丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的抑制效應及機制探究一、引言1.1研究背景口腔鱗狀細胞癌（oralsquamouscellcarcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，在全球范圍內，其發病率呈上升趨勢。據統計，每年約有30萬新發病例，且由于早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，嚴重影響患者的生活質量和生存率。在中國，口腔鱗癌的發病率也不容小覷，且發病年齡逐漸趨于年輕化，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。目前，口腔鱗癌的治療手段主要包括手術切除、放射治療和化學治療。手術切除是早期口腔鱗癌的主要治療方法，通過切除腫瘤組織，可達到根治的目的。然而，手術切除會對患者的口腔功能和面部外觀造成嚴重影響，導致患者術后出現咀嚼、吞咽、語言等功能障礙，嚴重影響患者的生活質量。放射治療利用高能射線殺死癌細胞，可作為手術治療的輔助手段，或用于無法手術切除的患者。但放療會對正常組織造成損傷，引發一系列不良反應，如口腔黏膜損傷、口干、味覺改變等，長期還可能導致放射性骨壞死等嚴重并發癥。化學治療通過使用化療藥物抑制癌細胞的生長和擴散，常用于晚期或轉移性口腔鱗癌的治療。但化療藥物的副作用較大，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等，會嚴重影響患者的身體狀況和治療依從性。此外，由于腫瘤細胞的耐藥性，化療的療效也受到一定限制，復發率較高。隨著對腫瘤發生發展機制研究的深入，開發新的治療藥物和方法成為口腔鱗癌治療領域的研究熱點。尋找一種既能有效抑制腫瘤細胞生長，又能減少對正常組織損傷的治療藥物，具有重要的臨床意義。1.2丙戊酸鈉的研究現狀丙戊酸鈉（SodiumValproate，VPA），化學名稱為2-丙基戊酸鈉，分子式為C8H15NaO2，是一種具有短鏈脂肪酸結構的化合物，其分子中含有一個不對稱碳原子，存在兩種立體異構體。自19世紀末被法國化學家從海藻中提取出來后，在很長一段時間里，其藥用價值未被充分認識。直到后來，才發現它在醫學領域有著廣泛的應用。丙戊酸鈉是臨床上常用的一種廣譜抗癲癇藥物，對多種癲癇發作類型，包括部分性和全身性癲癇都有良好的治療效果，是治療癲癇的首選藥物之一。其抗癲癇作用機制主要是通過增加腦內γ-氨基丁酸（GABA）的濃度，增強抑制性神經傳遞；降低谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放，減少神經元過度興奮；穩定神經細胞膜，減少異常放電，從而有效控制癲癇發作。除了抗癲癇作用外，丙戊酸鈉還具有其他重要的藥理作用。在預防頻繁發作的偏頭痛方面，它能夠減少發作頻率和減輕疼痛程度。在雙相情感障礙的治療中，丙戊酸鈉作為情緒穩定劑，可預防躁狂發作和抑郁發作，通過增加γ-氨基丁酸（GABA）的活性、抑制神經細胞的鈉通道以及調節多種神經遞質（如血清素和去甲腎上腺素）來發揮作用。近年來，隨著對丙戊酸鈉研究的不斷深入，發現其在抑制腫瘤細胞生長方面展現出了一定的潛力。眾多細胞及動物實驗表明，丙戊酸鈉能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，如肝癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞等。其抗腫瘤的作用機制可能與多種因素有關。一方面，丙戊酸鈉作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能夠抑制組蛋白去乙酰化酶活性，誘導組蛋白高乙酰化，調節基因表達，從而發揮抗癌效應。通過這種方式，它可以影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡相關基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長。另一方面，研究發現丙戊酸鈉還可能通過線粒體凋亡通路誘導腫瘤細胞凋亡，以及抑制細胞周期調控相關蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在特定的細胞周期階段，無法進行正常的增殖。盡管丙戊酸鈉在多種腫瘤研究中表現出了抑制腫瘤細胞生長的作用，然而在口腔鱗癌領域，相關研究還較為匱乏。目前針對口腔鱗癌的治療，手術、放療和化療等傳統方法存在諸多局限性，如對患者身體損傷大、副作用嚴重、復發率高等問題。因此，探索丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的影響及其相關機制，有望為口腔鱗癌的治療提供新的思路和方法，具有重要的臨床意義和研究價值。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的影響，并進一步揭示其潛在的作用機制。通過體外細胞實驗，觀察不同濃度丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，明確丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的作用效果。同時，利用分子生物學技術，檢測相關蛋白和基因的表達變化，從分子層面闡述丙戊酸鈉的作用機制，為后續的研究提供理論基礎和實驗依據。目前，口腔鱗癌的治療仍面臨諸多挑戰，傳統治療方法存在局限性，迫切需要尋找新的治療藥物和策略。本研究對丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的研究，在理論上，有助于豐富對口腔鱗癌發病機制及治療靶點的認識，為深入理解腫瘤細胞生長調控機制提供新的視角。從實踐意義來看，若證實丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長具有顯著抑制作用，將為口腔鱗癌的臨床治療提供新的選擇。一方面，丙戊酸鈉作為一種已在臨床廣泛應用的藥物，其安全性和耐受性相對較好，若能開發其在口腔鱗癌治療中的新用途，有望減少患者對傳統化療藥物的依賴，降低治療過程中的不良反應，提高患者的生活質量。另一方面，本研究結果也可能為新型抗癌藥物的研發提供思路和方向，通過對丙戊酸鈉作用機制的深入研究，有助于發現新的藥物作用靶點，為開發更有效、低毒的口腔鱗癌治療藥物奠定基礎，對改善口腔鱗癌患者的預后具有重要的臨床價值。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1細胞株本實驗選用人口腔鱗癌細胞株SCC9，該細胞株購自蒂科生物細胞庫。SCC9細胞呈貼壁上皮細胞樣形態，具有典型的口腔鱗癌細胞特征，在適宜的培養條件下能夠穩定生長和增殖，常用于口腔鱗癌相關的研究，為本實驗提供了可靠的細胞模型。2.1.2實驗試劑丙戊酸鈉：購自Sigma公司，純度≥99%，為白色結晶性粉末。其化學名稱為2-丙基戊酸鈉，分子式為C8H15NaO2，是本實驗的主要研究藥物，用于處理口腔鱗癌細胞，以觀察其對細胞生長的影響。細胞培養基：采用DMEM/F12（1:1）培養基（Gibco公司），該培養基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養成分，能夠為SCC9細胞的生長提供適宜的環境。培養基中添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司），胎牛血清含有豐富的生長因子和營養物質，可促進細胞的貼壁、生長和增殖；同時添加400ng/mL氫化可的松（HAKATA公司），有助于維持細胞的正常生理狀態和功能。胰蛋白酶：0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（Gibco公司），用于消化貼壁生長的SCC9細胞，使細胞從培養瓶壁上脫落下來，便于進行傳代培養和實驗操作。MTT試劑：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，購自Sigma公司。MTT是一種黃顏色的染料，可被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成不溶于水的藍紫色結晶甲瓚，通過檢測甲瓚的生成量，可間接反映活細胞的數量，用于細胞增殖活性的檢測。二甲基亞砜（DMSO）：分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。在MTT實驗中，DMSO用于溶解細胞中的甲瓚結晶，以便于使用酶標儀測定其光吸收值。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒：購自BD公司。該試劑盒用于檢測細胞凋亡，其中AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合；碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅，通過AnnexinV和PI雙染，可區分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和死細胞。RIPA裂解液：購自碧云天生物技術有限公司，用于裂解細胞，提取細胞總蛋白，以便后續進行蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測相關蛋白的表達水平。BCA蛋白定量試劑盒：購自ThermoFisherScientific公司，用于測定細胞裂解液中的蛋白質濃度，確保在進行Westernblot實驗時，上樣蛋白量的一致性。抗體：兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人β-actin抗體（CellSignalingTechnology公司），以及相應的HRP標記的山羊抗兔二抗（JacksonImmunoResearch公司）。這些抗體用于Westernblot實驗中，特異性地識別并結合目的蛋白，通過檢測目的蛋白的表達變化，探究丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響。其中β-actin作為內參蛋白，用于校正目的蛋白的表達水平，以排除上樣量等因素對實驗結果的干擾。2.1.3實驗儀器二氧化碳培養箱（ThermoFisherScientific公司）：型號為3111，提供37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養環境，用于SCC9細胞的培養，維持細胞的正常生長和代謝。倒置顯微鏡（Olympus公司）：型號為CKX41，可在細胞培養過程中實時觀察細胞的形態、生長狀態和貼壁情況，以便及時調整培養條件和進行實驗操作。酶標儀（Bio-Tek公司）：型號為ELx800，用于檢測MTT實驗中各孔的吸光度值，通過測定吸光度值間接反映細胞的增殖活性。流式細胞儀（BD公司）：型號為FACSCalibur，搭配CellQuestPro軟件，用于檢測細胞凋亡和細胞周期分布。通過對細胞進行熒光染色，利用流式細胞儀分析不同熒光信號的強度和比例，從而準確地測定細胞凋亡率和細胞周期各時相的細胞比例。高速冷凍離心機（Eppendorf公司）：型號為5424R，用于細胞離心收集、蛋白樣品制備等操作。可在低溫條件下進行高速離心，有效保持細胞和蛋白質的活性，滿足實驗對樣品處理的要求。蛋白電泳儀（Bio-Rad公司）：型號為Mini-PROTEANTetraCell，搭配相應的凝膠成像系統，用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗中的蛋白質電泳分離。通過電泳將細胞裂解液中的蛋白質按照分子量大小進行分離，以便后續進行抗體雜交和檢測。恒溫搖床（NewBrunswickScientific公司）：型號為Innova44R，用于細胞培養過程中的振蕩培養，使細胞與培養液充分接觸，保證細胞獲取充足的營養物質，同時促進代謝產物的排出，維持細胞的良好生長狀態。2.2實驗方法2.2.1細胞培養與傳代從液氮罐中取出凍存的SCC9細胞株，迅速放入37℃水浴鍋中，使其快速融化。在超凈工作臺內，將融化后的細胞懸液轉移至含有5mL完全培養基（DMEM/F12（1:1）培養基+10%胎牛血清+400ng/mL氫化可的松）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養基重懸細胞，然后將細胞接種于T25培養瓶中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。每2-3天更換一次培養基，當細胞長滿瓶底面積80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，倒掉培養瓶中的培養基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，每次3-5mL，棄去PBS。向培養瓶中加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，輕輕晃動培養瓶，使消化液均勻覆蓋細胞，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當大部分細胞變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶，使細胞完全脫落，然后加入3mL含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之完全脫落并均勻分散，將細胞懸液轉移至15mL離心管中，1200rpm離心3分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養基重懸細胞，按照1:2-1:4的比例將細胞接種到新的培養瓶中，補足培養基至合適體積，搖勻后放回培養箱繼續培養。2.2.2細胞毒性實驗將處于對數生長期的SCC9細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×103個/mL，接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，使細胞均勻分散，邊緣孔用無菌PBS填充以減少邊緣效應。將接種好的細胞放入培養箱，在37℃、5%CO2的條件下培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，吸去原培養基，按照設定的濃度梯度，向各孔中分別加入含不同濃度丙戊酸鈉（0、1、2、4、8、16、32mM）的新鮮培養基，每個濃度設置5個復孔，同時設置只含培養基和細胞的空白對照組。將96孔板放回培養箱繼續培養48小時。培養結束前4小時，每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制，pH=7.4），繼續孵育4小時。孵育結束后，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光值（OD值），記錄結果。根據公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。以丙戊酸鈉濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制細胞生長抑制曲線，分析丙戊酸鈉對SCC9細胞的生長抑制作用。2.2.3細胞凋亡檢測將SCC9細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24小時。待細胞貼壁后，分別加入含0mM（對照組）、4mM、8mM丙戊酸鈉的培養基，繼續培養48小時。培養結束后，收集細胞培養液至離心管中。用不含EDTA的胰蛋白酶消化6孔板中的貼壁細胞，將消化后的細胞與收集的培養液合并，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次1000rpm離心5分鐘，收集細胞沉淀。按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取500μLBindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×106個/mL。向細胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，室溫下避光孵育15分鐘。孵育結束后，加入400μLBindingBuffer，輕輕混勻，將細胞懸液轉移至流式管中，使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡情況。2.2.4Westernblot分析將SCC9細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24小時。待細胞貼壁后，分別加入含0mM（對照組）、4mM、8mM丙戊酸鈉的培養基，繼續培養48小時。培養結束后，棄去培養基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，每次3-5mL。每孔加入150μL預冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕晃動培養板，使細胞充分裂解。將裂解后的細胞懸液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，沸水浴煮5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白Marker條帶分離清晰后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，300mA恒流轉膜1.5小時。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1小時，以減少非特異性結合。封閉結束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中（兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人β-actin抗體，均按1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。然后將PVDF膜放入HRP標記的山羊抗兔二抗稀釋液中（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發光試劑（ECL）對PVDF膜進行顯色，利用凝膠成像系統采集圖像，分析目的蛋白的表達情況，以β-actin作為內參蛋白，校正目的蛋白的表達水平。2.3數據統計與分析采用GraphPadPrism8.0統計軟件對實驗數據進行分析處理。所有實驗均獨立重復至少3次，結果以均數±標準差（x±s）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's檢驗；兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。通過合理運用這些統計方法，確保實驗結果的準確性和可靠性，為深入分析丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的影響及其作用機制提供有力的數據支持。三、實驗結果3.1丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的抑制作用在倒置顯微鏡下觀察不同濃度丙戊酸鈉處理48小時后的SCC9細胞形態變化，結果如圖1所示。對照組細胞呈多邊形，貼壁生長，細胞形態飽滿，伸展良好，胞質豐富，細胞核清晰可見，細胞生長活躍，相互之間緊密連接，呈現出典型的上皮樣細胞形態，在培養皿中均勻分布，形成較為致密的細胞單層。當用1mM丙戊酸鈉處理細胞時，部分細胞形態開始出現改變，細胞邊緣變得不清晰，細胞體積略有縮小，貼壁能力有所下降，但仍有大部分細胞保持正常形態，細胞之間的連接依然較為緊密，細胞密度與對照組相比無明顯差異。隨著丙戊酸鈉濃度增加至2mM，細胞形態變化更為明顯，更多細胞變圓，細胞體積進一步縮小，細胞核出現固縮現象，部分細胞開始脫離培養皿底部，漂浮在培養液中，細胞密度明顯降低，細胞之間的連接變得松散。當丙戊酸鈉濃度達到4mM時，大部分細胞已變圓，細胞核固縮更為顯著，細胞大量脫壁，懸浮于培養液中，細胞密度大幅下降，僅可見少量細胞仍貼壁生長，且這些貼壁細胞的形態也明顯異常。當濃度升高到8mM和16mM時，幾乎所有細胞均變圓脫壁，細胞形態嚴重受損，僅能觀察到極少量細胞碎片，幾乎看不到完整的細胞結構。由此可見，隨著丙戊酸鈉濃度的增加，SCC9細胞的形態改變逐漸加劇，細胞生長受到明顯抑制。[此處插入不同濃度丙戊酸鈉處理下SCC9細胞形態變化的圖片，圖片清晰展示對照組和各實驗組細胞形態差異，從左至右依次為對照組、1mM、2mM、4mM、8mM、16mM丙戊酸鈉處理組，圖片下方標注對應濃度及放大倍數]通過MTT實驗檢測不同濃度丙戊酸鈉對SCC9細胞活力的影響，結果以細胞存活率表示，如圖2所示。經統計學分析，不同濃度丙戊酸鈉處理組與對照組相比，細胞存活率差異均具有統計學意義（P<0.01）。對照組細胞存活率設定為100%，隨著丙戊酸鈉濃度的逐漸升高，細胞存活率呈明顯下降趨勢。當丙戊酸鈉濃度為1mM時，細胞存活率降至（85.63±3.25）%，表明低濃度的丙戊酸鈉已對細胞活力產生一定的抑制作用，但抑制效果相對較弱。當濃度增加到2mM時，細胞存活率進一步降低至（68.45±4.12）%，抑制作用較為明顯。濃度為4mM時，細胞存活率降至（45.37±3.86）%，此時丙戊酸鈉對細胞生長的抑制作用顯著增強。當濃度達到8mM時，細胞存活率僅為（21.74±2.58）%，細胞生長受到強烈抑制。當丙戊酸鈉濃度為16mM時，細胞存活率降至（5.62±1.03）%，幾乎所有細胞的生長都被抑制。以丙戊酸鈉濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長抑制曲線，可直觀地看出細胞生長抑制作用與丙戊酸鈉濃度呈正相關，即丙戊酸鈉濃度越高，對口腔鱗癌細胞SCC9的生長抑制作用越強。[此處插入MTT實驗檢測細胞存活率的柱狀圖，橫坐標為丙戊酸鈉濃度（mM），縱坐標為細胞存活率（%），每個濃度設置5個復孔，實驗重復3次，數據以均數±標準差表示，不同濃度組與對照組之間用不同字母標注差異顯著性，P<0.01]3.2丙戊酸鈉誘導口腔鱗癌細胞凋亡采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測不同濃度丙戊酸鈉處理48小時后SCC9細胞的凋亡情況，結果如圖3所示。在對照組中，細胞凋亡率較低，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例之和僅為（3.26±0.45）%，細胞形態較為規則，細胞膜完整，AnnexinV和PI雙染后，大部分細胞位于左下象限，即正常活細胞區域。當用4mM丙戊酸鈉處理細胞時，細胞凋亡率明顯升高，達到（18.45±2.13）%，其中早期凋亡細胞比例增加，晚期凋亡細胞也有所增多，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），此時細胞出現凋亡早期特征，如細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，AnnexinV與之結合而呈現熒光信號，部分細胞進入右上象限（晚期凋亡細胞區域）和右下象限（早期凋亡細胞區域）。當丙戊酸鈉濃度增加到8mM時，細胞凋亡率進一步升高至（35.68±3.02）%，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均顯著增加，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01），大量細胞呈現凋亡形態，如細胞核固縮、染色質凝集等，更多細胞進入凋亡區域，表明高濃度的丙戊酸鈉能更有效地誘導口腔鱗癌細胞凋亡。[此處插入流式細胞儀檢測細胞凋亡的散點圖，從左至右依次為對照組、4mM、8mM丙戊酸鈉處理組，每個散點圖下方標注對應濃度及凋亡率，散點圖中左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，左上象限為壞死細胞]為進一步探究丙戊酸鈉誘導口腔鱗癌細胞凋亡的分子機制，采用Westernblot方法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達變化，結果如圖4所示。以β-actin作為內參蛋白，校正目的蛋白的表達水平。與對照組相比，隨著丙戊酸鈉濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低。在對照組中，Bcl-2蛋白表達量較高，灰度值分析顯示其相對表達量為1.00±0.08。當用4mM丙戊酸鈉處理細胞時，Bcl-2蛋白表達量下降，相對表達量降至0.62±0.06，差異具有統計學意義（P<0.01）。當丙戊酸鈉濃度升高到8mM時，Bcl-2蛋白表達量進一步降低，相對表達量僅為0.35±0.04，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）。而促凋亡蛋白Bax的表達水平則隨著丙戊酸鈉濃度的增加而顯著升高。在對照組中，Bax蛋白相對表達量為0.25±0.03。4mM丙戊酸鈉處理后，Bax蛋白表達量明顯增加，相對表達量上升至0.58±0.05，差異具有統計學意義（P<0.01）。8mM丙戊酸鈉處理時，Bax蛋白相對表達量進一步升高至0.86±0.07，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）。同時，Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行蛋白，其活化形式Cleaved-Caspase-3的表達水平也隨著丙戊酸鈉濃度的增加而顯著升高。在對照組中，Cleaved-Caspase-3蛋白表達量極低，幾乎檢測不到，相對表達量為0.05±0.01。4mM丙戊酸鈉處理后，Cleaved-Caspase-3蛋白開始表達，相對表達量為0.23±0.03，差異具有統計學意義（P<0.01）。8mM丙戊酸鈉處理時，Cleaved-Caspase-3蛋白表達量顯著增加，相對表達量達到0.56±0.06，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）。以上結果表明，丙戊酸鈉能夠通過調節凋亡相關蛋白的表達，誘導口腔鱗癌細胞凋亡。[此處插入Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達的條帶圖，從左至右依次為對照組、4mM、8mM丙戊酸鈉處理組，條帶圖下方標注對應蛋白名稱及濃度，右側為蛋白條帶灰度值分析的柱狀圖，橫坐標為丙戊酸鈉濃度（mM），縱坐標為蛋白相對表達量，實驗重復3次，數據以均數±標準差表示，不同濃度組與對照組之間用不同字母標注差異顯著性，P<0.01]3.3丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞周期調控蛋白表達的影響為進一步探討丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的作用機制，采用Westernblot技術檢測細胞周期調控相關蛋白CyclinD1和CDK4的表達變化。結果如圖5所示，以β-actin作為內參蛋白，校正目的蛋白的表達水平。在對照組中，CyclinD1和CDK4蛋白均有較高水平的表達，灰度值分析顯示CyclinD1相對表達量為1.00±0.07，CDK4相對表達量為1.05±0.08，這表明在正常培養條件下，SCC9細胞中細胞周期調控蛋白維持在一定水平，保證細胞能夠正常進行增殖。當用4mM丙戊酸鈉處理細胞時，CyclinD1蛋白表達量顯著下降，相對表達量降至0.65±0.06，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）；CDK4蛋白表達量也明顯降低，相對表達量降至0.70±0.07，差異具有統計學意義（P<0.01），這說明較低濃度的丙戊酸鈉已經能夠對細胞周期調控蛋白的表達產生抑制作用。當丙戊酸鈉濃度增加到8mM時，CyclinD1蛋白表達量進一步下降，相對表達量僅為0.32±0.04，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）；CDK4蛋白表達量也進一步降低至0.40±0.05，與對照組和4mM處理組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01），表明隨著丙戊酸鈉濃度的升高，對細胞周期調控蛋白表達的抑制作用逐漸增強。[此處插入Westernblot檢測細胞周期調控相關蛋白表達的條帶圖，從左至右依次為對照組、4mM、8mM丙戊酸鈉處理組，條帶圖下方標注對應蛋白名稱及濃度，右側為蛋白條帶灰度值分析的柱狀圖，橫坐標為丙戊酸鈉濃度（mM），縱坐標為蛋白相對表達量，實驗重復3次，數據以均數±標準差表示，不同濃度組與對照組之間用不同字母標注差異顯著性，P<0.01]CyclinD1和CDK4是細胞周期G1期向S期轉變過程中的關鍵調控蛋白。CyclinD1與CDK4結合形成復合物，激活CDK4的激酶活性，進而使視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉錄因子E2F，促進細胞從G1期進入S期，啟動DNA復制，推動細胞周期進程。本實驗結果表明，丙戊酸鈉能夠抑制口腔鱗癌細胞中CyclinD1和CDK4蛋白的表達，從而阻斷細胞周期G1期向S期的轉變，使細胞停滯在G1期，抑制細胞的增殖。這進一步解釋了丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的作用機制，為丙戊酸鈉在口腔鱗癌治療中的應用提供了更深入的理論依據。四、討論4.1丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的機制探討本研究結果顯示，丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞SCC9的生長具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性。隨著丙戊酸鈉濃度的升高，細胞存活率逐漸降低，細胞形態發生明顯改變，從正常的多邊形貼壁生長逐漸變為圓縮、脫壁，這表明丙戊酸鈉能夠有效抑制口腔鱗癌細胞的增殖，影響細胞的正常形態和生長狀態。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，在維持機體正常生理平衡和腫瘤發生發展過程中起著至關重要的作用。正常情況下，細胞凋亡受到一系列凋亡相關蛋白的精細調控，以確保細胞有序死亡。當細胞受到內部或外部凋亡信號刺激時，凋亡相關蛋白的表達和活性會發生改變，從而啟動細胞凋亡程序。在腫瘤細胞中，凋亡機制常常受到抑制，導致腫瘤細胞異常增殖和存活。而誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的重要策略之一，通過激活凋亡信號通路，促使腫瘤細胞進入凋亡程序，可有效抑制腫瘤的生長和擴散。本實驗中，丙戊酸鈉能夠顯著誘導口腔鱗癌細胞凋亡。流式細胞術檢測結果表明，隨著丙戊酸鈉濃度的增加，細胞凋亡率明顯上升。進一步的Westernblot分析顯示，丙戊酸鈉可調節凋亡相關蛋白的表達。抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平在丙戊酸鈉處理后顯著降低，而促凋亡蛋白Bax和凋亡執行蛋白Cleaved-Caspase-3的表達水平則顯著升高。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著核心作用，Bcl-2主要定位于線粒體膜、內質網和核膜等膜結構上，其功能是抑制細胞凋亡。它通過與促凋亡蛋白形成異二聚體，阻止促凋亡蛋白激活下游凋亡信號，從而維持細胞的存活。Bax則是一種促凋亡蛋白，通常以單體形式存在于細胞質中。當細胞受到凋亡刺激時，Bax會發生構象改變，從細胞質轉移到線粒體膜上，在線粒體膜上形成多聚體，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，進而激活Caspase級聯反應，引發細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行蛋白，通常以無活性的酶原形式存在于細胞中。當細胞接收到凋亡信號后，上游激活型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）會被激活，進而切割并激活Caspase-3。激活后的Cleaved-Caspase-3能夠作用于多種細胞內底物，如細胞骨架蛋白、DNA修復酶等，導致細胞形態改變、DNA斷裂等凋亡特征的出現，最終促使細胞凋亡。在本研究中，丙戊酸鈉處理后，Bcl-2表達下降，解除了對Bax的抑制作用，使得Bax能夠在線粒體膜上聚集，促進線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C，激活Caspase-3，從而誘導口腔鱗癌細胞凋亡。這一結果表明，丙戊酸鈉誘導口腔鱗癌細胞凋亡可能是其抑制細胞生長的重要機制之一。細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。細胞周期的正常調控對于細胞的增殖、分化和發育至關重要。在細胞周期的各個階段，存在著一系列的調控機制，以確保細胞周期的有序進行。其中，細胞周期蛋白（Cyclins）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是細胞周期調控的關鍵分子。Cyclins在細胞周期的不同階段呈現周期性表達，它們與相應的CDKs結合形成復合物，激活CDK的激酶活性，從而推動細胞周期的進程。CyclinD1和CDK4是細胞周期G1期向S期轉變過程中的重要調控蛋白。在G1期，CyclinD1與CDK4結合形成復合物，激活CDK4的激酶活性，使視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）磷酸化。磷酸化的Rb蛋白釋放與它結合的轉錄因子E2F，E2F進入細胞核，啟動一系列與DNA合成相關基因的轉錄，促使細胞從G1期進入S期，開始DNA復制，進而推動細胞周期的進行。如果細胞周期調控異常，如CyclinD1和CDK4表達失調，細胞可能會出現異常增殖，這在腫瘤的發生發展中起著重要作用。本研究發現，丙戊酸鈉能夠抑制口腔鱗癌細胞中CyclinD1和CDK4蛋白的表達。隨著丙戊酸鈉濃度的增加，CyclinD1和CDK4蛋白的表達水平顯著下降。這表明丙戊酸鈉可能通過抑制CyclinD1和CDK4的表達，阻斷細胞周期G1期向S期的轉變，使細胞停滯在G1期，從而抑制口腔鱗癌細胞的增殖。當CyclinD1和CDK4表達受到抑制時，CyclinD1-CDK4復合物的形成減少，CDK4激酶活性降低，Rb蛋白磷酸化水平下降，無法有效釋放E2F，導致DNA合成相關基因的轉錄受阻，細胞無法進入S期，進而抑制了細胞的增殖。這進一步揭示了丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的作用機制，即通過干擾細胞周期調控，使細胞無法正常進行增殖。綜上所述，丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞生長的抑制作用可能是通過誘導細胞凋亡和抑制細胞周期調控蛋白表達來實現的。丙戊酸鈉通過調節Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡相關蛋白的表達，激活線粒體凋亡通路，促使口腔鱗癌細胞凋亡；同時，抑制CyclinD1和CDK4蛋白的表達，阻斷細胞周期G1期向S期的轉變，抑制細胞增殖。這些結果為深入理解丙戊酸鈉抑制口腔鱗癌細胞生長的機制提供了重要依據，也為口腔鱗癌的治療提供了新的潛在靶點和治療思路。4.2與其他抗癌藥物的比較與優勢分析目前，臨床上用于口腔鱗癌治療的藥物種類繁多，常見的化療藥物如順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇等，在口腔鱗癌的治療中發揮著重要作用，但同時也存在諸多局限性。順鉑是一種廣泛應用于多種惡性腫瘤治療的金屬鉑類化合物，其作用機制主要是通過與DNA結合，形成DNA-鉑加合物，干擾DNA的復制和轉錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。在口腔鱗癌治療中，順鉑常與其他藥物聯合使用，可取得一定的治療效果。然而，順鉑的副作用較為嚴重，常見的不良反應包括惡心、嘔吐、腎毒性、耳毒性等。其中，惡心、嘔吐的發生率較高，可達70%-80%，嚴重影響患者的營養攝入和生活質量。腎毒性可導致腎功能損害，表現為血肌酐升高、尿素氮增加等，長期使用還可能引發不可逆的腎功能衰竭。耳毒性則可導致聽力下降、耳鳴等，甚至永久性聽力喪失。此外，腫瘤細胞對順鉑容易產生耐藥性，隨著治療時間的延長和使用次數的增加，腫瘤細胞對順鉑的敏感性逐漸降低，導致治療效果下降。氟尿嘧啶是一種嘧啶類抗代謝藥物，它能夠在細胞內轉化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性，從而阻止DNA的合成，抑制腫瘤細胞的增殖。在口腔鱗癌治療中，氟尿嘧啶也有一定的應用。但其副作用同樣不容忽視，常見的有胃腸道反應，如腹瀉、腹痛、口腔黏膜炎等。腹瀉嚴重時可導致脫水、電解質紊亂，影響患者的身體健康。口腔黏膜炎可引起口腔疼痛、潰瘍，影響患者的進食和口腔衛生。此外，氟尿嘧啶還可能導致骨髓抑制，使白細胞、血小板等血細胞減少，增加患者感染和出血的風險。紫杉醇是一種從紅豆杉屬植物中提取的天然抗癌藥物，它能夠促進微管蛋白聚合，抑制微管解聚，從而穩定微管結構，使細胞周期停滯在G2/M期，抑制腫瘤細胞的分裂和增殖。在口腔鱗癌治療中，紫杉醇也常被使用。然而，紫杉醇的使用需要注意過敏反應，由于其制劑中含有聚氧乙烯蓖麻油，部分患者在用藥后可能出現過敏癥狀，如皮疹、瘙癢、呼吸困難、低血壓等，嚴重時可危及生命。為預防過敏反應，患者在使用紫杉醇前通常需要進行預處理，如使用地塞米松、苯海拉明等藥物。此外，紫杉醇還可能引起神經毒性，表現為手腳麻木、刺痛、感覺異常等，影響患者的生活質量。與這些傳統抗癌藥物相比，丙戊酸鈉具有一些獨特的優勢。從作用機制來看，丙戊酸鈉作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，通過調節基因表達、誘導細胞凋亡和抑制細胞周期調控蛋白表達等多種途徑發揮抗癌作用，與傳統化療藥物的作用機制不同，這為口腔鱗癌的治療提供了新的作用靶點和治療思路。在副作用方面，丙戊酸鈉作為一種已在臨床長期應用于抗癲癇治療的藥物，其安全性和耐受性相對較好。臨床研究表明，丙戊酸鈉的常見不良反應主要包括胃腸道不適，如惡心、嘔吐、食欲不振等，但這些癥狀通常較輕，且多為一過性，患者較易耐受。相比之下，傳統化療藥物的副作用如順鉑的腎毒性、耳毒性，氟尿嘧啶的骨髓抑制，紫杉醇的過敏反應和神經毒性等，對患者的身體造成的損害更為嚴重，且可能影響患者的后續治療和生活質量。此外，由于丙戊酸鈉的作用機制與傳統化療藥物不同，理論上其與傳統化療藥物聯合使用時，可能具有協同增效作用，同時減少單一藥物的使用劑量，從而降低藥物的副作用。例如，在一些腫瘤研究中，丙戊酸鈉與順鉑聯合使用，能夠增強順鉑對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減輕順鉑的腎毒性和耳毒性。這為口腔鱗癌的聯合治療提供了新的策略，有望提高治療效果，改善患者的預后。綜上所述，丙戊酸鈉在抑制口腔鱗癌細胞生長方面展現出了獨特的作用機制和相對較好的安全性，與傳統抗癌藥物相比具有一定的優勢。盡管目前關于丙戊酸鈉在口腔鱗癌治療中的研究還處于初步階段，但這些優勢使其具有潛在的應用價值，為口腔鱗癌的治療提供了新的選擇和研究方向。未來需要進一步開展深入的研究，包括臨床前動物實驗和臨床試驗，以充分評估丙戊酸鈉在口腔鱗癌治療中的療效、安全性和最佳使用方案，為其臨床應用提供更堅實的理論基礎和實踐依據。4.3研究的局限性與展望本研究雖取得了一定成果，但仍存在局限性。在信號通路研究方面，僅聚焦于凋亡相關和細胞周期調控相關蛋白，未深入探究丙戊酸鈉對其他信號通路的影響。事實上，腫瘤細胞的生長調控是一個極為復雜的過程，涉及多條信號通路的相互作用。如PI3K/Akt信號通路，在細胞增殖、存活、代謝等過程中發揮關鍵作用，在口腔鱗癌中常處于異常激活狀態，促進腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲。丙戊酸鈉可能通過影響該信號通路來抑制口腔鱗癌細胞生長，但本研究并未對此展開探討。此外，Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育和腫瘤發生中也起著重要作用，異常激活時會導致細胞增殖失控和腫瘤形成，丙戊酸鈉是否通過調控該信號通路影響口腔鱗癌發展，也有待進一步研究。未來研究可利用蛋白質組學、基因芯片等技術，全面篩選丙戊酸鈉作用下口腔鱗癌細胞中差異表達的基因和蛋白，構建信號通路網絡，深入剖析其作用機制。在動物實驗方面，本研究僅進行了體外細胞實驗，未開展動物體內實驗。體外細胞實驗雖能直觀觀察丙戊酸鈉對口腔鱗癌細胞的作用，但細胞在體外培養環境與體內環境存在差異。動物體內存在完整的免疫系統、血液循環系統以及復雜的組織微環境，這些因素會影響藥物的代謝、分布和作用效果。例如，藥物在體內可能會被肝臟代謝，通過血液循環輸送到腫瘤組織的藥量和速度與體外實驗不同，且免疫系統可能會與藥物及腫瘤細胞相互作用，影響治療效果。因此，后續需建立口腔鱗癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，觀察丙戊酸鈉在體內對腫瘤生長的抑制作用，檢測藥物在體內的代謝過程、組織分布以及對機體其他器官的影響，為臨床應用提供更可靠的依據。臨床研究也是本研究的欠缺之處。目前的