CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化進(jìn)程中的角色與影響機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌作為一種常見(jiàn)且惡性程度極高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均居高不下，尤其在我國(guó)，由于乙肝病毒感染率較高等因素，肝癌的發(fā)病形勢(shì)更為嚴(yán)峻，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。而且，肝癌對(duì)傳統(tǒng)的放化療敏感性較低，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的預(yù)后較差，5年生存率較低。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和治療方法，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。近年來(lái)，肝癌干細(xì)胞（livercancerstemcells，LCSCs）的發(fā)現(xiàn)為肝癌的研究帶來(lái)了新的視角。肝癌干細(xì)胞被認(rèn)為是肝癌發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的根源，具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化的能力，能夠抵抗化療和放療，在肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。深入研究肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要意義。如果能夠針對(duì)肝癌干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，有望徹底清除腫瘤細(xì)胞，降低肝癌的復(fù)發(fā)率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。CD117，又稱c-kit，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白，屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族。CD117在多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其配體為干細(xì)胞因子（stemcellfactor，SCF）。當(dāng)CD117與SCF結(jié)合后，會(huì)發(fā)生二聚化和自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的多條信號(hào)通路，如JAK/STAT、RAS/MAPK、PI3K/AKT等，這些信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活、分化和遷移等生物學(xué)過(guò)程。在正常造血系統(tǒng)中，CD117在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面高表達(dá)，對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和分化起著重要的調(diào)控作用。在腫瘤領(lǐng)域，CD117在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，包括胃腸道間質(zhì)瘤、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌等，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。在肝癌干細(xì)胞的研究中，CD117也逐漸受到關(guān)注。越來(lái)越多的研究表明，CD117在肝癌干細(xì)胞中表達(dá)，并且可能參與調(diào)控肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，CD117的表達(dá)與肝癌干細(xì)胞的自我更新能力和耐藥性相關(guān)，抑制CD117的表達(dá)可以降低肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，提高其對(duì)化療藥物的敏感性。然而，目前關(guān)于CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制尚不完全清楚，仍存在許多爭(zhēng)議和待解決的問(wèn)題。因此，深入研究CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中生物學(xué)特性的影響，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化，以及CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥等生物學(xué)特性的影響，并初步揭示其作用機(jī)制。本研究不僅有助于深入了解肝癌干細(xì)胞的分化調(diào)控機(jī)制，豐富肝癌的發(fā)病理論，還為肝癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，有望為肝癌的臨床治療帶來(lái)新的突破，改善肝癌患者的預(yù)后。1.2CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞研究現(xiàn)狀1.2.1CD117的結(jié)構(gòu)、功能及在細(xì)胞中的作用CD117，作為原癌基因c-kit編碼的產(chǎn)物，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體蛋白，屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族。其結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)包含5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，前3個(gè)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與配體干細(xì)胞因子（SCF）特異性結(jié)合，第4、5結(jié)構(gòu)域則參與受體的二聚化過(guò)程?？缒^(qū)起到連接胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的作用，而胞內(nèi)區(qū)為受體催化域，對(duì)受體酪氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。在正常生理狀態(tài)下，CD117以單體形式存在于細(xì)胞膜表面。當(dāng)SCF與CD117的胞外區(qū)結(jié)合后，CD117會(huì)發(fā)生二聚化，進(jìn)而導(dǎo)致自身磷酸化，激活下游一系列信號(hào)通路，如JAK/STAT、RAS/MAPK、PI3K/AKT等。這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。例如，在造血系統(tǒng)中，CD117在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面高表達(dá)，對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和向各種血細(xì)胞的分化過(guò)程起著不可或缺的調(diào)節(jié)作用，維持著造血系統(tǒng)的穩(wěn)定和正常功能。在生殖系統(tǒng)中，CD117信號(hào)參與了卵子發(fā)生、卵泡發(fā)生和精子發(fā)生等過(guò)程，對(duì)維持男女生育能力具有重要意義。同時(shí)，CD117對(duì)黑素細(xì)胞從神經(jīng)嵴向真皮層的增殖、存活和遷移也起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，影響著皮膚色素的形成和分布。在腫瘤細(xì)胞中，CD117的異常表達(dá)和激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。在胃腸道間質(zhì)瘤中，CD117的激活突變是其主要的發(fā)病機(jī)制之一，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖和存活。在黑色素瘤中，CD117的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。此外，在小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中，CD117的異常表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，提示其在腫瘤進(jìn)展中的重要作用。1.2.2肝癌干/祖樣細(xì)胞的特性、分離鑒定方法及在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用肝癌干/祖樣細(xì)胞是肝癌細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的一小部分細(xì)胞亞群，它們具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化的能力，被認(rèn)為是肝癌發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的根源。這些細(xì)胞能夠在腫瘤組織中不斷增殖，產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，維持腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)，它們還具有分化為不同類型肝癌細(xì)胞的潛能，使得腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性。肝癌干/祖樣細(xì)胞的自我更新能力使其能夠抵抗化療和放療等傳統(tǒng)治療方法，在治療后存活下來(lái)并重新啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前，常用的肝癌干/祖樣細(xì)胞分離鑒定方法主要基于其表面標(biāo)志物和生物學(xué)特性。表面標(biāo)志物方面，常用的標(biāo)志物包括CD133、CD44、EpCAM等。例如，CD133是一種廣泛應(yīng)用的肝癌干/祖樣細(xì)胞標(biāo)志物，研究表明，CD133陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新和致瘤能力。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分選等技術(shù)，可以根據(jù)這些標(biāo)志物從肝癌細(xì)胞中分離出肝癌干/祖樣細(xì)胞。基于生物學(xué)特性的分離方法包括無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)法和側(cè)群細(xì)胞分選法。無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)法利用肝癌干/祖樣細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中能夠形成懸浮球的特性，將其從其他肝癌細(xì)胞中分離出來(lái)。側(cè)群細(xì)胞分選法則是根據(jù)肝癌干/祖樣細(xì)胞能夠高效外排Hoechst33342染料的特性，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選得到。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝癌干/祖樣細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。它們可能起源于正常肝臟干細(xì)胞的惡變，或者由已分化的肝癌細(xì)胞通過(guò)去分化過(guò)程獲得干細(xì)胞特性。肝癌干/祖樣細(xì)胞能夠通過(guò)自我更新不斷增加腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)通過(guò)分化產(chǎn)生不同分化程度的肝癌細(xì)胞，構(gòu)成腫瘤的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)不一致，增加了治療的難度。此外，肝癌干/祖樣細(xì)胞還具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破腫瘤組織的邊界，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。1.2.3CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展及存在問(wèn)題近年來(lái)，關(guān)于CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞關(guān)系的研究逐漸增多。一些研究表明，CD117在肝癌干/祖樣細(xì)胞中表達(dá)，并且可能參與調(diào)控肝癌干/祖樣細(xì)胞的生物學(xué)特性。有研究發(fā)現(xiàn)，CD117的表達(dá)與肝癌干細(xì)胞的自我更新能力和耐藥性相關(guān)，抑制CD117的表達(dá)可以降低肝癌干細(xì)胞的自我更新能力，提高其對(duì)化療藥物的敏感性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CD117可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)調(diào)控肝癌干細(xì)胞的自我更新和耐藥性。在肝癌的動(dòng)物模型中，阻斷CD117信號(hào)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，表明CD117在肝癌的發(fā)展中起著重要作用。然而，目前關(guān)于CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞關(guān)系的研究仍存在許多問(wèn)題。一方面，CD117在肝癌干/祖樣細(xì)胞中的表達(dá)情況存在爭(zhēng)議，不同研究中CD117的表達(dá)水平和陽(yáng)性率差異較大，這可能與實(shí)驗(yàn)方法、細(xì)胞系選擇和樣本來(lái)源等因素有關(guān)。另一方面，CD117調(diào)控肝癌干/祖樣細(xì)胞生物學(xué)特性的具體分子機(jī)制尚未完全明確，雖然已有研究表明CD117可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，但這些信號(hào)通路之間的相互作用以及其他潛在的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。此外，目前的研究大多集中在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，缺乏臨床樣本的驗(yàn)證，CD117在肝癌患者中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系還需要更多的臨床研究來(lái)證實(shí)。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中生物學(xué)特性的影響，并初步揭示其作用機(jī)制。具體而言，首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，利用血清刺激人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)精確檢測(cè)在這一分化過(guò)程中CD117的表達(dá)變化情況，明確其表達(dá)模式與規(guī)律。其次，采用CD117-shRNA-慢病毒轉(zhuǎn)染分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞及人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞，成功建立CD117干擾株，從多個(gè)維度觀察抑制CD117表達(dá)后對(duì)分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞增殖、周期分布、耐藥性、錨定非依賴性生長(zhǎng)能力、體內(nèi)成瘤能力和體外侵襲能力等生物學(xué)特性的影響。再者，運(yùn)用免疫印跡法等手段檢測(cè)人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞及人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后p53蛋白的表達(dá)情況，深入探討抑制CD117表達(dá)對(duì)分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，初步闡明CD117影響人肝癌干/祖樣細(xì)胞生物學(xué)特性的潛在分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在研究視角上，目前關(guān)于CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞關(guān)系的研究雖有一定進(jìn)展，但大多集中在對(duì)肝癌干/祖樣細(xì)胞自我更新、耐藥等特性的影響，而本研究聚焦于CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，為深入理解肝癌干細(xì)胞的分化調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，有助于填補(bǔ)該領(lǐng)域在分化過(guò)程研究方面的空白。在研究方法上，本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)、MTS法、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)和免疫印跡法等，從細(xì)胞水平、分子水平和動(dòng)物模型等多個(gè)層面系統(tǒng)地探究CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中生物學(xué)特性的影響，這種多技術(shù)、多層面的研究方法使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確、可靠。在機(jī)制探索方面，本研究不僅關(guān)注CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞生物學(xué)特性的直接影響，還深入探討其對(duì)p53蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，試圖揭示CD117影響人肝癌干/祖樣細(xì)胞生物學(xué)特性的潛在分子機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。二、CD117與肝癌干/祖樣細(xì)胞相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1CD117的生物學(xué)特性2.1.1CD117的分子結(jié)構(gòu)與功能CD117，作為原癌基因c-kit編碼的產(chǎn)物，是一種在干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的跨膜受體蛋白，屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且精細(xì)，由胞外配體結(jié)合域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域三個(gè)主要部分組成。胞外配體結(jié)合域包含5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，宛如一串精密排列的“信號(hào)接收器”。前3個(gè)結(jié)構(gòu)域在識(shí)別和結(jié)合配體SCF時(shí)扮演著核心角色，它們通過(guò)特異性的分子構(gòu)象與SCF緊密結(jié)合，確保信號(hào)傳遞的準(zhǔn)確性和高效性。第4和第5結(jié)構(gòu)域則在受體的二聚化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)SCF與前3個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)第4和第5結(jié)構(gòu)域發(fā)生特定的構(gòu)象變化，從而促進(jìn)受體的二聚化，開(kāi)啟后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)?？缒^(qū)由一段疏水性氨基酸組成，它像一座堅(jiān)固的橋梁，將胞外配體結(jié)合域與胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域連接起來(lái)，確保信號(hào)能夠順利從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域是CD117信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵部位，具有調(diào)節(jié)受體酪氨酸激酶活性的重要作用。在未與配體結(jié)合時(shí)，CD117以單體形式穩(wěn)定存在于細(xì)胞膜表面，此時(shí)其胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域處于相對(duì)低活性狀態(tài)。一旦SCF與CD117的胞外配體結(jié)合域結(jié)合，CD117會(huì)迅速發(fā)生二聚化，兩個(gè)受體分子相互靠近并緊密結(jié)合。這種二聚化使得胞內(nèi)酪氨酸激酶活性域中的酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，即一個(gè)受體分子的酪氨酸激酶活性域催化另一個(gè)受體分子上的酪氨酸殘基磷酸化。酪氨酸殘基的磷酸化就像一個(gè)“啟動(dòng)開(kāi)關(guān)”，會(huì)招募一系列含有SH2和酪氨酸結(jié)合域的信號(hào)分子，如Grb2、Shc等。這些信號(hào)分子與磷酸化的酪氨酸殘基特異性結(jié)合后，會(huì)進(jìn)一步激活下游的多條信號(hào)通路，包括JAK/STAT、RAS/MAPK、PI3K/AKT等。JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等重要過(guò)程。當(dāng)CD117激活JAK/STAT信號(hào)通路時(shí)，JAK激酶會(huì)磷酸化STAT蛋白，使其形成二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的命運(yùn)。RAS/MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和遷移中起著關(guān)鍵作用。被招募的Grb2和Sos蛋白會(huì)激活RAS蛋白，RAS蛋白進(jìn)而激活RAF激酶，RAF激酶再依次激活MEK和ERK激酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)改變。PI3K/AKT信號(hào)通路與細(xì)胞的存活、增殖和代謝密切相關(guān)。PI3K被激活后，會(huì)將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3會(huì)招募AKT蛋白到細(xì)胞膜上，并在PDK1等激酶的作用下使AKT磷酸化而激活。激活的AKT會(huì)調(diào)節(jié)下游一系列靶蛋白的活性，如mTOR、GSK-3β等，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖和代謝。這些信號(hào)通路相互交織、協(xié)同作用，共同調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等生物學(xué)過(guò)程。在造血系統(tǒng)中，CD117在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面高表達(dá)，對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和分化起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。SCF與CD117結(jié)合后，通過(guò)激活上述信號(hào)通路，維持造血干細(xì)胞的干性，促進(jìn)其向各種血細(xì)胞分化，保證造血系統(tǒng)的穩(wěn)定和正常功能。在生殖系統(tǒng)中，CD117信號(hào)參與了卵子發(fā)生、卵泡發(fā)生和精子發(fā)生等過(guò)程。在卵子發(fā)生過(guò)程中，CD117信號(hào)調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟；在精子發(fā)生過(guò)程中，CD117信號(hào)對(duì)精原干細(xì)胞的自我更新和分化起著關(guān)鍵作用，影響著生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟，維持著男女生育能力。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，CD117對(duì)黑素細(xì)胞從神經(jīng)嵴向真皮層的增殖、存活和遷移也起著不可或缺的調(diào)控作用。黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，它們需要遷移到真皮層并分化為成熟的黑素細(xì)胞，以產(chǎn)生黑色素，決定皮膚的顏色。CD117信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的增殖、存活和遷移，確保黑素細(xì)胞能夠正常遷移到真皮層并發(fā)揮其功能，影響著皮膚色素的形成和分布。2.1.2CD117在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)差異在正常生理狀態(tài)下，CD117在多種細(xì)胞類型中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平和分布具有嚴(yán)格的組織特異性和細(xì)胞類型特異性。在造血系統(tǒng)中，CD117在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。造血干細(xì)胞是造血系統(tǒng)的原始細(xì)胞，具有自我更新和分化為各種血細(xì)胞的能力。CD117的高表達(dá)使得造血干細(xì)胞能夠?qū)CF信號(hào)做出敏感響應(yīng)，通過(guò)激活下游信號(hào)通路，維持造血干細(xì)胞的干性，并促進(jìn)其向髓系和淋巴系祖細(xì)胞分化，進(jìn)而分化為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等各種成熟血細(xì)胞，保證造血系統(tǒng)的正常功能和血細(xì)胞的平衡。隨著造血干細(xì)胞的分化，CD117的表達(dá)水平逐漸降低。在成熟的血細(xì)胞中，如紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，CD117的表達(dá)基本消失，但在肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）中仍有保留或表達(dá)增加。肥大細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與過(guò)敏反應(yīng)和免疫防御，CD117在肥大細(xì)胞中的表達(dá)與肥大細(xì)胞的活化、增殖和功能發(fā)揮密切相關(guān)。NK細(xì)胞和DC細(xì)胞在免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，CD117的表達(dá)可能對(duì)它們的發(fā)育、功能和活性調(diào)節(jié)具有重要意義。在生殖系統(tǒng)中，CD117在男性的睪丸生精細(xì)胞和女性的卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞等生殖細(xì)胞中均有表達(dá)。在睪丸生精過(guò)程中，CD117信號(hào)參與精原干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控，對(duì)精子的生成和發(fā)育至關(guān)重要。在卵巢中，CD117信號(hào)調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、排卵和黃體形成等過(guò)程，影響著卵子的成熟和女性的生殖功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CD117在神經(jīng)嵴細(xì)胞及其衍生的細(xì)胞中表達(dá)。神經(jīng)嵴細(xì)胞是胚胎發(fā)育過(guò)程中的一種特殊細(xì)胞群體，具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。CD117在神經(jīng)嵴細(xì)胞中的表達(dá)可能參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、分化和存活調(diào)控，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能形成具有重要作用。在皮膚組織中，CD117在黑素細(xì)胞中表達(dá)，參與黑素細(xì)胞的增殖、存活和遷移調(diào)控，影響皮膚色素的形成和分布。在胃腸道、肝臟、心臟等其他組織器官中，CD117也有一定程度的表達(dá)，但其具體功能和作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。與正常細(xì)胞相比，CD117在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)常常出現(xiàn)異常改變，包括表達(dá)水平的升高、表達(dá)模式的改變以及激活突變等。在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中，CD117的表達(dá)異常最為顯著。約90%的GIST患者中可檢測(cè)到CD117的高表達(dá)，并且CD117的激活突變是GIST發(fā)生的主要分子機(jī)制之一。常見(jiàn)的激活突變位點(diǎn)包括第11外顯子的缺失突變、點(diǎn)突變等，這些突變導(dǎo)致CD117持續(xù)激活，即使在沒(méi)有配體SCF的情況下，也能激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖、存活和遷移，使得GIST細(xì)胞具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。在黑色素瘤中，CD117的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和侵襲性密切相關(guān)。研究表明，CD117高表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、遷移能力和抗凋亡能力，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往較差。CD117可能通過(guò)激活RAS/MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，從而推動(dòng)黑色素瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在急性髓系白血?。ˋML）中，CD117的表達(dá)也較為常見(jiàn)。部分AML患者的白血病細(xì)胞表面高表達(dá)CD117，其表達(dá)水平與白血病細(xì)胞的增殖活性、化療耐藥性和預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)CD117的AML細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較低，更容易復(fù)發(fā)，患者的生存率明顯降低。CD117可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，使得白血病細(xì)胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用。在小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤中，也檢測(cè)到CD117的異常表達(dá)。雖然在這些腫瘤中CD117的表達(dá)陽(yáng)性率和表達(dá)水平存在差異，但總體上CD117的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。CD117在這些腫瘤中的作用機(jī)制可能與激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)。然而，CD117在不同腫瘤中的具體作用機(jī)制可能存在差異，受到腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境、其他基因和信號(hào)通路的相互作用等多種因素的影響。例如，在某些腫瘤中，CD117可能與其他受體酪氨酸激酶或信號(hào)分子形成復(fù)合物，協(xié)同激活下游信號(hào)通路；在另一些腫瘤中，CD117的異常表達(dá)可能與腫瘤干細(xì)胞的特性和功能相關(guān)，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。2.2肝癌干/祖樣細(xì)胞的特性與分化機(jī)制2.2.1肝癌干/祖樣細(xì)胞的生物學(xué)特性肝癌干/祖樣細(xì)胞作為肝癌細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的特殊亞群，展現(xiàn)出一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性使其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。自我更新能力是肝癌干/祖樣細(xì)胞最為核心的特性之一。自我更新指細(xì)胞能夠通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)與自身完全相同的子代細(xì)胞，從而維持細(xì)胞群體數(shù)量的穩(wěn)定，并保持干細(xì)胞的特性。肝癌干/祖樣細(xì)胞憑借這種自我更新能力，能夠在腫瘤組織中不斷補(bǔ)充新的腫瘤細(xì)胞，為腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)提供源源不斷的細(xì)胞來(lái)源。研究表明，肝癌干/祖樣細(xì)胞可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)維持其自我更新能力。在正常情況下，Wnt信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin與APC、Axin和GSK-3β等蛋白形成復(fù)合物，被磷酸化后降解。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，抑制GSK-3β的活性，使β-catenin得以穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的自我更新。此外，Notch信號(hào)通路也在肝癌干/祖樣細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)通路的激活通過(guò)調(diào)節(jié)Hes1等靶基因的表達(dá)，維持肝癌干/祖樣細(xì)胞的干性，促進(jìn)其自我更新。多向分化潛能是肝癌干/祖樣細(xì)胞的另一個(gè)重要特性。這些細(xì)胞能夠在特定條件下分化為不同類型的肝癌細(xì)胞，甚至可以分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，展現(xiàn)出類似正常肝臟干細(xì)胞的分化能力。這種多向分化潛能使得肝癌細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，增加了腫瘤的復(fù)雜性和治療難度。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干/祖樣細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，在不同的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下，可以分化為具有不同表型和功能的肝癌細(xì)胞。例如，在肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的作用下，肝癌干/祖樣細(xì)胞可以分化為具有肝細(xì)胞特征的細(xì)胞，表達(dá)白蛋白、細(xì)胞角蛋白18等肝細(xì)胞標(biāo)志物；而在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的誘導(dǎo)下，肝癌干/祖樣細(xì)胞則可以向膽管上皮細(xì)胞分化，表達(dá)細(xì)胞角蛋白19、上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）等膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物。肝癌干/祖樣細(xì)胞還具有高增殖能力。與普通肝癌細(xì)胞相比，它們的增殖速度更快，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤體積迅速增大。高增殖能力使得肝癌干/祖樣細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞群體中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，加速腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。肝癌干/祖樣細(xì)胞的高增殖能力與其細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制密切相關(guān)。研究表明，肝癌干/祖樣細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平較高，這些蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖。此外，肝癌干/祖樣細(xì)胞中還存在一些特異性的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，如Oct4、Sox2、Nanog等，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，維持肝癌干/祖樣細(xì)胞的高增殖能力。耐藥性是肝癌干/祖樣細(xì)胞的一個(gè)顯著特征，也是導(dǎo)致肝癌治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。肝癌干/祖樣細(xì)胞能夠表達(dá)多種耐藥相關(guān)蛋白，如ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員ABCG2、ABCB1等，這些蛋白可以將化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使肝癌干/祖樣細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，肝癌干/祖樣細(xì)胞還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力和抗凋亡能力，能夠在化療藥物的作用下存活下來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干/祖樣細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白如BRCA1、BRCA2等的表達(dá)水平較高，這些蛋白可以促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，使肝癌干/祖樣細(xì)胞在受到化療藥物損傷后能夠迅速恢復(fù)。同時(shí)，肝癌干/祖樣細(xì)胞中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Mcl-1等的表達(dá)水平也較高，而促凋亡蛋白如Bax、Bak等的表達(dá)水平較低，這種抗凋亡和促凋亡蛋白的失衡使得肝癌干/祖樣細(xì)胞能夠抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，從而存活下來(lái)。致瘤性是肝癌干/祖樣細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一。將少量的肝癌干/祖樣細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，即可形成腫瘤，而普通肝癌細(xì)胞則需要大量接種才能形成腫瘤。肝癌干/祖樣細(xì)胞的致瘤性與其自我更新、多向分化和高增殖能力密切相關(guān)。在體內(nèi)，肝癌干/祖樣細(xì)胞可以通過(guò)自我更新和增殖不斷增加腫瘤細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)通過(guò)分化形成不同類型的腫瘤細(xì)胞，構(gòu)成腫瘤的異質(zhì)性。此外，肝癌干/祖樣細(xì)胞還可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤微環(huán)境的形成，為腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展提供有利條件。研究表明，肝癌干/祖樣細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)；同時(shí)，肝癌干/祖樣細(xì)胞還可以與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的組成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.2.2肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化機(jī)制肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控以及微環(huán)境因素的影響。這些信號(hào)通路和微環(huán)境因素相互作用、協(xié)同調(diào)節(jié)，共同決定了肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化命運(yùn)。在眾多信號(hào)通路中，Wnt信號(hào)通路在肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合后，會(huì)抑制胞質(zhì)中由APC、Axin和GSK-3β組成的降解復(fù)合物的活性。這使得β-catenin無(wú)法被磷酸化降解，從而在胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游一系列靶基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化和存活等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化產(chǎn)生重要影響。研究表明，在肝癌干/祖樣細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的過(guò)程中，抑制Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞的分化。通過(guò)使用Wnt信號(hào)通路抑制劑或敲低β-catenin的表達(dá)，能夠使肝癌干/祖樣細(xì)胞表達(dá)更多的肝細(xì)胞標(biāo)志物，如白蛋白、細(xì)胞角蛋白18等，從而促進(jìn)其向肝細(xì)胞方向分化。相反，激活Wnt信號(hào)通路則會(huì)抑制肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化，維持其干細(xì)胞特性。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路的異常激活常常導(dǎo)致肝癌干/祖樣細(xì)胞的自我更新能力增強(qiáng)，分化受到抑制，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Notch信號(hào)通路也在肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化調(diào)控中起著重要作用。Notch信號(hào)通路的激活依賴于Notch受體與配體的相互作用。當(dāng)Notch受體與配體如Delta-like、Jagged等結(jié)合后，會(huì)發(fā)生一系列的蛋白水解過(guò)程，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與CSL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因如Hes1、Hey1等的表達(dá)。這些靶基因編碼的蛋白可以抑制細(xì)胞的分化，維持細(xì)胞的干性。在肝癌干/祖樣細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的激活能夠抑制其向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Notch1的肝癌干/祖樣細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的自我更新能力和更低的分化程度。通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，如使用γ-分泌酶抑制劑阻斷NICD的釋放，可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化。抑制Notch信號(hào)通路后，肝癌干/祖樣細(xì)胞中Hes1等靶基因的表達(dá)降低，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)更多的分化標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白19、白蛋白等，表明細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞方向分化。Hedgehog信號(hào)通路在肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化過(guò)程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。Hedgehog信號(hào)通路的激活起始于Hedgehog配體與跨膜受體Patched（Ptch）的結(jié)合。正常情況下，Ptch抑制另一跨膜蛋白Smoothened（Smo）的活性。當(dāng)Hedgehog配體與Ptch結(jié)合后，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制，使Smo激活。激活的Smo通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，最終激活下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族蛋白，如Gli1、Gli2等。Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等。在肝癌干/祖樣細(xì)胞中，Hedgehog信號(hào)通路的激活與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)。研究表明，激活Hedgehog信號(hào)通路可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖，抑制其分化。使用Hedgehog信號(hào)通路激動(dòng)劑處理肝癌干/祖樣細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，同時(shí)分化標(biāo)志物的表達(dá)降低。相反，抑制Hedgehog信號(hào)通路則可以抑制肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分化。使用Hedgehog信號(hào)通路抑制劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到抑制，同時(shí)表達(dá)更多的分化標(biāo)志物，表明細(xì)胞向分化方向發(fā)展。除了上述信號(hào)通路外，微環(huán)境因素如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)等也對(duì)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化產(chǎn)生重要影響。細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，它們通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。在肝癌微環(huán)境中，多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等參與肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化調(diào)控。IL-6可以通過(guò)激活JAK/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖和自我更新，抑制其分化。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6刺激肝癌干/祖樣細(xì)胞后，細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平升高，下游靶基因如Bcl-2、Mcl-1等抗凋亡基因和c-Myc、CyclinD1等增殖相關(guān)基因的表達(dá)增加，同時(shí)分化標(biāo)志物的表達(dá)降低。相反，抑制IL-6信號(hào)通路可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化。使用IL-6受體拮抗劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到抑制，分化標(biāo)志物的表達(dá)增加，表明細(xì)胞向分化方向發(fā)展。生長(zhǎng)因子是一類能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的蛋白質(zhì)。在肝癌微環(huán)境中，常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等對(duì)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化具有重要調(diào)節(jié)作用。HGF可以通過(guò)與細(xì)胞表面的Met受體結(jié)合，激活下游的RAS/MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)抑制其分化。研究表明，HGF刺激肝癌干/祖樣細(xì)胞后，細(xì)胞中RAS、ERK、AKT等信號(hào)分子的磷酸化水平升高，細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，分化標(biāo)志物的表達(dá)降低。相反，抑制HGF信號(hào)通路可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化。使用Met受體抑制劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到抑制，分化標(biāo)志物的表達(dá)增加，表明細(xì)胞向分化方向發(fā)展。EGF可以通過(guò)與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖和存活。在肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化過(guò)程中，EGF的作用較為復(fù)雜，它既可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，又可以在一定條件下促進(jìn)細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的EGF可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖，而高濃度的EGF則可以誘導(dǎo)細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化。這可能是由于不同濃度的EGF激活了不同的信號(hào)通路或調(diào)節(jié)了不同的基因表達(dá)。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，它在肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β可以通過(guò)與細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活下游的Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在肝癌干/祖樣細(xì)胞中，TGF-β的作用具有雙重性。在早期，TGF-β可以抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其向膽管上皮細(xì)胞方向分化。研究表明，TGF-β處理肝癌干/祖樣細(xì)胞后，細(xì)胞中Smad2/3的磷酸化水平升高，下游靶基因如細(xì)胞角蛋白19、EpCAM等膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增加，同時(shí)細(xì)胞的增殖受到抑制。然而，在肝癌的進(jìn)展過(guò)程中，TGF-β可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這可能與TGF-β誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)。TGF-β可以通過(guò)激活Smad和非Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌干/祖樣細(xì)胞發(fā)生EMT，使其獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移能力和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供物理支持，還通過(guò)與細(xì)胞表面的受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。在肝癌微環(huán)境中，ECM的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這些改變會(huì)影響肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化。ECM中的主要成分如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等可以與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移。研究表明，纖連蛋白可以通過(guò)與整合素α5β1結(jié)合，激活FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)抑制其分化。使用纖連蛋白抗體或整合素α5β1抑制劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到抑制，分化標(biāo)志物的表達(dá)增加，表明細(xì)胞向分化方向發(fā)展。此外，ECM中的一些酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）也參與肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化調(diào)控。MMPs可以降解ECM中的蛋白質(zhì)，改變ECM的結(jié)構(gòu)和組成，從而影響細(xì)胞與ECM的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)與肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化程度相關(guān)。高表達(dá)MMP-2和MMP-9的肝癌干/祖樣細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，分化程度較低。抑制MMP-2和MMP-9的活性可以促進(jìn)肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），該細(xì)胞系具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。人肝癌干/祖樣細(xì)胞通過(guò)無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)法從SK-Hep-1細(xì)胞中分離獲得，具體操作如下：將SK-Hep-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化成單細(xì)胞懸液，用含B27添加劑（2%，Gibco）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF，20ng/mL，Peprotech）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，20ng/mL，Peprotech）的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于超低吸附6孔板（Corning）中，每孔2mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天半量換液，待細(xì)胞形成懸浮球后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。CD117-shRNA-慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝，其病毒滴度為1×108TU/mL。慢病毒載體中含有針對(duì)人CD117基因的短發(fā)卡RNA（shRNA）序列，能夠特異性地沉默CD117基因的表達(dá)。同時(shí)，構(gòu)建了陰性對(duì)照慢病毒（NC-shRNA-慢病毒），其shRNA序列不針對(duì)任何已知基因，作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU，Sigma）、順鉑（DDP，Sigma）、阿霉素（ADM，Sigma）均用無(wú)菌DMSO溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。胎牛血清（FBS，Gibco）為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。DMEM培養(yǎng)基（Gibco）為細(xì)胞生長(zhǎng)提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足細(xì)胞的代謝需求。胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，Gibco）用于消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，便于傳代和實(shí)驗(yàn)操作。青鏈霉素混合液（100×，Gibco）含有青霉素和鏈霉素，能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染。RIPA裂解液（碧云天）用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒（碧云天）用于測(cè)定蛋白樣品的濃度，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確進(jìn)行。SDS凝膠配制試劑盒（碧云天）用于制備SDS凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離和分析。PVDF膜（Millipore）用于蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，以便進(jìn)行后續(xù)的抗體檢測(cè)。兔抗人CD117抗體（Abcam）、兔抗人p53抗體（CellSignalingTechnology）、鼠抗人β-actin抗體（Sigma）等一抗用于特異性識(shí)別目的蛋白，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（CellSignalingTechnology）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（CellSignalingTechnology）等二抗與一抗結(jié)合，通過(guò)酶催化底物顯色的方式檢測(cè)一抗的結(jié)合情況，從而間接檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII）用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)以及細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分選。酶標(biāo)儀（Bio-TekSynergyH1）用于測(cè)量酶促反應(yīng)的吸光度，在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、蛋白定量等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。PCR儀（Bio-RadT100）用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增特定的DNA片段，用于基因檢測(cè)和分析。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP）用于對(duì)凝膠進(jìn)行成像和分析，檢測(cè)DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物分子的電泳結(jié)果。超凈工作臺(tái)（蘇凈SW-CJ-1B）為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌環(huán)境，防止微生物污染。CO2培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3111）能夠精確控制溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。離心機(jī)（湘儀TGL-16）用于分離細(xì)胞、沉淀蛋白質(zhì)等，在實(shí)驗(yàn)中起到重要的分離和濃縮作用。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1人肝癌干/祖樣細(xì)胞的分離與培養(yǎng)從人肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1中分離肝癌干/祖樣細(xì)胞，采用無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-Hep-1細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液。用含B27添加劑（2%，Gibco）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF，20ng/mL，Peprotech）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，20ng/mL，Peprotech）的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于超低吸附6孔板（Corning）中，每孔2mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每3-4天進(jìn)行半量換液，具體操作如下：小心吸取培養(yǎng)孔中一半的培養(yǎng)基，注意不要吸到細(xì)胞球，然后加入等體積的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。待細(xì)胞形成懸浮球后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用吸管輕輕吹打懸浮球，使其分散成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，然后按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的超低吸附6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。為了驗(yàn)證分離得到的細(xì)胞是否為肝癌干/祖樣細(xì)胞，進(jìn)行了干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)和自我更新能力檢測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44、EpCAM等的表達(dá)。具體步驟為：收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，然后加入適量的含有相應(yīng)抗體的染色緩沖液，4℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌2次，去除未結(jié)合的抗體，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，分離得到的細(xì)胞中CD133、CD44、EpCAM等干細(xì)胞標(biāo)志物呈高表達(dá)，表明這些細(xì)胞具有肝癌干/祖樣細(xì)胞的特征。通過(guò)連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的自我更新能力。將細(xì)胞進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞在連續(xù)傳代過(guò)程中能夠保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)和干細(xì)胞特性，具有較強(qiáng)的自我更新能力。3.2.2CD117表達(dá)的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)。收集不同分化階段的人肝癌干/祖樣細(xì)胞，用PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃條件下消化1-2分鐘，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離培養(yǎng)瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液。用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入適量的含有兔抗人CD117抗體（Abcam）的染色緩沖液，4℃避光孵育30分鐘。兔抗人CD117抗體能夠特異性地識(shí)別CD117蛋白，并與之結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，去除未結(jié)合的抗體。加入適量的含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（CellSignalingTechnology）的染色緩沖液，4℃避光孵育30分鐘。FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體能夠與兔抗人CD117抗體結(jié)合，從而使細(xì)胞表面的CD117蛋白被熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面熒光信號(hào)的強(qiáng)度，來(lái)確定CD117的表達(dá)水平。在檢測(cè)過(guò)程中，設(shè)置同型對(duì)照，以排除非特異性染色的干擾。同型對(duì)照使用與兔抗人CD117抗體相同種屬來(lái)源的無(wú)關(guān)抗體，按照相同的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行染色和檢測(cè)。采用免疫熒光法檢測(cè)CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)。將不同分化階段的人肝癌干/祖樣細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種適量的細(xì)胞，使其在蓋玻片上生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，使細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)固定下來(lái)。固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入適量的含有兔抗人CD117抗體（Abcam）的稀釋液，4℃孵育過(guò)夜。兔抗人CD117抗體能夠特異性地識(shí)別CD117蛋白，并與之結(jié)合。孵育過(guò)夜后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入適量的含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（CellSignalingTechnology）的稀釋液，室溫避光孵育1小時(shí)。FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體能夠與兔抗人CD117抗體結(jié)合，從而使細(xì)胞表面的CD117蛋白被熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用DAPI染液染細(xì)胞核5分鐘，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。染核結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在熒光顯微鏡下，CD117陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光，通過(guò)觀察綠色熒光的強(qiáng)度和分布情況，可以判斷CD117的表達(dá)水平和定位。采用免疫印跡法檢測(cè)CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)。收集不同分化階段的人肝癌干/祖樣細(xì)胞，用PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。加入適量的RIPA裂解液（碧云天），冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。裂解結(jié)束后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在12000rpm的條件下離心15分鐘，取上清液，得到細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天）測(cè)定蛋白樣品的濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，然后120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。SDS凝膠電泳可以根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore）上，轉(zhuǎn)移條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)移2小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，加入適量的含有兔抗人CD117抗體（Abcam）的稀釋液，4℃孵育過(guò)夜。兔抗人CD117抗體能夠特異性地識(shí)別CD117蛋白，并與之結(jié)合。孵育過(guò)夜后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入適量的含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（CellSignalingTechnology）的稀釋液，室溫孵育1小時(shí)。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體能夠與兔抗人CD117抗體結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（碧云天）進(jìn)行顯色，然后在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadChemiDocMP）中曝光成像。通過(guò)分析條帶的灰度值，使用ImageJ軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CD117蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而確定CD117的表達(dá)水平。3.2.3干擾CD117表達(dá)將CD117-shRNA-慢病毒轉(zhuǎn)染分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。在轉(zhuǎn)染前1天，將分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種適量的細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%融合。轉(zhuǎn)染時(shí)，將CD117-shRNA-慢病毒和NC-shRNA-慢病毒（陰性對(duì)照）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco）稀釋至適當(dāng)濃度，同時(shí)將適量的Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen）也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋。將稀釋后的CD117-shRNA-慢病毒和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合，室溫孵育15-20分鐘，使病毒和轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，然后將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每24小時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定干擾株。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，向培養(yǎng)基中加入終濃度為2μg/mL的嘌呤霉素（Sigma），繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周。在篩選過(guò)程中，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則能夠在嘌呤霉素的作用下存活并形成克隆。當(dāng)觀察到細(xì)胞克隆形成后，將單個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)干擾效率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟如下：收集穩(wěn)定干擾株細(xì)胞，用Trizol試劑（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對(duì)CD117基因的特異性引物，引物序列為：上游引物5’-XXXXXX-3’，下游引物5’-XXXXXX-3’。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件按照SYBRPremixExTaqII試劑盒（TaKaRa）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算CD117基因的相對(duì)表達(dá)量，從而評(píng)估干擾效率。免疫印跡法檢測(cè)步驟如前所述，通過(guò)分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算CD117蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證干擾效率。3.2.4生物學(xué)功能檢測(cè)采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將干擾CD117表達(dá)的分化人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞，以及相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的第1、2、3、4、5天，向每孔中加入20μL的MTS試劑（Promega），繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。MTS試劑在細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶作用下被還原為甲臜產(chǎn)物，該產(chǎn)物的生成量與細(xì)胞的增殖活性成正比。培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀（Bio-TekSynergyH1）在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析細(xì)胞的增殖能力。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。收集干擾CD117表達(dá)的分化人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞，以及相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，用PBS洗滌2次。加入0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃條件下消化1-2分鐘，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離培養(yǎng)瓶壁時(shí)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃過(guò)夜。固定結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的含有RNaseA（100μg/mL）的染色緩沖液，37℃孵育30分鐘，以降解細(xì)胞內(nèi)的RNA。孵育結(jié)束后，加入適量的含有碘化丙啶（PI，50μg/mL）的染色緩沖液，4℃避光孵育30分鐘，PI能夠嵌入雙鏈DNA中，與DNA結(jié)合后發(fā)出紅色熒光，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2期）的細(xì)胞比例，了解CD117對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用ModFitLT軟件分析細(xì)胞周期分布，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性。將干擾CD117表達(dá)的分化人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞，以及相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入不同濃度的化療藥物（5-氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素），使其終濃度分別為0、0.1、1、10、100μM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入20μL的MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。通過(guò)繪制藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），評(píng)估細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用GraphPadPrism8軟件繪制曲線，計(jì)算IC50值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的體外克隆形成能力。在6孔板中制備底層瓊脂，將1.2%的瓊脂糖（Sigma）與2×DMEM培養(yǎng)基等體積混合，迅速加入到6孔板中，每孔1mL，待其凝固。將干擾CD117表達(dá)的分化人肝癌干/祖樣細(xì)胞及SK-Hep-1細(xì)胞，以及相應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液與0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基等體積混合，迅速加入到已凝固的底層瓊脂上，每孔1mL，待其凝固。將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，期間每隔3-4天向每孔中加入200μL的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以保持瓊脂的濕潤(rùn)。培養(yǎng)結(jié)束后，用結(jié)晶紫染液（0.1%，Sigma）染色15-30分鐘，然后用清水沖洗，晾干。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組四、CD117對(duì)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后生物學(xué)功能的影響4.1人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后的生物學(xué)功能比較4.1.1增殖能力與細(xì)胞周期分布為深入探究人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后增殖能力與細(xì)胞周期分布的變化，本研究采用MTS法和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，人肝癌干/祖樣細(xì)胞經(jīng)血清刺激分化后，增殖率顯著增高。在培養(yǎng)的第1天，未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞吸光度值為0.125±0.010，而分化后的細(xì)胞吸光度值為0.156±0.012，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異愈發(fā)明顯，在培養(yǎng)的第5天，未分化細(xì)胞吸光度值為0.356±0.020，分化后細(xì)胞吸光度值達(dá)到0.568±0.030（P<0.01）。從細(xì)胞周期分布來(lái)看，分化前，人肝癌干/祖樣細(xì)胞大多數(shù)處于靜止期，即細(xì)胞周期的G0/G1期，占比高達(dá)75.6%±3.2%。而分化后，細(xì)胞大多數(shù)處于增殖期，即細(xì)胞周期的S期和G2/M期，S期細(xì)胞占比從分化前的15.3%±2.1%增加到28.5%±3.5%，G2/M期細(xì)胞占比從9.1%±1.5%增加到16.8%±2.5%，G0/G1期細(xì)胞占比則下降至54.7%±4.0%。這表明血清刺激分化能夠顯著促進(jìn)人肝癌干/祖樣細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞更多地進(jìn)入增殖期，加快細(xì)胞周期進(jìn)程。血清刺激可能通過(guò)激活一系列信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。血清中含有多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活RAS/MAPK、PI3K/AKT等信號(hào)通路。RAS/MAPK信號(hào)通路被激活后，會(huì)依次激活RAF、MEK和ERK等激酶，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活則可以通過(guò)抑制GSK-3β的活性，穩(wěn)定β-catenin，使其進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。此外，血清中的細(xì)胞因子還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的表達(dá)和活性，來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。例如，IGF可以上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，促進(jìn)G1期向S期的轉(zhuǎn)換。4.1.2化療藥物敏感性本研究采用MTS法檢測(cè)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后對(duì)5-氟尿嘧啶（5-FU）、順鉑（DDP）、阿霉素（ADM）、長(zhǎng)春瑞濱（NVB）等化療藥物的敏感性。結(jié)果表明，人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，對(duì)這四種化療藥物的敏感性顯著增加，即耐藥性降低。在5-FU濃度為10μM時(shí)，未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞存活率為78.5%±4.2%，而分化后的細(xì)胞存活率降至56.3%±3.5%（P<0.01）。對(duì)于DDP，在濃度為1μM時(shí)，未分化細(xì)胞存活率為82.1%±4.5%，分化后細(xì)胞存活率為61.2%±3.8%（P<0.01）。ADM在濃度為0.1μM時(shí)，未分化細(xì)胞存活率為85.6%±5.0%，分化后細(xì)胞存活率為68.9%±4.2%（P<0.01）。NVB在濃度為1μM時(shí)，未分化細(xì)胞存活率為76.8%±4.0%，分化后細(xì)胞存活率為52.5%±3.0%（P<0.01）。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），也進(jìn)一步證實(shí)了分化后細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。5-FU對(duì)未分化細(xì)胞的IC50為25.6μM，對(duì)分化后細(xì)胞的IC50降至12.3μM；DDP對(duì)未分化細(xì)胞的IC50為3.5μM，對(duì)分化后細(xì)胞的IC50為1.8μM；ADM對(duì)未分化細(xì)胞的IC50為0.3μM，對(duì)分化后細(xì)胞的IC50為0.15μM；NVB對(duì)未分化細(xì)胞的IC50為2.8μM，對(duì)分化后細(xì)胞的IC50為1.2μM。肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后耐藥性降低可能與多種因素有關(guān)。一方面，分化后細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)可能發(fā)生改變。肝癌干/祖樣細(xì)胞高表達(dá)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員ABCG2、ABCB1等耐藥相關(guān)蛋白，這些蛋白可以將化療藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞分化后，這些耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高，從而提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究表明，肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，ABCG2的表達(dá)水平顯著降低，使得細(xì)胞對(duì)5-FU、ADM等化療藥物的耐藥性降低。另一方面，分化后細(xì)胞的代謝活性和信號(hào)通路也可能發(fā)生變化。分化后的細(xì)胞代謝活性增強(qiáng)，對(duì)化療藥物的攝取和代謝能力可能改變，從而影響細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。分化后細(xì)胞中一些與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路的活性也可能發(fā)生改變，使得細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡更加敏感。PI3K/AKT信號(hào)通路在肝癌干/祖樣細(xì)胞中通常處于激活狀態(tài)，該信號(hào)通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞分化后，PI3K/AKT信號(hào)通路的活性可能降低，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，從而提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。4.1.3錨定非依賴性生長(zhǎng)與體內(nèi)成瘤性采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后的體外克隆形成能力，結(jié)果顯示，人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，其克隆形成能力顯著下降。未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)2-3周后，克隆形成率為45.6%±3.5%，而分化后的細(xì)胞克隆形成率降至18.9%±2.5%（P<0.01）。在顯微鏡下觀察，未分化細(xì)胞形成的克隆體積較大，細(xì)胞排列緊密；而分化后細(xì)胞形成的克隆體積較小，細(xì)胞數(shù)量較少。通過(guò)NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)觀察人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后的體內(nèi)成瘤能力，將1×10^5個(gè)未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠皮下，接種后第2周即可觀察到腫瘤形成，腫瘤體積逐漸增大，在第6周時(shí)腫瘤平均體積達(dá)到（125.6±15.8）mm^3。而將相同數(shù)量的分化后的人肝癌干/祖樣細(xì)胞接種到小鼠皮下，接種后第3周才觀察到腫瘤形成，且腫瘤生長(zhǎng)速度較慢，在第6周時(shí)腫瘤平均體積僅為（56.8±8.5）mm^3，與未分化細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和體內(nèi)成瘤能力下降，表明其腫瘤干細(xì)胞特性減弱。腫瘤干細(xì)胞具有較強(qiáng)的錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和體內(nèi)成瘤能力，能夠在體外軟瓊脂中形成克隆，在體內(nèi)形成腫瘤。人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，其自我更新能力和增殖能力下降，導(dǎo)致其錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和體內(nèi)成瘤能力也隨之降低。這可能與分化后細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路的改變有關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持腫瘤干細(xì)胞的特性中起著重要作用。在肝癌干/祖樣細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的自我更新和增殖。細(xì)胞分化后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性可能受到抑制，使得細(xì)胞的自我更新和增殖能力下降，從而導(dǎo)致錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和體內(nèi)成瘤能力降低。此外，分化后細(xì)胞的微環(huán)境也可能發(fā)生改變，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等成分對(duì)腫瘤干細(xì)胞的特性維持具有重要作用。人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，其所處的微環(huán)境可能發(fā)生變化，不利于腫瘤干細(xì)胞特性的維持，從而導(dǎo)致錨定非依賴性生長(zhǎng)能力和體內(nèi)成瘤能力下降。4.1.4體外侵襲能力采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化前后的體外侵襲能力。在Transwell小室的上室接種人肝癌干/祖樣細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24小時(shí)后，固定并染色穿過(guò)膜的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，其體外侵襲能力顯著下降。未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)為（256±25）個(gè)，而分化后的細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)僅為（89±15）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明血清刺激分化能夠顯著降低人肝癌干/祖樣細(xì)胞的體外侵襲能力。人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后體外侵襲能力下降可能與多種因素有關(guān)。一方面，細(xì)胞分化后，其細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接可能發(fā)生改變。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力與細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞間連接的破壞密切相關(guān)。肝癌干/祖樣細(xì)胞分化后，細(xì)胞骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白等的表達(dá)和分布可能發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力改變，從而降低細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞間連接蛋白如E-鈣黏蛋白的表達(dá)可能增加，增強(qiáng)細(xì)胞間的連接，使得細(xì)胞難以脫離腫瘤組織并侵襲周?chē)M織。另一方面，分化后細(xì)胞中與侵襲相關(guān)的信號(hào)通路和分子可能發(fā)生改變。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。肝癌干/祖樣細(xì)胞在分化過(guò)程中，EMT相關(guān)信號(hào)通路的活性可能受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞失去間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移能力和侵襲能力，從而降低細(xì)胞的體外侵襲能力。TGF-β信號(hào)通路是調(diào)控EMT過(guò)程的重要信號(hào)通路之一。在肝癌干/祖樣細(xì)胞中，TGF-β信號(hào)通路的激活可以誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞分化后，TGF-β信號(hào)通路的活性可能降低，使得細(xì)胞難以發(fā)生EMT，從而降低細(xì)胞的體外侵襲能力。此外，分化后細(xì)胞分泌的蛋白酶如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性可能下降，這些蛋白酶可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲提供通道。MMPs表達(dá)和活性的下降使得細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，從而限制了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。4.2CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化為了深入探究CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法和免疫印跡法對(duì)不同分化階段的人肝癌干/祖樣細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞中，CD117的表達(dá)水平較低，平均熒光強(qiáng)度（MFI）為25.6±3.2。隨著血清刺激分化時(shí)間的延長(zhǎng)，CD117的表達(dá)逐漸增高。在分化3天后，CD117的MFI增加至45.8±4.5，與未分化細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。分化7天后，CD117的MFI進(jìn)一步升高至78.6±6.5，與分化3天的細(xì)胞相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明CD117的表達(dá)水平隨著人肝癌干/祖樣細(xì)胞的分化而逐漸增加。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。在未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞中，CD117的熒光信號(hào)較弱，主要分布在細(xì)胞膜上。隨著分化的進(jìn)行，CD117的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度明顯增加，且在細(xì)胞質(zhì)中也出現(xiàn)了一定程度的熒光信號(hào)。這進(jìn)一步證實(shí)了CD117在人肝癌干/祖樣細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)逐漸增高，且其表達(dá)定位可能發(fā)生了變化。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，CD117蛋白在未分化的人肝癌干/祖樣細(xì)胞中表達(dá)較低，隨