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程。miRNA主要通過(guò)參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)發(fā)揮作用。其作用方式主要有兩種：一是當(dāng)miRNA與靶mRNA的序列完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的AGO2蛋白會(huì)發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而阻斷基因的表達(dá)；二是當(dāng)miRNA與靶mRNA的序列不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，主要通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，使mRNA無(wú)法順利翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。研究表明，miRNA參與了真核生物中眾多重要的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，某些miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，它們可以作為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。2.1.2人工miRNA的設(shè)計(jì)原理與合成方法人工miRNA（artificialmicroRNA，amiRNA）是基于天然miRNA的生成和作用原理設(shè)計(jì)的，旨在對(duì)一個(gè)或多個(gè)特定基因進(jìn)行靶向調(diào)控的小分子RNA。其設(shè)計(jì)原理的核心是模擬天然miRNA與靶mRNA的相互作用方式，通過(guò)合理設(shè)計(jì)amiRNA的序列，使其能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的有效抑制。在設(shè)計(jì)人工miRNA時(shí)，首先需要對(duì)靶基因的mRNA序列進(jìn)行深入分析，利用生物信息學(xué)工具，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)mRNA上可能與miRNA結(jié)合的潛在位點(diǎn)。在挑選靶位點(diǎn)時(shí)，要充分考慮多個(gè)因素。靶位點(diǎn)應(yīng)具有較高的特異性，盡量避免與其他非靶基因的mRNA序列產(chǎn)生交叉互補(bǔ)，以確保amiRNA能夠精準(zhǔn)地作用于目標(biāo)基因。靶位點(diǎn)的位置也至關(guān)重要，一般優(yōu)先選擇位于靶mRNA的3′UTR區(qū)域的位點(diǎn)，因?yàn)檫@一區(qū)域富含多種調(diào)控元件，與miRNA的結(jié)合更容易影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。還需要考慮靶位點(diǎn)周?chē)男蛄刑卣鳎缍?jí)結(jié)構(gòu)等，避免選擇位于高度結(jié)構(gòu)化區(qū)域的位點(diǎn)，以免影響amiRNA與靶mRNA的結(jié)合能力。根據(jù)選定的靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的amiRNA序列。amiRNA的5′端部分通常需要與靶mRNA的互補(bǔ)區(qū)域具有較高的互補(bǔ)性，尤其是種子序列（一般指miRNA5′端的第2-8個(gè)核苷酸），這對(duì)于識(shí)別靶mRNA至關(guān)重要。通常要求種子序列與靶mRNA的互補(bǔ)區(qū)域完全匹配或僅有極少錯(cuò)配，以保證特異性結(jié)合。amiRNA的3′端部分也需要與靶mRNA有適當(dāng)?shù)幕パa(bǔ)配對(duì)，雖然其互補(bǔ)性要求相對(duì)較低，但合適的3′端配對(duì)可以增強(qiáng)amiRNA與靶mRNA結(jié)合的穩(wěn)定性，從而提高對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效果。除了與靶mRNA的互補(bǔ)序列外，amiRNA還需要包含適當(dāng)?shù)膫?cè)翼序列，這些側(cè)翼序列對(duì)于維持amiRNA前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要，類(lèi)似于天然pre-miRNA的結(jié)構(gòu)特征，合適的莖環(huán)結(jié)構(gòu)有助于amiRNA在細(xì)胞內(nèi)的加工和成熟，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前，人工miRNA的合成方法主要有化學(xué)合成和載體構(gòu)建合成兩種。化學(xué)合成法是通過(guò)化學(xué)手段直接合成amiRNA序列，這種方法合成的amiRNA純度高、產(chǎn)量大，能夠滿(mǎn)足一些對(duì)純度要求較高的實(shí)驗(yàn)需求，如體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)染研究。化學(xué)合成的amiRNA通常需要進(jìn)行化學(xué)修飾，以提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率，常見(jiàn)的修飾方式包括2′-O-甲基化、2′-氟代修飾、鎖核酸（LNA）修飾等。這些修飾可以增強(qiáng)amiRNA對(duì)核酸酶的抗性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)外的半衰期，同時(shí)也有助于提高amiRNA進(jìn)入細(xì)胞的效率，使其能夠更好地發(fā)揮作用。化學(xué)合成法也存在一些局限性，如合成成本較高，對(duì)于大規(guī)模的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，成本可能成為限制因素；化學(xué)合成的amiRNA在細(xì)胞內(nèi)的作用持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因調(diào)控。載體構(gòu)建合成法則是將人工miRNA的編碼序列克隆到特定的表達(dá)載體中，如質(zhì)粒載體、病毒載體等，然后將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞中，利用細(xì)胞自身的轉(zhuǎn)錄和加工機(jī)制來(lái)表達(dá)和生成amiRNA。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)amiRNA在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，從而對(duì)靶基因進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定的調(diào)控，更適合用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和基因治療研究。以慢病毒載體為例，它能夠?qū)y帶的amiRNA編碼序列整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨著細(xì)胞的分裂而穩(wěn)定遺傳，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的長(zhǎng)期抑制。通過(guò)選擇合適的啟動(dòng)子，可以調(diào)控amiRNA在特定組織或細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)，提高基因調(diào)控的特異性。載體構(gòu)建合成法也面臨一些挑戰(zhàn)，如載體的構(gòu)建過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，需要一定的分子生物學(xué)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)；載體的安全性問(wèn)題也是需要關(guān)注的重點(diǎn)，病毒載體可能存在潛在的免疫原性和插入突變風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估和優(yōu)化。2.1.3人工miRNA作用機(jī)制人工miRNA的作用機(jī)制與天然miRNA類(lèi)似，主要通過(guò)與靶mRNA特異性結(jié)合，引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)人工miRNA被導(dǎo)入細(xì)胞并形成成熟的單鏈形式后，會(huì)與AGO2蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC中，人工miRNA充當(dāng)引導(dǎo)分子，憑借其與靶mRNA互補(bǔ)的核苷酸序列，精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合靶mRNA分子。如果人工miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高，幾乎完全互補(bǔ)，RISC中的AGO2蛋白會(huì)發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，在特定位置對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割。具體來(lái)說(shuō)，AGO2蛋白會(huì)識(shí)別miRNA與靶mRNA形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在miRNA的引導(dǎo)下，對(duì)靶mRNA上與miRNA第10和11位核苷酸相對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行切割，使靶mRNA斷裂成兩段。斷裂后的靶mRNA片段失去了完整性，無(wú)法繼續(xù)作為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯合成，同時(shí)也更容易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致靶基因的mRNA水平顯著降低，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的有效抑制。這種通過(guò)核酸內(nèi)切酶切割靶mRNA的方式，作用效果較為直接和迅速，能夠在短時(shí)間內(nèi)降低靶基因的表達(dá)量。當(dāng)人工miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)不完全，存在一定程度的錯(cuò)配時(shí)，雖然不能引發(fā)AGO2蛋白對(duì)靶mRNA的切割，但仍然可以通過(guò)抑制翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。在翻譯起始階段，核糖體通常需要識(shí)別并結(jié)合到mRNA的起始密碼子區(qū)域，才能啟動(dòng)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程。人工miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會(huì)改變靶mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，使核糖體無(wú)法順利識(shí)別起始密碼子，從而抑制翻譯起始的發(fā)生。即使核糖體成功結(jié)合到mRNA上，在翻譯延伸過(guò)程中，人工miRNA與靶mRNA的結(jié)合也可能會(huì)干擾核糖體的移動(dòng)，導(dǎo)致翻譯過(guò)程受阻，無(wú)法順利合成完整的蛋白質(zhì)，最終使得靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。這種抑制翻譯的作用機(jī)制相對(duì)較為復(fù)雜，其效果可能需要一定時(shí)間才能顯現(xiàn)，但同樣能夠有效地調(diào)控靶基因的表達(dá)。除了直接對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割或抑制翻譯外，人工miRNA還可能通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控靶基因表達(dá)。mRNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性受到多種因素的影響，包括其自身的序列特征、與RNA結(jié)合蛋白的相互作用等。人工miRNA與靶mRNA結(jié)合后，可能會(huì)招募一些核酸酶或其他相關(guān)蛋白，這些蛋白會(huì)對(duì)靶mRNA進(jìn)行修飾或降解，從而縮短靶mRNA的半衰期，使其更快地被降解，減少了靶mRNA作為模板進(jìn)行翻譯的機(jī)會(huì)，間接降低了靶基因的表達(dá)水平。人工miRNA還可能通過(guò)與其他細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子相互作用，參與復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)一步影響靶基因的表達(dá)調(diào)控。在某些情況下，人工miRNA可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的多層次調(diào)控。2.2PEDV的生物學(xué)特性2.2.1PEDV的病毒分類(lèi)與結(jié)構(gòu)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）隸屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）。其病毒粒子呈多形性，多數(shù)為圓形或橢圓形，直徑約為95-190納米。病毒粒子由核心、包膜和纖突組成，核心包含單股正鏈RNA基因組，其長(zhǎng)度約為28kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的一類(lèi)。基因組5′端具有甲基化帽狀結(jié)構(gòu)，3′端有多聚腺苷酸尾，這種結(jié)構(gòu)特征與真核生物mRNA相似，使得病毒基因組RNA可直接作為信使RNA，參與病毒蛋白的翻譯過(guò)程。在PEDV的基因組中，包含多個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，結(jié)構(gòu)蛋白主要包括刺突蛋白（Spikeprotein，S）、包膜蛋白（Envelopeprotein，E）、膜蛋白（Membraneprotein，M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N）。刺突蛋白（S）是PEDV最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，位于病毒粒子的表面，呈花瓣?duì)睿蒘1和S2兩個(gè)亞基組成。S1亞基包含受體結(jié)合域（RBD），負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性；S2亞基則參與病毒與宿主細(xì)胞膜的融合過(guò)程，促進(jìn)病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。研究表明，S蛋白的變異與PEDV的毒力和免疫逃逸密切相關(guān)，新出現(xiàn)的變異毒株在S蛋白的某些關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致其抗原性發(fā)生改變，使得傳統(tǒng)疫苗的免疫效果受到影響。包膜蛋白（E）是一種小分子跨膜蛋白，在病毒粒子的組裝和釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它參與調(diào)節(jié)病毒的出芽和包膜形成，對(duì)維持病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。膜蛋白（M）是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，貫穿于病毒包膜，其主要功能是參與病毒的裝配和形態(tài)發(fā)生，M蛋白與E蛋白相互作用，共同調(diào)控病毒粒子的出芽過(guò)程，同時(shí)，M蛋白還在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮一定作用，影響病毒的感染效率。核衣殼蛋白（N）主要與病毒基因組RNA結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，保護(hù)病毒核酸免受核酸酶的降解，N蛋白還參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，與病毒的生命周期密切相關(guān)，在病毒感染宿主細(xì)胞后，N蛋白可與宿主細(xì)胞的一些蛋白相互作用，調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)和復(fù)制。除了上述結(jié)構(gòu)蛋白外，PEDV基因組還編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白，如RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RdRp）、解旋酶（Helicase）、木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）和3C樣蛋白酶（3CLpro）等。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及逃避宿主免疫反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RdRp）負(fù)責(zé)以病毒基因組RNA為模板，合成負(fù)鏈RNA中間體，再以負(fù)鏈RNA為模板合成子代病毒基因組RNA和各種病毒mRNA，是病毒復(fù)制過(guò)程中不可或缺的關(guān)鍵酶；解旋酶（Helicase）參與解開(kāi)病毒基因組RNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為RdRp的作用提供單鏈模板，促進(jìn)病毒的復(fù)制過(guò)程；木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）和3C樣蛋白酶（3CLpro）則主要參與病毒多聚蛋白的加工和成熟，將病毒最初翻譯產(chǎn)生的多聚蛋白切割成具有功能的單個(gè)蛋白，保證病毒的正常裝配和感染能力。2.2.2PEDV的致病機(jī)制與流行特點(diǎn)PEDV主要感染豬只，尤其是仔豬，其致病過(guò)程較為復(fù)雜。病毒首先通過(guò)與豬小腸絨毛上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，如氨肽酶N（APN）等，吸附到細(xì)胞表面。隨后，病毒通過(guò)膜融合或內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，釋放出病毒基因組RNA。在細(xì)胞內(nèi)，病毒基因組RNA利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，首先翻譯出病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，合成大量的子代病毒基因組RNA和病毒mRNA。病毒mRNA進(jìn)一步翻譯出各種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，通過(guò)出芽的方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染周?chē)募?xì)胞。隨著感染的擴(kuò)散，大量小腸絨毛上皮細(xì)胞被破壞，絨毛萎縮、變短，導(dǎo)致小腸的消化和吸收功能?chē)?yán)重受損。小腸無(wú)法正常吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分，使得豬只出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐和脫水癥狀。由于仔豬的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對(duì)PEDV的抵抗力較弱，因此感染后死亡率較高，尤其是1周齡以?xún)?nèi)的仔豬，死亡率可高達(dá)100%。PEDV感染還可能引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥因子，導(dǎo)致腸道黏膜的炎癥反應(yīng)加重，進(jìn)一步損傷腸道組織。PEDV的傳播途徑主要包括直接接觸傳播和間接接觸傳播。直接接觸傳播是指健康豬與感染豬直接接觸，如通過(guò)呼吸道飛沫、糞便、尿液等排泄物傳播病毒。間接接觸傳播則是指健康豬通過(guò)接觸被病毒污染的飼料、飲水、器具、運(yùn)輸車(chē)輛、人員衣物等而感染病毒。研究表明，PEDV在環(huán)境中具有一定的存活能力，在低溫、潮濕的環(huán)境中存活時(shí)間更長(zhǎng)，這使得病毒更容易通過(guò)間接接觸傳播。PEDV在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在亞洲，中國(guó)、韓國(guó)、日本等國(guó)家是PEDV的高發(fā)地區(qū)。自2010年以來(lái)，中國(guó)多地暴發(fā)PEDV疫情，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致疫情防控難度加大。2010-2011年，中國(guó)南方地區(qū)多個(gè)豬場(chǎng)暴發(fā)大規(guī)模PED疫情，造成大量仔豬死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重。此后，PEDV在全國(guó)范圍內(nèi)持續(xù)流行，不同地區(qū)的流行毒株存在一定差異。在歐洲，PEDV也時(shí)有發(fā)生，一些國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)受到了不同程度的影響。在北美洲，2013年美國(guó)首次報(bào)道了PEDV的暴發(fā)，隨后疫情迅速蔓延至加拿大等國(guó)家，給當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重打擊。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013-2014年，美國(guó)因PEDV感染導(dǎo)致超過(guò)700萬(wàn)頭仔豬死亡，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元。PEDV的流行具有一定的季節(jié)性，通常在冬春季節(jié)高發(fā)，這可能與低溫、潮濕的環(huán)境有利于病毒的存活和傳播有關(guān)。規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)由于豬只密度大、養(yǎng)殖環(huán)境相對(duì)封閉，一旦發(fā)生PEDV感染，更容易造成疫情的快速傳播和擴(kuò)散。一些豬場(chǎng)的生物安全措施不到位，如人員和車(chē)輛進(jìn)出豬場(chǎng)未進(jìn)行嚴(yán)格的消毒、飼料和飲水受到污染等，也為PEDV的傳播提供了條件。三、人工miRNA抗PEDV效果研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備細(xì)胞系與病毒株：選用對(duì)PEDV敏感的Vero細(xì)胞，該細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，經(jīng)鑒定為當(dāng)前流行的變異毒株，其毒力和致病性已通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。人工miRNA序列：通過(guò)對(duì)PEDV基因組的深入生物信息學(xué)分析，篩選出病毒核衣殼蛋白（N）基因上的關(guān)鍵保守區(qū)域作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了三條人工miRNA序列，分別命名為amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3。同時(shí)，合成了一條陰性對(duì)照人工miRNA（NC-amiRNA），其序列與PEDV基因組無(wú)互補(bǔ)配對(duì)。人工miRNA序列由上海生工生物工程有限公司合成，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于95%。試劑：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效將人工miRNA導(dǎo)入細(xì)胞中。RNA提取試劑盒采用Qiagen公司的RNeasyMiniKit，該試劑盒能夠快速、高效地提取高質(zhì)量的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為T(mén)aKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，其反轉(zhuǎn)錄效率高，能夠?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為高質(zhì)量的cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑選用SYBRGreenPCRMasterMix，購(gòu)自AppliedBiosystems公司，該試劑具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)病毒核酸的復(fù)制水平。其他常用試劑如胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，其能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。高速離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，最高轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm，能夠滿(mǎn)足細(xì)胞和病毒的離心分離需求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀選用ABI7500FastReal-TimePCRSystem，該儀器具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠進(jìn)行高效的核酸定量分析。酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司的Model680，可用于檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等實(shí)驗(yàn)的吸光度值。倒置顯微鏡為Nikon公司的EclipseTi-U，能夠?qū)崟r(shí)觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)與處理：將Vero細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化，將細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在轉(zhuǎn)染前2h，更換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，以減少血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。人工miRNA轉(zhuǎn)染：按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將人工miRNA表達(dá)載體（1μg）與Lipofectamine3000試劑（3μL）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)覝胤跤?min后，將兩者混合均勻，再孵育20min，形成脂質(zhì)體-miRNA復(fù)合物。將復(fù)合物加入到24孔板中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，以保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和人工miRNA的表達(dá)。病毒感染：轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞用PBS清洗3次，去除未轉(zhuǎn)染的人工miRNA和雜質(zhì)。然后，加入適量的PEDV病毒液，感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1，在37℃孵育1h，期間每隔15min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使病毒均勻分布。孵育結(jié)束后，吸去病毒液，用PBS再次清洗3次，去除未吸附的病毒。加入含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，并在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h）收集細(xì)胞和上清液，用于后續(xù)檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)及方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸的復(fù)制水平。收集感染后的細(xì)胞，用RNeasyMiniKit提取總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，引物序列根據(jù)PEDVN基因設(shè)計(jì)，上游引物：5'-ATGGTGCTGCTGCTGATG-3'，下游引物：5'-TCTGCTGCTGCTGCTGATG-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL、ddH?O7μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組中病毒核酸的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算病毒核酸的相對(duì)含量，評(píng)估人工miRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果。利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況。收集感染后的細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h后，加入PEDVN蛋白特異性抗體（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?h。再次用TBST洗膜3次后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)蛋白條帶，通過(guò)分析條帶的強(qiáng)度，評(píng)估人工miRNA對(duì)病毒蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）來(lái)評(píng)估人工miRNA對(duì)病毒感染的抑制作用。在顯微鏡下觀(guān)察不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等情況，記錄細(xì)胞病變的程度和出現(xiàn)病變的時(shí)間。正常細(xì)胞對(duì)照組應(yīng)保持正常的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，感染病毒組應(yīng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，而轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組的細(xì)胞病變應(yīng)明顯減輕，通過(guò)對(duì)比不同組的CPE情況，直觀(guān)地評(píng)估人工miRNA的抗病毒效果。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1人工miRNA轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證采用熒光顯微鏡觀(guān)察和定量檢測(cè)兩種方法對(duì)人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行驗(yàn)證。在熒光顯微鏡下，對(duì)轉(zhuǎn)染了帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的人工miRNA表達(dá)載體的Vero細(xì)胞進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h后，視野中可見(jiàn)大量發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，表明人工miRNA成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入Vero細(xì)胞（圖2A）。為了更準(zhǔn)確地量化轉(zhuǎn)染效率，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了（75.6±4.3）%（圖2B），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠有效地將人工miRNA導(dǎo)入Vero細(xì)胞，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的要求。[此處插入熒光顯微鏡觀(guān)察圖，圖中顯示轉(zhuǎn)染后發(fā)出綠色熒光的Vero細(xì)胞，A為低倍鏡視野，B為高倍鏡視野，標(biāo)尺注明]圖2人工miRNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的熒光顯微鏡觀(guān)察及轉(zhuǎn)染效率量化分析A：熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染后Vero細(xì)胞，綠色熒光表示轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染效率量化分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=5）。為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，采用定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)人工miRNA的表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞作為對(duì)照，提取轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中人工miRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01），與熒光顯微鏡觀(guān)察的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果一致（圖3）。這表明通過(guò)定量PCR檢測(cè)，也證實(shí)了人工miRNA成功轉(zhuǎn)染并在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，為后續(xù)研究人工miRNA對(duì)PEDV的抑制效果奠定了基礎(chǔ)。[此處插入人工miRNA表達(dá)水平定量PCR檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標(biāo)為人工miRNA相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]圖3人工miRNA在Vero細(xì)胞中的表達(dá)水平檢測(cè)與對(duì)照組相比，**P<0.01。3.2.2人工miRNA對(duì)PEDV復(fù)制的抑制效果通過(guò)檢測(cè)病毒滴度、病毒基因表達(dá)水平和病毒蛋白表達(dá)水平，全面評(píng)估人工miRNA對(duì)PEDV復(fù)制的抑制效果。采用50％組織細(xì)胞感染劑量（TCID50）法測(cè)定病毒滴度，結(jié)果顯示，在感染PEDV24h后，轉(zhuǎn)染了人工miRNA的細(xì)胞組中病毒滴度顯著低于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.5TCID50/mL，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.3TCID50/mL，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.2TCID50/mL，而未轉(zhuǎn)染組的病毒滴度高達(dá)10^4.0TCID50/mL（圖4）。這表明人工miRNA能夠顯著抑制PEDV在Vero細(xì)胞中的增殖，降低病毒滴度。[此處插入病毒滴度檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為組別（未轉(zhuǎn)染組、amiRNA-1轉(zhuǎn)染組、amiRNA-2轉(zhuǎn)染組、amiRNA-3轉(zhuǎn)染組），縱坐標(biāo)為病毒滴度（TCID50/mL），數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]圖4人工miRNA對(duì)PEDV病毒滴度的影響與未轉(zhuǎn)染組相比，**P<0.01。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算病毒N基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h），轉(zhuǎn)染人工miRNA的細(xì)胞組中病毒N基因的表達(dá)量均顯著低于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。在感染24h時(shí)，amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的病毒N基因相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組為0.30±0.04，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組為0.28±0.03，而未轉(zhuǎn)染組為1.00±0.08（圖5）。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)染組中病毒基因的表達(dá)量持續(xù)上升，而轉(zhuǎn)染人工miRNA的細(xì)胞組中病毒基因表達(dá)量的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯受到抑制，表明人工miRNA能夠有效抑制PEDV基因的轉(zhuǎn)錄，減少病毒核酸的合成。[此處插入病毒基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為感染時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為病毒N基因相對(duì)表達(dá)量，不同組別用不同線(xiàn)條表示，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]圖5人工miRNA對(duì)PEDV病毒基因表達(dá)水平的影響與未轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05，**P<0.01。采用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)感染24h后的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染人工miRNA的細(xì)胞組中PEDVN蛋白的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組（圖6A）。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算N蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示，amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的N蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.42±0.06，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組為0.38±0.05，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組為0.35±0.04，而未轉(zhuǎn)染組為1.00±0.09（圖6B）。這進(jìn)一步證實(shí)了人工miRNA能夠抑制PEDV蛋白的表達(dá)，從蛋白質(zhì)水平上表明人工miRNA對(duì)PEDV的復(fù)制具有顯著的抑制作用。[此處插入免疫印跡檢測(cè)結(jié)果圖，A為免疫印跡條帶圖，從上到下依次為N蛋白條帶、β-actin蛋白條帶，泳道1為未轉(zhuǎn)染組，泳道2-4分別為amiRNA-1、amiRNA-2、amiRNA-3轉(zhuǎn)染組；B為蛋白條帶灰度分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為N蛋白相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**表示P<0.01]圖6人工miRNA對(duì)PEDV病毒蛋白表達(dá)水平的影響A：免疫印跡檢測(cè)PEDVN蛋白表達(dá)；B：N蛋白相對(duì)表達(dá)量的灰度分析。與未轉(zhuǎn)染組相比，**P<0.01。3.2.3不同人工miRNA序列效果比較對(duì)設(shè)計(jì)合成的三條人工miRNA序列（amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3）的抑制效果進(jìn)行比較，篩選出抑制效果最佳的序列，并分析其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。通過(guò)病毒滴度檢測(cè)、病毒基因表達(dá)水平檢測(cè)和病毒蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果可以看出，三條人工miRNA序列均對(duì)PEDV的復(fù)制具有一定的抑制作用，但抑制效果存在差異。在病毒滴度檢測(cè)中，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度最低，為10^2.2TCID50/mL，顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（10^2.5TCID50/mL）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（10^2.3TCID50/mL）（P<0.05）（圖4）。在病毒基因表達(dá)水平檢測(cè)中，感染24h時(shí)，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒N基因相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.03，顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（0.35±0.05）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（0.30±0.04）（P<0.05）（圖5）。在病毒蛋白表達(dá)水平檢測(cè)中，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的N蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.04，也顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（0.42±0.06）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（0.38±0.05）（P<0.05）（圖6B）。綜合以上結(jié)果，amiRNA-3對(duì)PEDV復(fù)制的抑制效果最佳。進(jìn)一步分析amiRNA-3的序列結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，amiRNA-3的種子序列（5′端第2-8個(gè)核苷酸）與PEDVN基因靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性最高，幾乎完全匹配，這可能是其具有較高抑制活性的重要原因之一。amiRNA-3的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其前體能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部的堿基配對(duì)較為穩(wěn)定，環(huán)部大小適中，這種穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于amiRNA-3在細(xì)胞內(nèi)的加工和成熟，使其能夠更有效地發(fā)揮基因沉默作用。與其他兩條序列相比，amiRNA-3的側(cè)翼序列長(zhǎng)度和組成也更為合理，可能對(duì)維持其與靶mRNA的結(jié)合穩(wěn)定性以及RISC復(fù)合物的組裝和活性具有積極影響。四、人工miRNA在細(xì)胞上的初步應(yīng)用4.1構(gòu)建抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系4.1.1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系構(gòu)建原理與方法構(gòu)建抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的核心原理是利用基因工程技術(shù)，將能夠表達(dá)有效抑制PEDV復(fù)制的人工miRNA的表達(dá)載體穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞中，并使其整合到細(xì)胞基因組中，從而使細(xì)胞持續(xù)表達(dá)人工miRNA，獲得抗PEDV的能力。在方法上，首先需要對(duì)前期篩選出的具有高效抑制PEDV復(fù)制效果的人工miRNA（如amiRNA-3）進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。選擇合適的真核表達(dá)載體，如pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒載體，該載體具有能夠在多種細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因、攜帶綠色熒光蛋白（ZsGreen1）便于觀(guān)察轉(zhuǎn)染效果等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將人工miRNA的編碼序列克隆到載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體pLVX-amiRNA-3。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pLVX-amiRNA-3與病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用293T細(xì)胞高效的轉(zhuǎn)染和包裝能力，生產(chǎn)攜帶人工miRNA表達(dá)序列的慢病毒顆粒。按照轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，將8μgpLVX-amiRNA-3、4μgpsPAX2和2μgpMD2.G分別用無(wú)血清Opti-DMEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)缓髮⑥D(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）也用Opti-DMEM培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑢⑾♂尯蟮霓D(zhuǎn)染試劑逐滴加入到質(zhì)粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到培養(yǎng)好的293T細(xì)胞中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后6-8h，更換為新鮮的含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h收集培養(yǎng)上清液，其中含有慢病毒顆粒，通過(guò)0.45μm的濾器過(guò)濾去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，然后將收集到的慢病毒液分裝保存于-80℃冰箱中備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞，以2×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。在感染前2h，更換為含有6μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基，以提高慢病毒的感染效率。向每孔中加入適量的慢病毒液，使感染復(fù)數(shù)（MOI）達(dá)到合適的比例（如MOI=5），輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后4h，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene，減少其對(duì)細(xì)胞的毒性。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，去除含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，在感染后48-72h，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估慢病毒的感染效率。若感染效率達(dá)到預(yù)期（如70%以上），則可進(jìn)行后續(xù)的篩選和鑒定工作。4.1.2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的鑒定與特性分析為了鑒定成功構(gòu)建的抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，采用多種方法進(jìn)行驗(yàn)證。首先，提取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基因組DNA，以載體上的特異性引物和人工miRNA的特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。引物序列如下：上游引物5'-CGACTCACTATAGGGAGAG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGATG-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶（約為500bp），則初步表明人工miRNA的表達(dá)載體已成功整合到細(xì)胞基因組中。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與人工miRNA的原始序列進(jìn)行比對(duì)。若測(cè)序結(jié)果與原始序列一致，無(wú)堿基突變或缺失，進(jìn)一步確認(rèn)人工miRNA表達(dá)載體在細(xì)胞基因組中的正確整合。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中人工miRNA的表達(dá)水平。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算人工miRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中人工miRNA的表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照組細(xì)胞（P<0.01），表明人工miRNA在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中能夠穩(wěn)定且高效地表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的特性進(jìn)行全面分析。在細(xì)胞生長(zhǎng)特性方面，通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的影響。以未轉(zhuǎn)基因的Vero細(xì)胞作為對(duì)照，將兩種細(xì)胞分別以相同密度接種于96孔板中，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在接種后的0h、24h、48h、72h、96h，采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。具體操作是向每孔中加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD450）。根據(jù)OD450值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與對(duì)照組細(xì)胞基本一致，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD450值無(wú)顯著差異（P>0.05），表明人工miRNA的表達(dá)對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和傳代。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的形態(tài)特征。與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在形態(tài)上無(wú)明顯差異，均呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)飽滿(mǎn)，邊界清晰，細(xì)胞間連接緊密，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因操作未對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)造成明顯改變。在抗PEDV能力方面，對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和對(duì)照組細(xì)胞分別接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用PEDV以MOI=0.1的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h），收集細(xì)胞和上清液，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸的復(fù)制水平，利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況，并觀(guān)察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。結(jié)果顯示，在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中病毒核酸的相對(duì)含量和病毒蛋白的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.01）。在CPE觀(guān)察中，對(duì)照組細(xì)胞在感染后24h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，而轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的細(xì)胞病變程度明顯減輕，在感染后48h仍有大部分細(xì)胞保持正常形態(tài)，表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系對(duì)PEDV的感染具有顯著的抵抗能力，人工miRNA能夠有效抑制PEDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和增殖，從而保護(hù)細(xì)胞免受病毒的侵害。4.2人工miRNA在細(xì)胞抗病毒應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)與局限4.2.1優(yōu)勢(shì)分析人工miRNA在細(xì)胞抗病毒應(yīng)用中展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢(shì)，使其成為極具潛力的抗病毒策略。在特異性方面，人工miRNA能夠通過(guò)精心設(shè)計(jì)的序列，精準(zhǔn)地靶向病毒基因的特定區(qū)域。以針對(duì)PEDV的人工miRNA設(shè)計(jì)為例，通過(guò)對(duì)PEDV基因組的深入分析，選取核衣殼蛋白（N）基因上高度保守且關(guān)鍵的區(qū)域作為靶點(diǎn)。這種高度特異性的靶向作用，使得人工miRNA能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)病毒mRNA，避免對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)其他正常基因的干擾。與一些廣譜性的抗病毒藥物不同，人工miRNA不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的正常生理功能造成廣泛的影響，從而減少了藥物的副作用。研究表明，針對(duì)PEDVN基因設(shè)計(jì)的人工miRNA，能夠特異性地抑制PEDV的復(fù)制，而對(duì)宿主細(xì)胞的其他基因表達(dá)譜幾乎沒(méi)有影響，保證了細(xì)胞正常的生理代謝活動(dòng)。穩(wěn)定性是人工miRNA的另一大優(yōu)勢(shì)。相較于傳統(tǒng)的小分子抗病毒藥物，人工miRNA可以通過(guò)載體構(gòu)建的方式，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)和持續(xù)的作用。將人工miRNA的編碼序列整合到慢病毒載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，人工miRNA能夠隨著細(xì)胞的分裂而穩(wěn)定遺傳，持續(xù)發(fā)揮抗病毒作用。這種穩(wěn)定性使得細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)都能保持對(duì)病毒的抵抗力，無(wú)需頻繁給藥。在一些持續(xù)性病毒感染的細(xì)胞模型中，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)人工miRNA的細(xì)胞，在數(shù)周內(nèi)都能有效抑制病毒的復(fù)制，為病毒感染的長(zhǎng)期治療提供了可能。多靶點(diǎn)性是人工miRNA在抗病毒應(yīng)用中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。一個(gè)人工miRNA可以通過(guò)與多個(gè)靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)。對(duì)于病毒這種基因組相對(duì)較小、基因間相互關(guān)聯(lián)緊密的生物，人工miRNA的多靶點(diǎn)作用可以同時(shí)干擾病毒的多個(gè)關(guān)鍵基因，阻斷病毒的多個(gè)生命周期環(huán)節(jié)。PEDV的復(fù)制和感染過(guò)程涉及多個(gè)基因的協(xié)同作用，如S蛋白基因參與病毒的吸附和入侵，N蛋白基因參與病毒的組裝和釋放。設(shè)計(jì)的人工miRNA可以同時(shí)靶向S蛋白基因和N蛋白基因，不僅抑制病毒的入侵過(guò)程，還能干擾病毒的組裝和釋放，從而更全面地抑制病毒的復(fù)制和傳播。這種多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，相較于單一靶點(diǎn)的抗病毒策略，能夠更有效地阻止病毒的變異和逃逸，提高抗病毒的效果。4.2.2局限性探討盡管人工miRNA在細(xì)胞抗病毒應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前也存在一些明顯的局限性，限制了其更廣泛的應(yīng)用。脫靶效應(yīng)是人工miRNA面臨的主要問(wèn)題之一。由于miRNA與靶mRNA的結(jié)合并非完全嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)，存在一定的錯(cuò)配容忍度，這就導(dǎo)致人工miRNA可能會(huì)與非靶基因的mRNA發(fā)生結(jié)合，從而影響非靶基因的正常表達(dá)。這種脫靶效應(yīng)可能會(huì)引發(fā)一系列意想不到的副作用，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞病變或死亡。在針對(duì)PEDV的人工miRNA研究中，雖然設(shè)計(jì)時(shí)盡量保證其特異性，但仍有研究發(fā)現(xiàn)，部分人工miRNA會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)一些與免疫調(diào)節(jié)、代謝等相關(guān)的非靶基因產(chǎn)生影響，改變了細(xì)胞的正常代謝途徑和免疫應(yīng)答反應(yīng)，這為其臨床應(yīng)用帶來(lái)了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞毒性也是需要關(guān)注的問(wèn)題。在人工miRNA的轉(zhuǎn)染和表達(dá)過(guò)程中，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用。轉(zhuǎn)染試劑本身可能對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。人工miRNA在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)量表達(dá)也可能干擾細(xì)胞內(nèi)正常的RNA代謝過(guò)程，影響其他內(nèi)源性miRNA的功能，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生負(fù)面影響。某些人工miRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度明顯下降，細(xì)胞凋亡率增加，這表明細(xì)胞受到了一定程度的損傷，限制了人工miRNA在細(xì)胞中的應(yīng)用劑量和時(shí)間。遞送效率是制約人工miRNA應(yīng)用的關(guān)鍵因素。要使人工miRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用，需要將其高效地遞送至細(xì)胞內(nèi)。目前的遞送方法仍存在一些不足，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但轉(zhuǎn)染效率在不同細(xì)胞系中差異較大，且可能引起細(xì)胞毒性。病毒載體遞送雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但存在免疫原性和潛在的插入突變風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞和某些特殊的細(xì)胞系，人工miRNA的遞送效率更低，這使得其在這些細(xì)胞中的應(yīng)用受到很大限制。在一些原代腸道上皮細(xì)胞的研究中，由于細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)和生理特性，人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率往往低于20%，難以達(dá)到有效的抗病毒濃度，影響了對(duì)病毒感染的治療效果。五、討論與展望5.1研究結(jié)果的綜合討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了人工miRNA對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抑制效果及其在細(xì)胞上的初步應(yīng)用，取得了一系列有價(jià)值的成果。在人工miRNA抗PEDV效果研究中，成功設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)PEDV核衣殼蛋白（N）基因保守區(qū)域的三條人工miRNA序列（amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3），并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入Vero細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染人工miRNA的細(xì)胞對(duì)PEDV的感染具有顯著的抵抗能力。通過(guò)檢測(cè)病毒滴度、病毒基因表達(dá)水平和病毒蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)三條人工miRNA序列均能有效抑制PEDV的復(fù)制，其中amiRNA-3的抑制效果最為顯著。在感染PEDV24h后，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度僅為10^2.2TCID50/mL，顯著低于未轉(zhuǎn)染組的10^4.0TCID50/mL；病毒N基因相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.03，僅為未轉(zhuǎn)染組的28%；N蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.04，也顯著低于未轉(zhuǎn)染組。這表明人工miRNA能夠從核酸和蛋白質(zhì)水平上有效抑制PEDV的復(fù)制，為抗PEDV治療提供了新的策略。在人工miRNA在細(xì)胞上的初步應(yīng)用方面，成功構(gòu)建了抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。通過(guò)將表達(dá)amiRNA-3的慢病毒載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)人工miRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。鑒定結(jié)果顯示，人工miRNA表達(dá)載體已成功整合到細(xì)胞基因組中，且人工miRNA在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中能夠穩(wěn)定且高效地表達(dá)。特性分析表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的生長(zhǎng)和形態(tài)未受到明顯影響，但其對(duì)PEDV的感染具有顯著的抵抗能力。在病毒感染實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中病毒核酸的相對(duì)含量和病毒蛋白的表達(dá)量在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞病變程度也明顯減輕，這進(jìn)一步證明了人工miRNA在細(xì)胞抗病毒應(yīng)用中的有效性。與其他相關(guān)研究相比，本研究具有一定的獨(dú)特性和創(chuàng)新性。在人工miRNA的設(shè)計(jì)上，通過(guò)對(duì)PEDV基因組的深入生物信息學(xué)分析，精準(zhǔn)地選擇了N基因上高度保守且關(guān)鍵的區(qū)域作為靶點(diǎn)，提高了人工miRNA的特異性和有效性。一些研究雖然也針對(duì)PEDV設(shè)計(jì)了人工miRNA，但靶點(diǎn)的選擇可能不夠精準(zhǔn)，導(dǎo)致抑制效果不佳。在轉(zhuǎn)染方法和載體選擇上，本研究采用了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和慢病毒載體，提高了人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法和載體相比，本研究的方法能夠更有效地將人工miRNA導(dǎo)入細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。在研究?jī)?nèi)容上，本研究不僅關(guān)注了人工miRNA對(duì)PEDV復(fù)制的抑制效果，還進(jìn)一步探究了其在細(xì)胞上的應(yīng)用，構(gòu)建了抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。而其他研究可能僅停留在人工miRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果研究上，缺乏對(duì)其在細(xì)胞應(yīng)用方面的深入探究。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在人工miRNA抗PEDV領(lǐng)域具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在人工miRNA序列設(shè)計(jì)上，通過(guò)深入的生物信息學(xué)分析，精準(zhǔn)地選取了PEDV核衣殼蛋白（N）基因上高度保守且對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要的區(qū)域作為靶點(diǎn)。相較于其他研究可能隨機(jī)或?qū)挿旱剡x擇靶點(diǎn)，本研究的靶點(diǎn)選擇更具針對(duì)性，能夠更有效地發(fā)揮人工miRNA對(duì)病毒基因的沉默作用，提高了抑制PEDV復(fù)制的效果。在細(xì)胞應(yīng)用策略方面，首次構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人工miRNA的抗PEDV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。這種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不僅為研究人工miRNA的抗病毒機(jī)制提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型，還為后續(xù)開(kāi)發(fā)抗PEDV的細(xì)胞治療方法或生物制劑奠定了基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，開(kāi)拓了人工miRNA在抗PEDV研究中的新方向。本研究也存在一些不足之處。在實(shí)驗(yàn)樣本方面，僅選用了Vero細(xì)胞系進(jìn)行研究，雖然Vero細(xì)胞對(duì)PEDV敏感，是常用的研究細(xì)胞系，但細(xì)胞種類(lèi)相對(duì)單一，不能完全代表豬體內(nèi)的各種細(xì)胞類(lèi)型。不同細(xì)胞類(lèi)型可能對(duì)人工miRNA的攝取效率、表達(dá)水平以及對(duì)PEDV的感染和防御機(jī)制存在差異，因此研究結(jié)果在其他細(xì)胞類(lèi)型中的適用性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。未來(lái)研究可以選取多種豬源細(xì)胞系，如豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）等，這些細(xì)胞更接近PEDV在豬體內(nèi)的天然感染部位，能夠更全面地評(píng)估人工miRNA的抗病毒效果和作用機(jī)制。在作用機(jī)制研究方面，