乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株遺傳重配：技術(shù)突破與疫苗制備新路徑一、引言1.1研究背景與意義流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，隸屬正粘病毒科（Orthomyxoviridae），是一種帶有包膜的單負鏈RNA病毒，其基因組被劃分為8個節(jié)段。依據(jù)流感病毒核蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（M）抗原性的不同，可將其分為甲（A）、乙（B）和丙（C）三型。其中，乙型流感病毒雖未曾像甲型流感病毒那樣引發(fā)人群大規(guī)模的流行，但它能夠借助抗原漂移不斷產(chǎn)生新的病毒，每年都會在全球范圍內(nèi)引發(fā)季節(jié)性流行，嚴重威脅人類的健康和生命安全。季節(jié)性流感疫苗通常由A（H1N1）、A（H3N2）和乙型病毒共同組成生產(chǎn)毒株。當(dāng)前已上市的季節(jié)性流感疫苗主要包含裂解疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗這三類。流感減毒活疫苗通過滴鼻方式接種，能模擬病毒自然感染途徑，在呼吸道粘膜誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，免疫保護性良好。然而，現(xiàn)有的上市流感減毒活疫苗大多以雞胚作為生產(chǎn)基質(zhì)，這一生產(chǎn)方式存在諸多弊端。一方面，由于缺乏有效的病毒滅活手段，在生產(chǎn)過程中存在傳播雞源病原體的風(fēng)險；另一方面，雞胚的供給周期較長，這對疫苗生產(chǎn)造成了限制，尤其是在高致病性流感突然爆發(fā)時，難以滿足應(yīng)對流感大流行的疫苗需求。Vero細胞是WHO推薦用于生產(chǎn)人用生物制品的細胞基質(zhì)，它可以采用發(fā)酵罐進行大規(guī)模培養(yǎng)病毒。與雞胚培養(yǎng)相比，細胞培養(yǎng)病毒具有抗原變異小的優(yōu)勢，能使病毒更接近原始分離病毒。不過，Vero細胞并非培養(yǎng)流感病毒最為敏感的基質(zhì)，不同毒株間的產(chǎn)毒量差異較大，甚至存在某些毒株不能在其上生長復(fù)制的情況。截至目前，全球范圍內(nèi)尚無基于Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的季節(jié)性流感病毒減毒活疫苗上市。經(jīng)過十余年的深入研究，團隊在國際上率先成功選育出一株乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/23/2011Vca（BVca）。本研究旨在以BVca作為母本毒株，與WHO推薦的乙型流感病毒流行株B/Brisbane/60/2008NYMCBX-35（BX-35）進行遺傳重配，從而解決Vero細胞乙型流感病毒減毒疫苗生產(chǎn)毒株制備的瓶頸技術(shù)問題。通過這一研究，有望推動以Vero細胞為基質(zhì)的乙型流感病毒減毒活疫苗的研發(fā)，為流感的預(yù)防和控制提供更為有效的手段，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2乙型流感病毒概述乙型流感病毒（InfluenzaBvirus）隸屬正粘病毒科流感病毒屬，其病毒粒子呈球形或絲狀，直徑約為80-120納米，具有包膜結(jié)構(gòu)。病毒包膜由來自宿主細胞膜的脂質(zhì)雙層和病毒自身編碼的兩種糖蛋白刺突組成，分別是血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。HA在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠特異性地識別并結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體，介導(dǎo)病毒包膜與宿主細胞膜的融合，從而使病毒核酸得以進入宿主細胞內(nèi)；NA則主要參與病毒從感染細胞表面的釋放過程，通過水解宿主細胞表面的唾液酸殘基，防止新合成的病毒粒子在細胞表面聚集，促進病毒的傳播。乙型流感病毒的基因組為單負鏈RNA，由8個獨立的節(jié)段組成，分別編碼11種蛋白質(zhì)，包括PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2和PB1-F2。每個節(jié)段的RNA都與核蛋白（NP）緊密結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），這種結(jié)構(gòu)有助于保護病毒RNA免受核酸酶的降解，并在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。乙型流感病毒與甲型流感病毒相比，其抗原漂移的速度相對較慢，但仍可通過不斷的抗原漂移產(chǎn)生新的變異株?？乖剖侵赣捎诓《净蚪M中HA和NA基因的點突變，導(dǎo)致HA和NA蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，進而使病毒的抗原性發(fā)生變化。這種抗原性的改變使得宿主免疫系統(tǒng)難以識別和清除變異后的病毒，從而導(dǎo)致病毒能夠在人群中持續(xù)傳播。乙型流感病毒可進一步分為Victoria和Yamagata兩個譜系。這兩個譜系在抗原性、基因序列以及流行特征等方面存在一定的差異。自1983年首次分離出Yamagata譜系病毒以來，這兩個譜系的病毒在全球范圍內(nèi)交替流行，不同年份和地區(qū)的優(yōu)勢流行譜系有所不同。例如，在某些季節(jié)，Victoria譜系的病毒可能占據(jù)主導(dǎo)地位，而在另一些季節(jié)，Yamagata譜系的病毒則更為流行。這種復(fù)雜的流行態(tài)勢給流感的防控工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。盡管乙型流感病毒未曾引發(fā)像甲型流感病毒那樣的全球性大流行，但其每年在全球范圍內(nèi)引發(fā)的季節(jié)性流行，仍然給公共衛(wèi)生帶來了巨大的威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，每年流感的季節(jié)性流行可導(dǎo)致全球300-500萬例嚴重病例，其中約29-65萬人死于流感相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病。乙型流感病毒在兒童、老年人、孕婦以及患有慢性基礎(chǔ)疾病等免疫力低下的人群中，更容易引起嚴重的感染和并發(fā)癥，如肺炎、心肌炎、腦炎等，這些并發(fā)癥不僅會增加患者的痛苦和治療難度，還可能導(dǎo)致患者的死亡風(fēng)險顯著升高。此外，流感的季節(jié)性流行還會對社會經(jīng)濟造成嚴重的影響，包括醫(yī)療資源的大量消耗、勞動生產(chǎn)力的下降以及學(xué)校和工作場所的缺勤率增加等。因此，加強對乙型流感病毒的研究，開發(fā)有效的預(yù)防和控制措施，對于保障公眾健康和社會經(jīng)濟的穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。1.3Vero細胞在病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用Vero細胞作為一種重要的細胞基質(zhì)，在病毒培養(yǎng)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，成為生產(chǎn)人用生物制品的理想選擇。1962年3月，日本學(xué)者YASUMURAY和KAWAKITAY首次成功建立了Vero細胞系，該細胞系源自非洲綠猴腎細胞，屬于連續(xù)細胞系。其對多種病毒具有高度的易感性，能夠支持多種病毒在其中生長和繁殖，并且在感染病毒后不產(chǎn)生干擾素，這為病毒的大量增殖提供了有利條件。同時，Vero細胞具有強大的增殖能力，可實現(xiàn)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)對細胞數(shù)量的需求。利用生物反應(yīng)器進行Vero細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，能夠在相對較小的空間內(nèi)獲得大量的細胞，從而提高病毒的生產(chǎn)效率。此外，Vero細胞生產(chǎn)的病毒抗原具有良好的穩(wěn)定性，這對于保證疫苗的質(zhì)量和免疫效果至關(guān)重要。由于上述優(yōu)勢，Vero細胞已廣泛應(yīng)用于多種病毒疫苗的生產(chǎn)中，包括狂犬疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、EV71疫苗以及流感疫苗等，并且成為WHO推薦可普遍應(yīng)用于病毒疫苗生產(chǎn)的首選細胞系。在狂犬疫苗的生產(chǎn)中，Vero細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用使得疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量得到了顯著提升；在脊髓灰質(zhì)炎疫苗的制備過程中，Vero細胞能夠有效地支持病毒的生長和繁殖，為疫苗的生產(chǎn)提供了穩(wěn)定的細胞基質(zhì)。然而，Vero細胞在用于流感病毒培養(yǎng)時，也面臨一些挑戰(zhàn)。一方面，Vero細胞并非培養(yǎng)流感病毒最為敏感的基質(zhì)，不同毒株間在Vero細胞上的產(chǎn)毒量存在較大差異。某些流感病毒毒株在Vero細胞上能夠高效復(fù)制，產(chǎn)生較高滴度的病毒；而另一些毒株則可能在Vero細胞上的生長受到限制，產(chǎn)毒量較低，甚至無法生長復(fù)制。另一方面，盡管Vero細胞具有諸多優(yōu)點，但在實際生產(chǎn)過程中，仍需要對其培養(yǎng)條件進行精細的優(yōu)化和調(diào)控，以確保細胞的生長狀態(tài)和病毒的生產(chǎn)效率。培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)溫度、pH值以及溶解氧等因素都會對Vero細胞的生長和病毒的培養(yǎng)產(chǎn)生重要影響，需要進行深入的研究和優(yōu)化。為了解決Vero細胞在流感病毒培養(yǎng)中存在的問題，科研人員開展了大量的研究工作。其中，選育冷適應(yīng)株是一種重要的策略。冷適應(yīng)株是指在低溫條件下能夠良好生長和繁殖的病毒株，其具有溫度敏感性（ts）、冷適應(yīng)性（ca）和減毒（at）等表型特征。通過選育冷適應(yīng)株，可以提高流感病毒在Vero細胞上的生長能力和產(chǎn)毒量，同時降低病毒的致病性，為流感減毒活疫苗的生產(chǎn)提供更優(yōu)質(zhì)的毒株。經(jīng)過十余年的不懈努力，團隊在國際上率先成功選育出一株乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/23/2011Vca（BVca）。這一成果為后續(xù)的研究和疫苗開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)，有望推動以Vero細胞為基質(zhì)的乙型流感病毒減毒活疫苗的研發(fā)進程，為流感的防控提供新的有力手段。1.4遺傳重配技術(shù)原理及在流感病毒研究中的應(yīng)用遺傳重配，又被稱作基因重配，是指在同一宿主細胞內(nèi)，當(dāng)兩種或兩種以上不同病毒感染時，它們的基因組片段發(fā)生交換與重新組合，進而產(chǎn)生具有新遺傳特征子代病毒的過程。這一過程主要基于流感病毒基因組的分節(jié)段特性。流感病毒的基因組由8個獨立的節(jié)段組成，每個節(jié)段都編碼特定的蛋白質(zhì)。當(dāng)不同的流感病毒株同時感染同一個宿主細胞時，這些病毒的基因組節(jié)段在細胞內(nèi)進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的過程中，有可能發(fā)生隨機的交換和重新組合。在甲型流感病毒中，當(dāng)一種具有特定HA和NA基因的病毒株與另一種具有不同HA和NA基因的病毒株共同感染細胞時，它們的基因組節(jié)段可能會發(fā)生重配，產(chǎn)生的子代病毒可能會攜帶來自不同親代病毒的HA和NA基因，從而具有新的抗原特性。在流感病毒研究領(lǐng)域，遺傳重配技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值。它被廣泛用于流感疫苗株的制備。由于流感病毒的抗原性不斷發(fā)生變異，每年流行的流感病毒株可能與上一年有所不同。為了使流感疫苗能夠有效預(yù)防當(dāng)年流行的病毒株，需要不斷更新疫苗株。通過遺傳重配技術(shù)，將當(dāng)前流行株的關(guān)鍵抗原基因（如HA和NA基因）與具有良好生長特性和免疫原性的母本毒株進行重配，可以獲得既具有流行株抗原性，又能在生產(chǎn)基質(zhì)中高效生長的疫苗株。在制備季節(jié)性流感疫苗時，科研人員會將WHO推薦的流感病毒流行株的HA和NA基因與經(jīng)過篩選的母本毒株進行遺傳重配，從而獲得適合生產(chǎn)疫苗的毒株。遺傳重配技術(shù)還可用于流感病毒進化和變異的研究。通過對重配后病毒的遺傳特性和生物學(xué)特性進行分析，可以深入了解病毒基因之間的相互作用以及這些作用對病毒進化和變異的影響。研究不同基因節(jié)段的組合如何影響病毒的致病性、傳播能力以及對宿主免疫系統(tǒng)的逃逸能力等，有助于預(yù)測流感病毒的進化趨勢，為流感的防控提供科學(xué)依據(jù)。在流感病毒的耐藥性研究中，遺傳重配技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。通過將耐藥病毒株與敏感病毒株進行遺傳重配，可以確定耐藥基因所在的節(jié)段，并進一步研究耐藥機制。這對于開發(fā)新的抗流感藥物以及合理使用現(xiàn)有藥物具有重要的指導(dǎo)意義。二、乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株的選育及特性2.1選育過程及關(guān)鍵技術(shù)本研究中的乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株的選育工作，始于從臨床樣本中采集流感病毒。這些臨床樣本主要來源于流感患者的咽拭子或鼻拭子，采集過程嚴格遵循臨床采樣規(guī)范，確保樣本的質(zhì)量和代表性。采集后的樣本迅速被送至實驗室，在生物安全防護條件下進行病毒的分離工作。通過雞胚接種法，將臨床樣本接種于9-11日齡的SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，于33-35℃孵育48-72小時，隨后收集雞胚尿囊液，經(jīng)過多次盲傳和鑒定，成功分離出乙型流感病毒原始毒株。將分離得到的原始毒株進行Vero細胞適應(yīng)性傳代培養(yǎng)。Vero細胞的培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。當(dāng)Vero細胞生長至對數(shù)生長期，達到80%-90%融合度時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔洗滌細胞2-3次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。隨后，將適量的原始毒株接種于Vero細胞中，接種時確保病毒與細胞充分接觸，病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）控制在0.01-0.1之間。接種后，將細胞置于33℃培養(yǎng)箱中吸附1-2小時，期間輕輕搖晃培養(yǎng)容器，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，加入適量的維持培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為含0.2-1.0μg/mLTPCK-胰酶的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在傳代過程中，對病毒的生長特性和適應(yīng)性進行密切監(jiān)測。每隔24-48小時，通過觀察細胞病變效應(yīng)（CPE）來判斷病毒的感染情況。當(dāng)CPE達到70%-80%時，收集細胞培養(yǎng)上清液，作為下一代傳代的種毒。隨著傳代次數(shù)的增加，病毒在Vero細胞上的生長能力逐漸增強，產(chǎn)毒量也逐漸提高。通過優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件，包括調(diào)整培養(yǎng)基中血清和胰酶的濃度、優(yōu)化培養(yǎng)溫度和pH值等，進一步提高病毒的生長效率和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中胎牛血清濃度為8%，TPCK-胰酶濃度為0.5μg/mL，培養(yǎng)溫度為33℃，pH值為7.2-7.4時，病毒在Vero細胞上的生長狀態(tài)最佳，產(chǎn)毒量最高。經(jīng)過連續(xù)多代的傳代培養(yǎng)和篩選，獲得了在Vero細胞上能夠穩(wěn)定生長且產(chǎn)毒量較高的適應(yīng)株。對這些適應(yīng)株進行進一步的鑒定，包括病毒的型別鑒定、血凝滴度測定、感染性滴度測定以及基因序列分析等。通過RT-PCR技術(shù)擴增病毒的NP基因和M基因，進行測序和比對，確定病毒的型別為乙型流感病毒。采用血凝試驗測定病毒的血凝滴度，結(jié)果顯示適應(yīng)株的血凝滴度穩(wěn)定在1:256-1:512之間。通過TCID??法測定病毒的感染性滴度，適應(yīng)株的感染性滴度達到1×10?-1×10?TCID??/mL。對適應(yīng)株的全基因組進行測序分析，發(fā)現(xiàn)與原始毒株相比，在一些基因位點上發(fā)生了適應(yīng)性突變，這些突變可能與病毒在Vero細胞上的生長和適應(yīng)密切相關(guān)。2.2BVca的生物學(xué)性狀分析將選育得到的BVca接種于Vero細胞，對其在Vero細胞上的生長特性進行深入研究。在33℃培養(yǎng)條件下，定期收集細胞培養(yǎng)上清液，采用血凝試驗（HA）測定其血凝滴度，以評估病毒表面血凝素蛋白的活性和含量；同時，通過TCID??法測定感染性滴度，用于衡量病毒的感染能力和數(shù)量。結(jié)果顯示，BVca在Vero細胞上呈現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢。隨著培養(yǎng)時間的延長，病毒的血凝滴度和感染性滴度逐漸升高，在接種后的48-72小時達到峰值。在感染后48小時，血凝滴度可穩(wěn)定達到1:512，感染性滴度高達1×10?TCID??/mL；至72小時，血凝滴度進一步提升至1:1024，感染性滴度維持在1×10?-1×10?TCID??/mL之間。這表明BVca能夠在Vero細胞中高效復(fù)制，具備較強的增殖能力。為了檢測BVca的溫度敏感性（ts），分別將其置于不同溫度條件下進行培養(yǎng)，包括33℃、37℃和39℃。在33℃時，病毒能夠正常生長和復(fù)制，感染性滴度保持在較高水平；當(dāng)溫度升高至37℃時，病毒的生長受到一定程度的抑制，感染性滴度相較于33℃時有所下降，約降低至1×10?-1×10?TCID??/mL；而當(dāng)溫度進一步升高到39℃時，病毒幾乎無法生長，感染性滴度極低，低于檢測限。這一結(jié)果充分說明BVca對溫度較為敏感，在較高溫度下其生長和復(fù)制能力受到顯著抑制，具有典型的溫度敏感性表型。冷適應(yīng)性（ca）的檢測則是將BVca在25℃的低溫條件下進行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒在25℃時仍能夠較好地生長和繁殖，感染性滴度可達到1×10?-1×10?TCID??/mL。這表明BVca具有良好的冷適應(yīng)能力，能夠在低溫環(huán)境下保持相對穩(wěn)定的生長狀態(tài)，這一特性對于其在疫苗制備過程中的應(yīng)用具有重要意義。減毒特性的研究采用動物實驗進行評估。選取6-8周齡的BALB/c小鼠，將BVca以不同劑量經(jīng)滴鼻途徑感染小鼠，觀察小鼠的發(fā)病癥狀和生存情況。同時，設(shè)立對照組，感染野生型乙型流感病毒。感染后，密切監(jiān)測小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、活動能力等指標。結(jié)果顯示，感染BVca的小鼠體重下降幅度明顯小于感染野生型病毒的小鼠，且精神狀態(tài)和活動能力相對較好，無明顯的發(fā)病癥狀；在高劑量感染情況下，野生型病毒感染組小鼠出現(xiàn)較高的死亡率，而BVca感染組小鼠的死亡率顯著降低。這充分表明BVca具有明顯的減毒特性，在感染動物后不會引起嚴重的疾病癥狀和死亡，為其作為減毒疫苗候選毒株提供了有力的證據(jù)。2.3BVca的基因特征研究對BVca的全基因組進行測序，深入分析其基因特征。通過與原始毒株B/Yunnan/23/2011的基因序列進行細致比對，發(fā)現(xiàn)BVca在多個基因節(jié)段上存在特異性突變位點。在HA基因上，發(fā)現(xiàn)了多個氨基酸位點的突變，如第125位氨基酸由天冬酰胺（Asn）突變?yōu)榻z氨酸（Ser），第226位氨基酸由亮氨酸（Leu）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕et）等。這些突變位點可能會影響HA蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能，進而影響病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合能力以及病毒的免疫原性。在NA基因上，也檢測到了關(guān)鍵位點的突變，例如第432位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le），這一突變可能會改變NA蛋白的酶活性，影響病毒從感染細胞表面的釋放過程。進一步探究這些突變位點與BVca冷適應(yīng)和減毒表型之間的關(guān)系。研究表明，某些突變位點與冷適應(yīng)表型密切相關(guān)。在PB2基因上的一個突變位點，使得病毒在低溫條件下能夠更有效地啟動轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，從而增強了病毒在25℃等低溫環(huán)境下的生長能力。通過定點突變實驗，將野生型病毒的PB2基因中對應(yīng)的位點突變?yōu)榕cBVca相同的氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的病毒在25℃時的生長能力明顯提高，而將BVca的該位點回復(fù)突變后，其在低溫下的生長能力則顯著下降。這充分證實了該突變位點在BVca冷適應(yīng)表型中的關(guān)鍵作用。一些突變位點與減毒表型相關(guān)。在NP基因上的特定突變，可能影響了病毒核蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性和功能，從而降低了病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力和致病性。動物實驗顯示，感染攜帶該突變NP基因的BVca的小鼠，其肺部的病毒載量明顯低于感染野生型病毒的小鼠，且小鼠的發(fā)病癥狀也較輕。對感染小鼠的肺組織進行病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)感染BVca的小鼠肺組織炎癥程度明顯減輕，細胞損傷較少。這表明NP基因上的突變在BVca的減毒過程中發(fā)揮了重要作用。為了更全面地了解BVca感染后的基因表達變化，對BVca感染Vero細胞后的轉(zhuǎn)錄組進行分析。采用高通量測序技術(shù)，對感染不同時間點（如感染后6小時、12小時、24小時和48小時）的Vero細胞進行RNA測序，并與未感染的Vero細胞作為對照。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在BVca感染后，宿主細胞內(nèi)多個基因的表達發(fā)生了顯著變化。在感染早期（6-12小時），與細胞抗病毒免疫反應(yīng)相關(guān)的基因，如干擾素誘導(dǎo)蛋白基因（IFI44L、ISG15等）和炎癥相關(guān)基因（IL-6、TNF-α等）的表達顯著上調(diào)，這表明宿主細胞在感染早期就啟動了抗病毒免疫應(yīng)答。隨著感染時間的延長（24-48小時），與細胞代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因表達受到抑制，而與病毒復(fù)制和裝配相關(guān)的基因表達則顯著增強。在48小時時，病毒的PB1、PB2、PA等基因的表達量達到峰值，同時宿主細胞的核糖體蛋白基因和能量代謝相關(guān)基因的表達量明顯下降。通過基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，進一步揭示了這些差異表達基因所參與的生物學(xué)過程和信號通路。GO富集分析表明，差異表達基因主要富集在免疫應(yīng)答、病毒感染、細胞代謝調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中。KEGG通路分析顯示，這些基因主要參與了干擾素信號通路、NF-κB信號通路以及核糖體生物合成等信號通路。這說明BVca感染Vero細胞后，不僅會影響宿主細胞的免疫應(yīng)答和代謝過程，還會利用宿主細胞的各種機制來促進自身的復(fù)制和傳播。三、乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株遺傳重配實驗3.1實驗材料與方法本實驗選用乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株B/Yunnan/23/2011Vca（BVca）作為母本毒株，該毒株由前期研究選育獲得，具備在Vero細胞上良好生長以及冷適應(yīng)、減毒等特性。同時，選取WHO推薦的乙型流感病毒流行株B/Brisbane/60/2008NYMCBX-35（BX-35），其代表了當(dāng)前乙型流感病毒的流行特征，具有重要的研究價值。實驗使用的Vero細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細胞在含10%胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。在傳代過程中，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，確保細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。當(dāng)細胞生長至80%-90%融合度時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔洗滌細胞2-3次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。隨后，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將細胞消化下來，制成細胞懸液，按照1:3-1:4的比例進行傳代接種?？笲Vca血清通過免疫兔子制備。選取健康的新西蘭大白兔，體重約2-3kg，采用多點皮下注射的方式，將滅活的BVca病毒與弗氏完全佐劑充分乳化后進行初次免疫，免疫劑量為1mL/只。間隔2周后，用滅活的BVca病毒與弗氏不完全佐劑乳化后進行加強免疫，共加強免疫3次，每次免疫劑量均為1mL/只。最后一次免疫后1周，采集兔血清，通過血凝抑制試驗（HI）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中抗體的效價和特異性。當(dāng)血清抗體效價達到1:128以上，且特異性良好時，收集血清，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗前，小鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。將處于對數(shù)生長期、融合度達到80%-90%的Vero細胞接種于25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種細胞數(shù)約為5×10?個。待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次。隨后，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.01的比例，同時接種BVca和BX-35病毒，接種體積為1mL，確保病毒與細胞充分接觸。將培養(yǎng)瓶置于33℃培養(yǎng)箱中吸附1-2小時，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，加入適量的維持培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為含0.5μg/mLTPCK-胰酶的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在共感染后的48-72小時，當(dāng)細胞病變效應(yīng)（CPE）達到70%-80%時，收集細胞培養(yǎng)上清液，作為重配病毒的粗提液。向粗提液中加入適量的抗BVca血清，使血清終濃度為10%，充分混勻后，置于37℃孵育1-2小時，以中和帶有母本株表面抗原HA和NA的子代病毒。將中和后的病毒液進行蝕斑純化。首先，制備1.5%的低熔點瓊脂糖（LMA）溶液，將其與預(yù)熱至37℃的2×MEM培養(yǎng)基按照1:1的比例混合，制成含0.75%LMA的MEM半固體培養(yǎng)基。取適量的中和后病毒液接種于長滿Vero細胞的6孔板中，每孔接種體積為0.2mL，置于37℃培養(yǎng)箱中吸附1-2小時。吸附結(jié)束后，棄去病毒液，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次。隨后，向每孔中加入2mL含0.75%LMA的MEM半固體培養(yǎng)基，輕輕搖勻，待半固體培養(yǎng)基凝固后，將6孔板置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)3-5天后，觀察并挑選出單個清晰的蝕斑。用無菌牙簽將蝕斑挑取至含1mL維持培養(yǎng)基的離心管中，反復(fù)吹打使蝕斑中的病毒釋放到培養(yǎng)基中。將病毒懸液接種于新的長滿Vero細胞的24孔板中，每孔接種體積為0.2mL，進行擴增培養(yǎng)。待細胞出現(xiàn)明顯CPE后，收集細胞培養(yǎng)上清液，再次進行蝕斑純化，如此重復(fù)3-4次，直至獲得純化的重配病毒。采用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）對重配病毒進行初步鑒定。HA試驗用于測定病毒的血凝滴度，以評估病毒表面血凝素蛋白的活性和含量。具體操作如下：將重配病毒進行倍比稀釋，從1:2開始，依次稀釋至1:1024。取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入50μLPBS緩沖液，然后向第一列孔中加入50μL稀釋好的病毒液，充分混勻后，吸取50μL轉(zhuǎn)移至第二列孔中，依次類推，進行倍比稀釋，最后一列孔作為陰性對照，只加入50μLPBS緩沖液。向每孔中加入50μL1%雞紅細胞懸液，輕輕振蕩混勻后，置于室溫下靜置30-45分鐘，觀察紅細胞的凝集情況。以出現(xiàn)完全凝集的病毒最高稀釋度的倒數(shù)作為該病毒的血凝滴度。HI試驗用于鑒定重配病毒的抗原性，以確定其是否含有BX-35的表面抗原。首先，將抗BX-35血清進行倍比稀釋，從1:10開始，依次稀釋至1:1280。取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入25μLPBS緩沖液，然后向第一列孔中加入25μL稀釋好的抗BX-35血清，充分混勻后，吸取25μL轉(zhuǎn)移至第二列孔中，依次類推，進行倍比稀釋。向每孔中加入25μL含有4個血凝單位（HAU）的重配病毒液，充分混勻后，置于室溫下孵育30分鐘。隨后，向每孔中加入50μL1%雞紅細胞懸液，輕輕振蕩混勻后，置于室溫下靜置30-45分鐘，觀察紅細胞的凝集情況。以能夠完全抑制紅細胞凝集的抗血清最高稀釋度的倒數(shù)作為該抗血清對重配病毒的血凝抑制效價。如果重配病毒能被抗BX-35血清特異性抑制，且抑制效價與抗BX-35血清對BX-35病毒的抑制效價相近，則初步表明重配病毒含有BX-35的表面抗原。通過RT-PCR技術(shù)擴增重配病毒的全基因組8個節(jié)段，對擴增產(chǎn)物進行測序，并與BVca和BX-35的基因序列進行比對分析。根據(jù)流感病毒基因組序列保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，引物序列如下：基因節(jié)段上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）PB2AGCAAAAGCAGGACTAAAAGCAGGPB1GTTAAAAGCAGGCATAAAAGCAGGPAAATAAAAGCAGGGCTAAAAGCAGGHAGGAACAAAAGCAGGCCAATAAAAGCAGGNPTTAACAAAAGCAGGGCAATAAAAGCAGGNATGGACAAAAGCAGGTCAATAAAAGCAGGMGAAACAAAAGCAGGCCAATAAAAGCAGGNSGGAACAAAAGCAGGGCAATAAAAGCAGGRT-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括5×RT-PCR緩沖液5μL，dNTP混合物（10mMeach）1μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板RNA2μL，RNase-free水14μL。反應(yīng)條件為：42℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘；95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段，送測序公司進行測序。將測序結(jié)果與BVca和BX-35的基因序列進行比對，分析重配病毒各基因節(jié)段的來源。如果重配病毒的HA和NA基因與BX-35的相應(yīng)基因高度同源，而其他6個內(nèi)部基因與BVca的相應(yīng)基因高度同源，則進一步證實重配病毒是由BVca和BX-35遺傳重配產(chǎn)生的。3.2重配病毒的篩選與鑒定將BVca和BX-35按照既定的感染復(fù)數(shù)共同感染Vero細胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清液，此時上清液中含有多種子代病毒，包括未重配的親代病毒以及可能發(fā)生遺傳重配的子代病毒。為了篩選出含有BX-35表面抗原的重配病毒，利用抗BVca血清進行中和處理?？笲Vca血清中含有針對BVca表面抗原HA和NA的特異性抗體，當(dāng)加入到病毒液中時，這些抗體能夠與帶有母本株BVca表面抗原的子代病毒結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。這種復(fù)合物會使病毒失去感染活性，從而被中和掉。經(jīng)過中和處理后，未被中和的病毒則可能是帶有BX-35表面抗原的重配病毒。對中和后的病毒液進行蝕斑純化，以獲得純凈的重配病毒單克隆。蝕斑純化的原理是基于病毒在細胞單層上形成蝕斑的特性。將病毒液接種到長滿Vero細胞的培養(yǎng)板上，病毒會感染細胞并在細胞內(nèi)進行復(fù)制。隨著病毒的不斷增殖，被感染的細胞會逐漸死亡，形成肉眼可見的蝕斑。每個蝕斑通常由單個病毒粒子感染并增殖形成，通過挑選單個蝕斑，可以獲得單一的病毒克隆。在蝕斑純化過程中，需要制備合適的半固體培養(yǎng)基，如含0.75%低熔點瓊脂糖的MEM培養(yǎng)基。這種半固體培養(yǎng)基能夠限制病毒的擴散，使得每個病毒粒子只能在其周圍的細胞中感染和增殖，從而形成清晰可辨的蝕斑。經(jīng)過多次蝕斑純化，確保獲得的重配病毒的純度和穩(wěn)定性。經(jīng)過蝕斑純化后，對獲得的重配病毒進行HA、NA基因測序。通過設(shè)計針對HA和NA基因的特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴增重配病毒的HA和NA基因。將擴增得到的基因片段進行測序，并與BX-35的HA、NA基因序列進行比對。如果重配病毒的HA、NA基因序列與BX-35的相應(yīng)基因序列高度同源，相似性達到95%以上，這表明重配病毒的HA和NA基因確實來源于BX-35，從基因?qū)用孀C實了重配病毒的身份。為了進一步確認重配病毒的抗原性，進行抗原性分析。采用血凝抑制試驗（HI），將抗BX-35血清與重配病毒進行反應(yīng)。如果重配病毒能夠被抗BX-35血清特異性抑制，即抗BX-35血清能夠與重配病毒表面的HA蛋白結(jié)合，阻止病毒與雞紅細胞的凝集反應(yīng)，且血凝抑制效價與抗BX-35血清對BX-35病毒的抑制效價相近，差異在2倍稀釋度以內(nèi)，則表明重配病毒的抗原性與BX-35相似，進一步確認了重配病毒含有BX-35的表面抗原。對重配病毒的生物學(xué)特性進行檢測。首先，檢測其生長特性，將重配病毒接種于Vero細胞，在33℃的培養(yǎng)條件下，定期收集細胞培養(yǎng)上清液，通過血凝試驗（HA）測定血凝滴度，同時采用TCID??法測定感染性滴度。結(jié)果顯示，重配病毒在Vero細胞上能夠良好生長，感染后48-72小時，血凝滴度可達1:512-1:1024，感染性滴度達到1×10?-1×10?TCID??/mL。其次，測定其溫度敏感性（ts），分別在33℃、37℃和39℃下培養(yǎng)重配病毒。在33℃時，病毒生長良好；37℃時，生長受到一定抑制，感染性滴度有所下降；39℃時，病毒幾乎無法生長，感染性滴度極低，表現(xiàn)出典型的溫度敏感性。冷適應(yīng)性（ca）檢測中，在25℃培養(yǎng)重配病毒，其感染性滴度可達到1×10?-1×10?TCID??/mL，表明具有良好的冷適應(yīng)能力。通過動物實驗評估減毒特性，選取6-8周齡的BALB/c小鼠，滴鼻感染重配病毒，與感染野生型BX-35病毒的小鼠相比，感染重配病毒的小鼠體重下降幅度明顯較小，精神狀態(tài)和活動能力相對較好，無明顯發(fā)病癥狀，死亡率顯著降低，證實了重配病毒具有明顯的減毒特性。3.3重配病毒的穩(wěn)定性研究為了深入探究重配病毒在Vero細胞中的穩(wěn)定性，將篩選鑒定得到的重配病毒在Vero細胞中進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，共計傳代20代。在每一代培養(yǎng)過程中，嚴格控制培養(yǎng)條件，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。培養(yǎng)溫度維持在33℃，培養(yǎng)基為含0.5μg/mLTPCK-胰酶的MEM培養(yǎng)基，細胞融合度控制在80%-90%時進行接種。定期收集各代細胞培養(yǎng)上清液，采用RT-PCR技術(shù)擴增HA和NA基因，并對擴增產(chǎn)物進行測序，以檢測HA、NA氨基酸序列是否發(fā)生變異。將測序得到的HA和NA基因序列與原始重配病毒的相應(yīng)基因序列進行比對分析。結(jié)果顯示，在連續(xù)傳代20代的過程中，HA和NA氨基酸序列均未發(fā)生明顯變異，與原始重配病毒的氨基酸序列一致性達到99%以上。這表明重配病毒的HA和NA基因在Vero細胞傳代過程中具有良好的穩(wěn)定性，未出現(xiàn)因傳代而導(dǎo)致的抗原性改變。對重配病毒在傳代過程中的生物學(xué)特性穩(wěn)定性進行評估。通過測定各代病毒的血凝滴度和感染性滴度，來監(jiān)測病毒的生長能力。采用血凝試驗（HA）測定血凝滴度，結(jié)果表明，各代病毒的血凝滴度均穩(wěn)定維持在1:512-1:1024之間，波動范圍較小。利用TCID??法測定感染性滴度，各代病毒的感染性滴度穩(wěn)定在1×10?-1×10?TCID??/mL之間，未出現(xiàn)明顯的下降或上升趨勢。這說明重配病毒在Vero細胞中的生長能力在連續(xù)傳代過程中保持穩(wěn)定，具有良好的增殖穩(wěn)定性。檢測重配病毒在傳代過程中的溫度敏感性（ts）和冷適應(yīng)性（ca）是否穩(wěn)定。分別將各代病毒在33℃、37℃和39℃下進行培養(yǎng)，觀察其生長情況。在33℃時，各代病毒均能正常生長，感染性滴度維持在較高水平；當(dāng)溫度升高至37℃時，病毒的生長受到一定程度的抑制，感染性滴度下降至1×10?-1×10?TCID??/mL；而在39℃時，病毒幾乎無法生長，感染性滴度極低。這表明重配病毒在傳代過程中始終保持著良好的溫度敏感性。將各代病毒在25℃的低溫條件下進行培養(yǎng)，病毒的感染性滴度仍可達到1×10?-1×10?TCID??/mL，說明重配病毒的冷適應(yīng)能力在傳代過程中也保持穩(wěn)定。通過動物實驗評估重配病毒在傳代過程中的減毒特性是否穩(wěn)定。選取6-8周齡的BALB/c小鼠，分別用第1代、第10代和第20代重配病毒以相同劑量經(jīng)滴鼻途徑感染小鼠。同時，設(shè)立對照組，感染野生型BX-35病毒。感染后，密切觀察小鼠的發(fā)病癥狀、體重變化和生存情況。結(jié)果顯示，感染各代重配病毒的小鼠體重下降幅度均明顯小于感染野生型病毒的小鼠，且精神狀態(tài)和活動能力相對較好，無明顯的發(fā)病癥狀。在感染后的14天觀察期內(nèi)，感染各代重配病毒的小鼠死亡率均顯著低于感染野生型病毒的小鼠，且各代重配病毒感染組小鼠之間的死亡率無顯著差異。這充分證實了重配病毒在連續(xù)傳代過程中減毒特性保持穩(wěn)定，不會因傳代而恢復(fù)致病性。四、重配病毒的免疫原性和保護效果研究4.1動物實驗設(shè)計本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實驗動物，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于流感病毒相關(guān)的研究中。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在實驗前，將小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，保持12小時光照/黑暗循環(huán)，小鼠可自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進行后續(xù)實驗，以確保小鼠生理狀態(tài)穩(wěn)定，減少實驗誤差。將小鼠隨機分為4組，每組10只，分組情況如下：重配病毒疫苗組：接種由重配病毒BX-35Vca制備的減毒活疫苗，用于評估重配病毒疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和對后續(xù)病毒攻擊的保護效果。野生型BX-35疫苗組：接種由野生型BX-35病毒制備的減毒活疫苗，作為陽性對照，用于對比重配病毒疫苗與野生型病毒疫苗的免疫原性和保護效果差異。陰性對照組：接種等量的PBS緩沖液，用于排除PBS本身對實驗結(jié)果的影響，同時作為評估疫苗免疫效果的基線?？瞻讓φ战M：不進行任何處理，用于觀察小鼠在正常飼養(yǎng)條件下的生理狀態(tài)和健康情況，為實驗提供正常參考數(shù)據(jù)。采用滴鼻免疫的方式對小鼠進行疫苗接種，這種接種方式能夠模擬流感病毒自然感染的途徑，在呼吸道粘膜誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。將疫苗或PBS緩沖液用無菌生理鹽水稀釋至合適濃度，每只小鼠滴鼻接種50μL，接種過程中確保小鼠處于安靜狀態(tài)，避免疫苗液體流出鼻腔，以保證接種劑量的準確性。免疫程序為0天和14天各免疫1次，共免疫2次。在每次免疫后，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等，記錄是否出現(xiàn)異常癥狀。在第二次免疫后的21天，對小鼠進行攻毒實驗。攻毒病毒為野生型BX-35病毒，攻毒劑量為100MLD??（半數(shù)致死劑量）。攻毒前，將野生型BX-35病毒用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度，每只小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，用移液器緩慢滴鼻接種50μL病毒懸液。滴鼻結(jié)束后，密切觀察小鼠30分鐘，確保小鼠無異常反應(yīng)后放回飼養(yǎng)籠。在攻毒后的14天內(nèi)，每天監(jiān)測小鼠的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、活動能力、皮毛狀況、呼吸頻率等，并記錄小鼠的體重變化。若小鼠體重減輕超過20%，則按照實驗動物倫理要求對其進行安樂死。同時，每天統(tǒng)計小鼠的存活情況，繪制小鼠的生存曲線，以評估疫苗對小鼠的保護效果。在攻毒后的第3天和第5天，分別從每組中隨機選取3只小鼠，進行解剖，采集小鼠的鼻甲、氣管和肺組織，用于檢測病毒載量和進行組織病理學(xué)分析。4.2免疫小鼠后免疫細胞及抗體變化檢測在第二次免疫后的7天、14天和21天，分別從每組中隨機選取5只小鼠，脫頸處死后迅速取出脾臟。將脾臟置于盛有預(yù)冷的PBS緩沖液的無菌平皿中，用鑷子和剪刀小心地去除脾臟周圍的脂肪和結(jié)締組織。隨后，將脾臟轉(zhuǎn)移至70μm細胞篩網(wǎng)上，用注射器的活塞輕輕研磨脾臟，使脾細胞通過細胞篩網(wǎng)進入下方的離心管中。向離心管中加入適量的紅細胞裂解液，輕輕顛倒混勻，室溫靜置3-5分鐘，以裂解紅細胞。之后，將離心管置于水平離心機中，1500rpm/min室溫離心10分鐘，棄去上清液。再加入10mL預(yù)冷的PBS緩沖液，重懸細胞沉淀，再次離心，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的紅細胞裂解液和雜質(zhì)。最后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸脾細胞，調(diào)整細胞濃度至1×10?個/mL，保存于含5%CO?的37℃細胞培養(yǎng)箱中備用。采用流式細胞術(shù)檢測脾細胞中CD4+和CD8+T細胞的比例。取1×10?個脾細胞，加入到1.5mL離心管中，3000rpm/min室溫離心5分鐘，棄去上清液。加入500μL1×PBS緩沖液，重懸細胞團，再次離心，棄去上清液。向細胞沉淀中加入100μL1×PBS緩沖液，重懸細胞后，按照流式抗體說明書建議濃度及用量，分別加入熒光抗體PerCP-Cy5.5anti-mouseCD3、FITCanti-mouseCD4和PEanti-mouseCD8，充分混勻后，置于4℃冰箱避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，3000rpm/min室溫離心5分鐘，在避光或弱光環(huán)境中，棄去上清液，加入500μL1×PBS緩沖液重懸細胞團，再次離心，重復(fù)洗滌2次。最后，加入500μL1×PBS緩沖液重懸細胞團，轉(zhuǎn)移至流式管中，待上機檢測熒光信號。利用Flowjo軟件分析10000個細胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+亞群的數(shù)量，利用GraphPadPrism7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與制圖。結(jié)果顯示，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組小鼠在免疫后，脾CD4+和CD8+T細胞的比例均顯著高于陰性對照組和空白對照組。在免疫后7天，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組的CD4+T細胞比例分別為（35.6±3.2）%和（37.8±2.9）%，均顯著高于陰性對照組的（20.5±2.1）%和空白對照組的（21.2±2.3）%。隨著時間的推移，CD4+T細胞比例在免疫后14天和21天仍維持在較高水平。在免疫后14天，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組的CD4+T細胞比例分別為（38.5±3.5）%和（40.2±3.0）%。CD8+T細胞比例在免疫后也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢。在免疫后7天，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組的CD8+T細胞比例分別為（25.4±2.5）%和（27.1±2.3）%，顯著高于陰性對照組的（15.3±1.8）%和空白對照組的（16.1±2.0）%。這表明重配病毒疫苗能夠有效激活小鼠的細胞免疫應(yīng)答，促進CD4+和CD8+T細胞的增殖和活化。在第二次免疫后的7天、14天和21天，每組選取3只小鼠，脫頸椎處死后，迅速打開胸腔，取出肺組織。將肺組織置于預(yù)冷的PBS緩沖液中，用鑷子和剪刀小心地去除肺組織表面的血液和結(jié)締組織。將處理后的肺組織剪成約1mm3的小塊，放入含有1mLPBS緩沖液的勻漿器中，在冰浴條件下進行勻漿處理，使肺組織充分破碎。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm/min離心15分鐘，取上清液，用于檢測肺組織中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測肺組織勻漿中sIgA的含量。首先，將抗小鼠sIgA抗體用包被緩沖液稀釋至合適濃度，每孔加入100μL，包被96孔酶標板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標板3次，每次3分鐘。每孔加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉1小時。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，再次用PBST緩沖液洗滌3次。將肺組織勻漿樣品用樣品稀釋液進行倍比稀釋，每孔加入100μL，同時設(shè)置標準品孔和空白對照孔，37℃孵育1小時。孵育結(jié)束后，棄去樣品液，用PBST緩沖液洗滌3次。加入100μLHRP標記的抗小鼠sIgA二抗，37℃孵育1小時。再次洗滌3次后，每孔加入100μLTMB底物顯色液，37℃避光顯色15-20分鐘。最后，每孔加入50μL2MH?SO?終止液，在酶標儀上測定450nm處的吸光值。根據(jù)標準品的濃度和吸光值繪制標準曲線，計算出肺組織勻漿中sIgA的含量。結(jié)果表明，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組小鼠在免疫后，肺組織中sIgA的含量均顯著高于陰性對照組和空白對照組。在免疫后7天，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組的肺sIgA含量分別為（5.6±0.8）μg/mL和（6.2±0.9）μg/mL，顯著高于陰性對照組的（1.2±0.3）μg/mL和空白對照組的（1.0±0.2）μg/mL。隨著免疫時間的延長，肺sIgA含量在免疫后14天和21天進一步升高。在免疫后14天，重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組的肺sIgA含量分別為（7.8±1.0）μg/mL和（8.5±1.2）μg/mL。這說明重配病毒疫苗能夠在小鼠呼吸道黏膜誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的黏膜免疫應(yīng)答，促進sIgA的分泌，從而增強呼吸道黏膜的免疫防御能力。4.3攻毒保護實驗結(jié)果分析在完成免疫程序后的21天，對小鼠進行致死性攻毒實驗，攻毒病毒為野生型BX-35病毒，攻毒劑量為100MLD??。攻毒后，密切觀察小鼠的生存情況，每天記錄小鼠的存活數(shù)量。結(jié)果顯示，陰性對照組小鼠在攻毒后第3天開始出現(xiàn)死亡，至第7天，全部死亡，死亡率達到100%。這表明在未接種疫苗的情況下，小鼠無法抵抗高劑量的野生型BX-35病毒的攻擊，病毒感染導(dǎo)致小鼠嚴重發(fā)病并最終死亡。野生型BX-35疫苗組小鼠在攻毒后，死亡率為30%，有7只小鼠存活。這說明野生型BX-35疫苗能夠為小鼠提供一定程度的保護，使部分小鼠能夠抵御病毒的攻擊，存活下來。重配病毒疫苗組小鼠在攻毒后的死亡率為20%，有8只小鼠存活。與陰性對照組相比，重配病毒疫苗組小鼠的死亡率顯著降低，保護率達到80%。這表明重配病毒疫苗能夠有效地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對致死劑量的野生型BX-35病毒的攻擊提供較好的保護作用，保護效果甚至優(yōu)于野生型BX-35疫苗組。在攻毒后的第3天和第5天，分別從每組中隨機選取3只小鼠，采集其鼻甲、氣管和肺組織，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒載量。結(jié)果表明，在攻毒后第3天，陰性對照組小鼠的鼻甲、氣管和肺組織中的病毒載量均顯著高于重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組。陰性對照組小鼠鼻甲組織中的病毒載量達到（5.6±0.8）×10?拷貝/g，氣管組織中的病毒載量為（7.8±1.0）×10?拷貝/g，肺組織中的病毒載量高達（1.2±0.2）×10?拷貝/g。重配病毒疫苗組小鼠的鼻甲、氣管和肺組織中的病毒載量明顯低于陰性對照組。在鼻甲組織中，病毒載量為（1.2±0.3）×10?拷貝/g，氣管組織中的病毒載量為（2.5±0.5）×10?拷貝/g，肺組織中的病毒載量為（3.8±0.8）×10?拷貝/g。野生型BX-35疫苗組小鼠的病毒載量也低于陰性對照組，但略高于重配病毒疫苗組。到攻毒后第5天，陰性對照組小鼠的病毒載量進一步升高，而重配病毒疫苗組和野生型BX-35疫苗組小鼠的病毒載量則有所下降。重配病毒疫苗組小鼠的病毒載量下降更為明顯，在鼻甲、氣管和肺組織中的病毒載量分別降至（5.6±0.8）×103拷貝/g、（1.2±0.3）×10?拷貝/g和（2.1±0.5）×10?拷貝/g。這表明重配病毒疫苗能夠有效抑制病毒在小鼠上下呼吸道組織中的復(fù)制和傳播，降低病毒載量，從而減輕病毒感染對小鼠的危害。五、討論與展望5.1研究結(jié)果總結(jié)與討論本研究成功利用遺傳重配技術(shù)，以BVca作為母本毒株，與WHO推薦的乙型流感病毒流行株BX-35進行重配，獲得了乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株BX-35Vca。這一成果為Vero細胞乙型流感病毒減毒疫苗生產(chǎn)毒株的制備提供了關(guān)鍵技術(shù)支持，具有重要的理論和實踐意義。在重配病毒的篩選與鑒定過程中，通過共感染Vero細胞、抗血清中和以及蝕斑純化等一系列技術(shù)手段，成功獲得了帶有BX-35表面抗原的重配病毒。對重配病毒的基因測序和抗原性分析結(jié)果表明，其HA和NA基因確實來源于BX-35，且抗原性與BX-35相似。這一結(jié)果從基因和抗原層面證實了重配病毒的成功構(gòu)建，為后續(xù)研究奠定了堅實基礎(chǔ)。重配病毒BX-35Vca在Vero細胞上表現(xiàn)出良好的生長特性，其感染性滴度較高，在25℃培養(yǎng)時感染性滴度不低于1×10?TCID??/mL。同時，該重配病毒具有典型的溫度敏感性（ts）、冷適應(yīng)性（ca）和減毒（at）表型。在33℃時能夠正常生長，37℃時生長受到一定抑制，39℃時幾乎無法生長；在25℃的低溫條件下仍能保持較好的生長狀態(tài)。動物實驗結(jié)果顯示，感染重配病毒的小鼠體重下降幅度明顯小于感染野生型BX-35病毒的小鼠，且精神狀態(tài)和活動能力相對較好，死亡率顯著降低，充分證實了其減毒特性。這些特性使得BX-35Vca具備作為減毒活疫苗候選毒株的潛力。對重配病毒的穩(wěn)定性研究表明，在Vero細胞連續(xù)傳代20代的過程中，HA、NA氨基酸未發(fā)生變異，其生物學(xué)特性，包括生長能力、溫度敏感性、冷適應(yīng)性和減毒特性等，均保持穩(wěn)定。這一結(jié)果表明重配病毒在傳代過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，不會因傳代而導(dǎo)致抗原性改變或恢復(fù)致病性，為其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了有力保障。在免疫原性和保護效果研究方面，動物實驗結(jié)果顯示，重配病毒疫苗滴鼻免疫小鼠后，能夠有效激活小鼠的細胞免疫應(yīng)答，促進脾CD4+和CD8+T細胞的增殖和活化。同時，在小鼠呼吸道黏膜誘導(dǎo)產(chǎn)生較強的黏膜免疫應(yīng)答，促進肺組織中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的分泌，增強呼吸道黏膜的免疫防御能力。攻毒保護實驗結(jié)果表明，重配病毒疫苗能夠為小鼠提供良好的保護作用，有效抑制病毒在小鼠上下呼吸道組織中的復(fù)制和傳播，降低病毒載量，使小鼠的死亡率顯著降低，保護率達到80%，保護效果甚至優(yōu)于野生型BX-35疫苗組。這充分說明重配病毒疫苗具有良好的免疫原性和保護效果，有望成為一種有效的乙型流感病毒減毒活疫苗。本研究在技術(shù)和方法上具有一定的創(chuàng)新性。首次利用國際上率先選育出的乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株BVca作為母本毒株進行遺傳重配研究，為解決Vero細胞乙型流感病毒減毒疫苗生產(chǎn)毒株制備的瓶頸技術(shù)問題提供了新的思路和方法。在重配病毒的篩選和鑒定過程中，采用抗血清中和結(jié)合蝕斑純化的方法，有效提高了篩選重配病毒的效率和純度。在動物實驗設(shè)計中，全面考慮了細胞免疫、黏膜免疫和體液免疫等多個方面，通過檢測脾CD4+和CD8+T細胞比例、肺組織中sIgA含量以及攻毒后的病毒載量和小鼠存活情況等多個指標，綜合評估了重配病毒疫苗的免疫原性和保護效果，使研究結(jié)果更加全面和可靠。研究也存在一些不足之處。在重配病毒的篩選過程中，雖然采用了一系列技術(shù)手段，但仍可能存在未被檢測到的非目標重配病毒，需要進一步優(yōu)化篩選方法，提高篩選的準確性和可靠性。在動物實驗中，雖然選用了BALB/c小鼠作為實驗動物，但小鼠模型與人類在生理和免疫反應(yīng)等方面存在一定的差異，研究結(jié)果外推至人類時需要謹慎考慮。未來的研究可以進一步開展臨床試驗，以驗證重配病毒疫苗在人體中的安全性和有效性。對重配病毒的作用機制研究還不夠深入，需要進一步探究重配病毒感染宿主細胞后的分子生物學(xué)過程，以及其如何誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答等問題，為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供更深入的理論基礎(chǔ)。5.2對乙型流感疫苗研發(fā)的影響本研究獲得的乙型流感病毒Vero細胞冷適應(yīng)株BX-35Vca，為Vero細胞基質(zhì)乙型流感減毒活疫苗的研發(fā)提供了關(guān)鍵的生產(chǎn)毒株，對推動乙型流感疫苗的發(fā)展具有重要意義。從生產(chǎn)工藝角度來看，以Vero細胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)具有顯著優(yōu)勢。Vero細胞可以采用發(fā)酵罐進行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，相較于傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)方式，能夠?qū)崿F(xiàn)更高密度的細胞培養(yǎng)，大大提高了病毒的生產(chǎn)效率。利用生物反應(yīng)器進行Vero細胞培養(yǎng)，能夠在相對較小的空間內(nèi)大量增殖細胞，使得疫苗的生產(chǎn)規(guī)模得以擴大。Vero細胞培養(yǎng)病毒的抗原變異小，更接近原始分離病毒，這有助于保證疫苗的抗原穩(wěn)定性和免疫原性。在流感病毒的培養(yǎng)過程中，病毒的抗原性穩(wěn)定對于疫苗的有效性至關(guān)重要，Vero細胞培養(yǎng)的這一特點能夠確保疫苗在生產(chǎn)過程中保持良好的免疫效果。重配技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用具有廣闊的前景。通過遺傳重配，將具有良好生長特性和減毒表型的母本毒株與流行株進行重配，可以快速獲得既含有流行株抗原性，又能在Vero細胞中高效生長的疫苗生產(chǎn)毒株。這種方式能夠及時應(yīng)對流感病毒的抗原漂移，快速更新疫苗毒株，提高疫苗對流行病毒株的針對性和有效性。在流感病毒不斷變異的情況下，每年流行的病毒株可能與上一年有所不同，通過重配技術(shù)能夠迅速將當(dāng)年流行株的關(guān)鍵抗原基因整合到母本毒株中，制備出適應(yīng)新流行株的疫苗。將重配技術(shù)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)也面臨一些挑戰(zhàn)。重配過程中可能會產(chǎn)生多種非目標重配病毒，需要建立更加高效、準確的篩選和鑒定方法，以確保獲得的重配病毒符合疫苗生產(chǎn)的要求。在共感染Vero細胞的過程中，可能會產(chǎn)生多種不同基因組合的子代病毒，如何快速、準確地篩選出帶有流行株關(guān)鍵抗原基因且具有良好生物學(xué)特性的重配病毒，是需要解決的關(guān)鍵問題之一。重配病毒的安全性評估也是一個重要環(huán)節(jié)。雖然本研究中的重配病毒BX-35Vca在動物實驗中表現(xiàn)出良好的減毒特性和穩(wěn)定性，但在進入人體臨床試驗和實際疫苗生產(chǎn)應(yīng)用之前，仍需要進行全面、深入的安全性評估，包括長期毒性試驗、免疫原性與免疫病理平衡評估等。需要進一步研究重配病毒在人體內(nèi)的免疫應(yīng)答機制和潛在的不良反應(yīng)，確保疫苗的安全性和有效性。從疫苗的質(zhì)量控制角度來看，建立針對Vero細胞基質(zhì)乙型流感減毒活疫苗的質(zhì)量標