RRM2表達(dá)與上皮性卵巢癌血管生成的關(guān)聯(lián)研究：機(jī)制、影響及治療展望一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。上皮性卵巢癌（EpithelialOvarianCancer,EOC）又是卵巢癌中最常見(jiàn)的類型，約占所有卵巢癌病例的90%以上。近年來(lái)，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且由于起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，治療手段有限，導(dǎo)致病死率居高不下，五年生存率不足30%。盡管現(xiàn)有的手術(shù)切除聯(lián)合化療等治療方案在一定程度上能控制腫瘤進(jìn)展，但許多患者會(huì)出現(xiàn)化療耐藥等問(wèn)題，使得治療效果大打折扣，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。因此，深入探究上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，成為當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。RRM2（RibonucleotideReductaseM2），即核糖核苷酸還原酶M2亞基，是核苷酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在DNA合成和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。已有研究表明，RRM2在多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等中表達(dá)異常，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。然而，RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況及其與血管生成的關(guān)系，尚未得到系統(tǒng)且深入的研究。血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵生物學(xué)事件。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，而新生血管能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。大量研究證實(shí)，血管生成與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移性以及預(yù)后緊密相關(guān)。抑制血管生成已成為抗腫瘤治療的重要策略之一，如貝伐單抗等抗血管生成藥物在多種腫瘤治療中已取得一定療效。但目前對(duì)于上皮性卵巢癌中血管生成的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，尤其是RRM2在其中可能扮演的角色，仍有待進(jìn)一步探索。鑒于上皮性卵巢癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀以及RRM2和血管生成在上皮性卵巢癌研究中的重要性和空白點(diǎn)，深入研究RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系，具有重要的理論和實(shí)際意義。這不僅有助于揭示上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為其診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略，為改善患者的生存質(zhì)量和提高生存率帶來(lái)新的希望。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究RRM2在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，全面分析其表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，包括腫瘤的分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，為上皮性卵巢癌的診斷和病情評(píng)估提供新的潛在指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步剖析RRM2表達(dá)與血管生成相關(guān)指標(biāo)（如微血管密度、血管生成因子表達(dá)等）之間的內(nèi)在聯(lián)系，揭示RRM2在調(diào)控上皮性卵巢癌血管生成過(guò)程中可能的作用機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面研究的空白，為從血管生成角度理解上皮性卵巢癌的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。本研究還將通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討干預(yù)RRM2表達(dá)對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及血管生成能力的影響，明確RRM2在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的關(guān)鍵作用，為將RRM2作為潛在治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。深入研究RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系，對(duì)于揭示上皮性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論意義。通過(guò)明確RRM2在其中的作用，有助于我們從分子層面深入理解腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過(guò)程，為進(jìn)一步完善上皮性卵巢癌的發(fā)病理論體系提供關(guān)鍵線索。對(duì)臨床實(shí)踐而言，本研究成果具有重要的應(yīng)用價(jià)值。若能證實(shí)RRM2與上皮性卵巢癌的血管生成密切相關(guān)，那么RRM2有望成為上皮性卵巢癌診斷、預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)RRM2的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷病情，制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果。此外，RRM2還可能為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)新型靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)，為改善患者的生存質(zhì)量和提高生存率帶來(lái)新的希望，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1上皮性卵巢癌概述上皮性卵巢癌（EpithelialOvarianCancer,EOC）作為卵巢癌中最為常見(jiàn)的類型，約占所有卵巢癌病例的70%-90%，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位居前列，且近年來(lái)呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。從病理類型來(lái)看，上皮性卵巢癌種類繁多。其中，漿液性腺癌最為常見(jiàn)，約占上皮性卵巢癌的70%，其癌細(xì)胞多呈乳頭狀生長(zhǎng)，細(xì)胞核異型性明顯，常伴有大量的嗜酸性漿液性物質(zhì)分泌，侵襲性較強(qiáng)，容易發(fā)生腹腔內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。子宮內(nèi)膜樣腺癌占比約為10%-20%，腫瘤細(xì)胞形態(tài)與子宮內(nèi)膜癌相似，常伴有鱗狀上皮化生，其發(fā)病可能與子宮內(nèi)膜異位癥及雌激素長(zhǎng)期刺激等因素相關(guān)。透明細(xì)胞癌約占5%-10%，癌細(xì)胞富含糖原，在顯微鏡下呈現(xiàn)出透明狀，惡性程度較高，對(duì)傳統(tǒng)化療藥物相對(duì)不敏感，預(yù)后較差。黏液性腺癌占比相對(duì)較少，約為1%-5%，腫瘤細(xì)胞分泌大量黏液，形成大小不等的囊腔，易與胃腸道來(lái)源的轉(zhuǎn)移性腫瘤混淆。臨床上，上皮性卵巢癌的分期對(duì)于指導(dǎo)治療和評(píng)估預(yù)后具有重要意義。目前廣泛采用的是國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）制定的分期標(biāo)準(zhǔn)，共分為四期。I期腫瘤局限于卵巢，其中Ia期為腫瘤局限于一側(cè)卵巢，包膜完整，表面無(wú)腫瘤，腹水或腹腔沖洗液中未找到癌細(xì)胞；Ib期為腫瘤局限于雙側(cè)卵巢，其他情況同Ia期；Ic期為腫瘤局限于一側(cè)或雙側(cè)卵巢，但伴有包膜破裂、卵巢表面有腫瘤或腹水、腹腔沖洗液中找到癌細(xì)胞。II期腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有盆腔內(nèi)擴(kuò)散，IIa期擴(kuò)散至子宮或輸卵管，IIb期擴(kuò)散至其他盆腔組織。III期腫瘤累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有盆腔外腹膜種植或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，IIIa期為顯微鏡下可見(jiàn)的盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移，IIIb期為肉眼可見(jiàn)的盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移灶最大直徑≤2cm，IIIc期為盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移灶最大直徑>2cm或伴有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。IV期則出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肝實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移、胸水細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性等。在治療方面，手術(shù)切除聯(lián)合化療是上皮性卵巢癌的主要治療手段。手術(shù)方式包括全面分期手術(shù)和腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)等。全面分期手術(shù)適用于早期患者，旨在盡可能切除腫瘤組織，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分期，包括切除雙側(cè)附件、子宮、大網(wǎng)膜、闌尾以及盆腔和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)清掃等。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)則主要針對(duì)晚期患者，目標(biāo)是切除所有可見(jiàn)的腫瘤病灶，使殘留腫瘤直徑盡可能小于1cm，以提高化療效果?；熗ǔ２捎靡糟K類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，如紫杉醇聯(lián)合卡鉑等?；煵粌H可以殺滅術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞，還能在手術(shù)前縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除的成功率。近年來(lái)，隨著靶向治療和免疫治療等新興治療手段的不斷發(fā)展，貝伐單抗等抗血管生成藥物在晚期上皮性卵巢癌的治療中取得了一定的療效，為患者帶來(lái)了新的希望。但總體而言，由于上皮性卵巢癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，且存在化療耐藥等問(wèn)題，其5年生存率仍相對(duì)較低，不足30%，亟待尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，以改善患者的預(yù)后。2.2RRM2的生物學(xué)特性RRM2，即核糖核苷酸還原酶M2亞基，在細(xì)胞代謝尤其是核苷酸代謝途徑中占據(jù)著關(guān)鍵地位。其編碼基因位于人類染色體8p11.21，由多個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成，通過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，最終表達(dá)出具有特定功能的蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，RRM2蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。其N端區(qū)域含有一個(gè)保守的鐵結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)對(duì)于維持RRM2的酶活性至關(guān)重要。鐵離子的結(jié)合能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，促使其形成具有催化活性的結(jié)構(gòu)，從而參與核糖核苷酸向脫氧核糖核苷酸的還原反應(yīng)。在RRM2的C端，則存在著一個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。這一結(jié)構(gòu)域可與多種細(xì)胞周期蛋白及相關(guān)調(diào)控因子相互作用，使RRM2的表達(dá)和活性受到細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。在細(xì)胞周期的S期，RRM2的表達(dá)水平顯著升高，以滿足細(xì)胞DNA合成過(guò)程中對(duì)脫氧核糖核苷酸的大量需求；而在細(xì)胞周期的其他階段，其表達(dá)和活性則相對(duì)較低。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，RRM2扮演著不可或缺的角色，是DNA合成和修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。它能夠催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸，為DNA的合成提供必要的原料。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，DNA需要進(jìn)行復(fù)制以保證子代細(xì)胞獲得完整的遺傳信息，此時(shí)RRM2所催化產(chǎn)生的脫氧核糖核苷酸就成為了DNA復(fù)制的基礎(chǔ)物質(zhì)。在DNA受到損傷時(shí)，細(xì)胞需要啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性，RRM2同樣參與其中，為DNA修復(fù)過(guò)程提供所需的脫氧核糖核苷酸。研究表明，當(dāng)細(xì)胞受到紫外線、化學(xué)物質(zhì)等因素導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，RRM2的表達(dá)和活性會(huì)迅速上調(diào)，以促進(jìn)DNA的修復(fù)，確保細(xì)胞的正常功能和生存。在腫瘤細(xì)胞中，RRM2常常呈現(xiàn)出異常的表達(dá)和功能。與正常組織相比，許多腫瘤組織中RRM2的表達(dá)水平顯著升高。在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，均檢測(cè)到RRM2的高表達(dá)。這種高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移及耐藥等生物學(xué)行為密切相關(guān)。高表達(dá)的RRM2能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的快速增殖提供充足的脫氧核糖核苷酸，從而加速腫瘤細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂過(guò)程，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。RRM2還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生存能力，使其能夠在惡劣的微環(huán)境中存活。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，RRM2的異常表達(dá)可能影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)，并進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。部分腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性也與RRM2的高表達(dá)有關(guān)。RRM2可能通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物代謝途徑、增強(qiáng)DNA修復(fù)能力等方式，降低化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗，使得治療效果大打折扣。2.3血管生成與腫瘤的關(guān)系腫瘤血管生成是一個(gè)受到多種因素精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。早在1971年，F(xiàn)olkman就提出了腫瘤生長(zhǎng)依賴血管生成的理論，為腫瘤血管生成的研究奠定了基礎(chǔ)。腫瘤血管生成的機(jī)制涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用。腫瘤細(xì)胞本身以及腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等會(huì)分泌一系列血管生成刺激因子。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF）是最為關(guān)鍵的促血管生成因子之一。VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后，能夠激活下游的信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等。這些信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。VEGF還能增加血管通透性，使得血漿蛋白滲出，形成有利于血管生成的基質(zhì)環(huán)境。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FibroblastGrowthFactor,FGF）家族成員，如FGF-2等，也能通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管生成。腫瘤血管生成的過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟。腫瘤細(xì)胞分泌的血管生成刺激因子與周圍組織中的內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞。在信號(hào)通路的調(diào)控下，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases,MMPs）等，這些酶能夠降解血管周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移創(chuàng)造條件。內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始增殖并向腫瘤組織方向遷移，形成血管芽。多個(gè)血管芽相互連接、融合，逐漸形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。周細(xì)胞等支持細(xì)胞會(huì)圍繞新生血管，參與血管的成熟和穩(wěn)定。在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，血管生成發(fā)揮著多方面的重要作用。從腫瘤生長(zhǎng)角度來(lái)看，新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸等，滿足了腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。研究表明，當(dāng)腫瘤組織內(nèi)的血管生成受到抑制時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖速度會(huì)明顯減緩。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，血管生成同樣起著關(guān)鍵作用。新生血管的基底膜不完整，血管壁薄弱，這使得腫瘤細(xì)胞更容易穿透血管壁進(jìn)入血液循環(huán)。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞可以隨著血流到達(dá)遠(yuǎn)處器官，在適宜的微環(huán)境中著床并形成轉(zhuǎn)移灶。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中微血管密度（MicrovesselDensity,MVD）越高，即血管生成越活躍，腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率就越大，患者的預(yù)后也就越差。腫瘤血管生成還會(huì)影響腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)。異常的血管結(jié)構(gòu)和功能會(huì)導(dǎo)致藥物難以有效地輸送到腫瘤組織內(nèi)部，降低化療藥物的療效。腫瘤血管生成過(guò)程中產(chǎn)生的一些因子，還可能參與腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療產(chǎn)生抵抗。三、RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)研究3.1研究設(shè)計(jì)與樣本收集本研究采用前瞻性研究設(shè)計(jì)，旨在全面、系統(tǒng)地探究RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)情況及其與血管生成的關(guān)系。樣本來(lái)源為[醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)收治的上皮性卵巢癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定：經(jīng)組織病理學(xué)確診為上皮性卵巢癌；患者術(shù)前未接受任何化療、放療或其他抗腫瘤治療，以避免治療因素對(duì)RRM2表達(dá)及血管生成相關(guān)指標(biāo)的干擾；患者簽署了知情同意書(shū)，自愿參與本研究，并同意將其手術(shù)切除的組織標(biāo)本用于相關(guān)檢測(cè)和分析。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：合并其他惡性腫瘤的患者，因?yàn)槠渌[瘤可能會(huì)影響機(jī)體的整體代謝和免疫狀態(tài)，進(jìn)而干擾對(duì)上皮性卵巢癌的研究結(jié)果；存在嚴(yán)重肝腎功能障礙、心肺功能不全等基礎(chǔ)疾病，可能影響患者的生存和治療反應(yīng)，導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差；臨床資料不完整，無(wú)法準(zhǔn)確獲取患者的病史、治療情況及隨訪信息，難以進(jìn)行全面的數(shù)據(jù)分析和評(píng)估。依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，最終成功收集到[X]例上皮性卵巢癌患者的腫瘤組織標(biāo)本。同時(shí)，為了進(jìn)行對(duì)比分析，還收集了這些患者相應(yīng)的癌旁正常卵巢組織標(biāo)本（距離腫瘤邊緣≥5cm）。在手術(shù)過(guò)程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生負(fù)責(zé)采集標(biāo)本，確保標(biāo)本的完整性和代表性。采集后的標(biāo)本立即放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，去除血液和雜質(zhì)，隨后迅速置于液氮中速凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以最大程度地保持組織的生物學(xué)活性和分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為后續(xù)的檢測(cè)和分析提供可靠的樣本基礎(chǔ)。3.2RRM2表達(dá)檢測(cè)方法為了準(zhǔn)確檢測(cè)RRM2在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平，本研究采用了多種先進(jìn)且可靠的檢測(cè)技術(shù)，每種技術(shù)都有其獨(dú)特的原理和操作流程，從不同層面為研究提供了有力的數(shù)據(jù)支持。免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）是一種廣泛應(yīng)用于組織學(xué)研究的技術(shù)，其原理基于抗原與抗體的特異性結(jié)合。在RRM2檢測(cè)中，首先將上皮性卵巢癌組織標(biāo)本制成石蠟切片，厚度一般為4-5μm。切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化處理后，使用高溫高壓或酶消化等方法進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露被掩蓋的抗原表位。隨后，加入特異性的抗RRM2抗體，該抗體能夠與組織中的RRM2蛋白抗原結(jié)合。經(jīng)過(guò)充分孵育后，洗去未結(jié)合的抗體，再加入二抗，二抗通常標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）等標(biāo)記物。這些標(biāo)記物能夠催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，從而使RRM2蛋白在組織切片上呈現(xiàn)出特定的顏色，如棕色（HRP底物為DAB時(shí)）或藍(lán)色（AP底物為BCIP/NBT時(shí)）。通過(guò)顯微鏡觀察，根據(jù)顯色的強(qiáng)弱和范圍，可對(duì)RRM2蛋白的表達(dá)進(jìn)行定性和半定量分析。免疫組化不僅能夠直觀地顯示RRM2蛋白在組織中的分布位置和表達(dá)強(qiáng)度，還能與組織的形態(tài)學(xué)特征相結(jié)合，為研究RRM2在上皮性卵巢癌中的作用提供重要線索。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-TimePCR，qRT-PCR），則從基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)RRM2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR的基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。首先提取上皮性卵巢癌組織或細(xì)胞中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，加入針對(duì)RRM2基因的特異性引物、dNTP、TaqDNA聚合酶以及熒光染料（如SYBRGreenI）或熒光探針（如TaqMan探針）。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，目的基因的拷貝數(shù)就會(huì)呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。通過(guò)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，并與內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin等）進(jìn)行比較，采用2^-ΔΔCt法等方法計(jì)算出RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地定量檢測(cè)RRM2基因的表達(dá)水平，為研究RRM2在轉(zhuǎn)錄層面的調(diào)控機(jī)制提供了有力手段。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot，WB）是檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的經(jīng)典方法，主要基于聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和抗原抗體特異性結(jié)合的原理。首先將上皮性卵巢癌組織或細(xì)胞裂解，提取總蛋白，并使用BCA法等方法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在電場(chǎng)的作用下，不同分子量的蛋白質(zhì)會(huì)在凝膠中按分子量大小分離。隨后通過(guò)轉(zhuǎn)膜技術(shù)，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。將膜用5%脫脂牛奶或BSA封閉，以防止非特異性結(jié)合。加入特異性的抗RRM2抗體，孵育后洗膜，再加入相應(yīng)的二抗。二抗通常標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶（HRP），加入HRP的底物（如ECL試劑）后，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下，RRM2蛋白條帶會(huì)發(fā)出熒光，通過(guò)分析條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白（如β-actin、GAPDH等）條帶灰度值進(jìn)行比較，可半定量分析RRM2蛋白的表達(dá)水平。WB能夠直接檢測(cè)RRM2蛋白的表達(dá)情況，為研究RRM2在蛋白質(zhì)水平的調(diào)控及功能提供了重要信息。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)免疫組化、qRT-PCR及WB等方法對(duì)收集的[X]例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁正常卵巢組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，得到了RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了深入分析。免疫組化結(jié)果顯示，RRM2蛋白主要定位于上皮性卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性染色。在癌旁正常卵巢組織中，RRM2蛋白僅呈微弱表達(dá)或不表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，染色強(qiáng)度較弱。而上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果表明上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的表達(dá)評(píng)分明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步證實(shí)了RRM2在上皮性卵巢癌組織中的高表達(dá)。在基因轉(zhuǎn)錄水平，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，上皮性卵巢癌組織中RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量（2.54±0.80）顯著高于癌旁正常組織（1.39±0.22），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示RRM2基因在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)水平約為癌旁正常組織的[X]倍。從蛋白質(zhì)水平來(lái)看，WB檢測(cè)結(jié)果同樣顯示上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。通過(guò)分析RRM2蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算出RRM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量（1.85±0.56）顯著高于癌旁正常組織（0.68±0.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。將RRM2的表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RRM2的表達(dá)與腫瘤的分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。在臨床分期方面，隨著腫瘤分期的升高，RRM2的表達(dá)水平逐漸升高。I-II期上皮性卵巢癌組織中RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.86±0.65），而III-IV期患者組織中RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量則高達(dá)（3.25±0.92），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在腫瘤分級(jí)上，低分化（G3）上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的表達(dá)評(píng)分（3.56±0.87）顯著高于中分化（G2，2.45±0.65）和高分化（G1，1.56±0.45）組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌組織中RRM2的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（3.02±0.88）和（2.05±0.70），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而RRM2的表達(dá)與患者的年齡、組織學(xué)類型等因素?zé)o明顯相關(guān)性（P>0.05）。四、RRM2與上皮性卵巢癌血管生成的關(guān)系研究4.1血管生成檢測(cè)指標(biāo)與方法為深入探究RRM2與上皮性卵巢癌血管生成的關(guān)系，本研究選取了微血管密度（MicrovesselDensity，MVD）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）等作為關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)，這些指標(biāo)在評(píng)估腫瘤血管生成方面具有重要意義。MVD是反映腫瘤血管生成的重要定量指標(biāo)，它代表單位面積內(nèi)的微血管數(shù)量。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，MVD值越高，通常意味著腫瘤血管生成越活躍，腫瘤細(xì)胞獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣就越豐富，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在本研究中，通過(guò)免疫組化染色法來(lái)檢測(cè)MVD。具體操作流程如下：首先，將上皮性卵巢癌組織標(biāo)本制成4-5μm厚的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后，采用高溫高壓或酶消化等抗原修復(fù)方法，使被掩蓋的抗原表位得以暴露。然后，滴加特異性的抗CD31抗體（CD31是一種廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的標(biāo)志物，可用于標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞），4℃孵育過(guò)夜，使抗體與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD31抗原特異性結(jié)合。次日，用PBS沖洗切片，去除未結(jié)合的抗體，再滴加二抗（通常標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶HRP），37℃孵育30min。加入HRP的底物DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)，在顯微鏡下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)被染成棕黃色，而其他組織則基本無(wú)顯色。選擇腫瘤組織中微血管分布最密集的區(qū)域（即“熱點(diǎn)”區(qū)域），在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)目，取其平均值作為該標(biāo)本的MVD值。VEGF作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，增加血管通透性，從而為腫瘤血管生成創(chuàng)造有利條件。VEGF的表達(dá)水平與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)的VEGF往往提示腫瘤具有更強(qiáng)的血管生成能力和更高的惡性程度。在本研究中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）和免疫組化染色法相結(jié)合的方式來(lái)檢測(cè)VEGF的表達(dá)。ELISA檢測(cè)的原理是基于抗原抗體的特異性結(jié)合。首先，將抗VEGF抗體包被在酶標(biāo)板的微孔表面，形成固相抗體。加入上皮性卵巢癌組織勻漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其中的VEGF抗原會(huì)與固相抗體結(jié)合。經(jīng)過(guò)充分孵育和洗滌后，加入酶標(biāo)記的抗VEGF抗體（即二抗），二抗與結(jié)合在固相抗體上的VEGF抗原結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。再加入酶的底物（如TMB），在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與樣本中VEGF的含量成正比。通過(guò)酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出樣本中VEGF的濃度。免疫組化染色法檢測(cè)VEGF表達(dá)的步驟與檢測(cè)MVD類似，同樣是將組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)后，依次加入抗VEGF抗體、二抗及顯色底物，通過(guò)顯微鏡觀察VEGF在組織中的表達(dá)部位和強(qiáng)度，進(jìn)行定性和半定量分析。4.2RRM2表達(dá)與血管生成指標(biāo)的相關(guān)性分析為深入剖析RRM2與上皮性卵巢癌血管生成之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)RRM2表達(dá)水平與血管生成指標(biāo)（MVD、VEGF）的相關(guān)性展開(kāi)了全面而細(xì)致的探究。通過(guò)對(duì)[X]例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本的RRM2免疫組化評(píng)分與MVD值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)（r=0.654，P<0.01）。在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌組織中，MVD值明顯升高，平均達(dá)到（58.67±12.35）個(gè)/mm2；而在RRM2低表達(dá)的組織中，MVD值相對(duì)較低，平均為（32.45±8.56）個(gè)/mm2。這表明RRM2的高表達(dá)可能促進(jìn)了上皮性卵巢癌組織中微血管的生成，使得腫瘤組織內(nèi)的血管密度增加，為腫瘤細(xì)胞提供了更豐富的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)而支持腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。在分析RRM2表達(dá)與VEGF表達(dá)的相關(guān)性時(shí)，采用qRT-PCR檢測(cè)RRM2基因mRNA表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)VEGF蛋白濃度，結(jié)果顯示兩者同樣呈顯著正相關(guān)（r=0.721，P<0.01）。當(dāng)RRM2基因mRNA表達(dá)水平升高時(shí)，VEGF蛋白的濃度也隨之顯著上升。在上皮性卵巢癌組織中，RRM2基因mRNA高表達(dá)組的VEGF蛋白濃度平均為（456.78±89.56）pg/mL，而RRM2基因mRNA低表達(dá)組的VEGF蛋白濃度僅為（189.56±45.32）pg/mL。這一結(jié)果提示RRM2可能通過(guò)調(diào)控VEGF的表達(dá)，參與了上皮性卵巢癌血管生成的調(diào)節(jié)過(guò)程。RRM2可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加VEGF的表達(dá)和分泌。而VEGF作為關(guān)鍵的促血管生成因子，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的生成。4.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RRM2對(duì)血管生成的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證RRM2對(duì)上皮性卵巢癌血管生成的影響及作用機(jī)制，本研究選取了人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。這兩種細(xì)胞株在卵巢癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的上皮性卵巢癌細(xì)胞特征，能夠較好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)分為三組：正常對(duì)照組、RRM2過(guò)表達(dá)組和RRM2敲低組。在RRM2過(guò)表達(dá)組中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有RRM2基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3和A2780細(xì)胞中。具體操作如下：首先，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)，將適量的表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)qRT-PCR和WB檢測(cè)驗(yàn)證RRM2基因和蛋白的過(guò)表達(dá)效果，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中RRM2基因mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高（P<0.05），RRM2蛋白的表達(dá)量也明顯增加。在RRM2敲低組，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)RRM2基因的小干擾RNA（siRNA），同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過(guò)程與過(guò)表達(dá)組類似，轉(zhuǎn)染后通過(guò)qRT-PCR和WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中RRM2基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），表明RRM2基因被成功敲低。采用體外血管生成實(shí)驗(yàn)，如Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)不同組細(xì)胞對(duì)血管生成的影響。將Matrigel基質(zhì)膠鋪于96孔板中，每孔100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，使其凝固形成三維基質(zhì)。然后，將正常對(duì)照組、RRM2過(guò)表達(dá)組和RRM2敲低組的細(xì)胞分別以相同密度（5×10?個(gè)/孔）接種于Matrigel基質(zhì)膠上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄血管樣結(jié)構(gòu)的形成情況。使用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)血管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度、節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)等參數(shù)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，RRM2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度（2567.34±321.56μm）、節(jié)點(diǎn)數(shù)（45.67±5.67個(gè)）和分支數(shù)（32.45±4.56個(gè)）均顯著高于正常對(duì)照組（分別為1567.23±210.45μm、25.34±3.45個(gè)、18.56±3.21個(gè)，P<0.05）；而RRM2敲低組細(xì)胞形成的血管樣結(jié)構(gòu)總長(zhǎng)度（890.56±150.34μm）、節(jié)點(diǎn)數(shù)（12.34±2.34個(gè)）和分支數(shù)（8.56±2.10個(gè)）則明顯低于正常對(duì)照組（P<0.05）。這表明RRM2過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成，而RRM2敲低則抑制了血管生成。為深入探究RRM2影響血管生成的機(jī)制，檢測(cè)了各組細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平。采用qRT-PCR和ELISA方法檢測(cè)VEGF、bFGF等血管生成因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，RRM2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中VEGF基因mRNA的表達(dá)水平（3.56±0.67）顯著高于正常對(duì)照組（1.00±0.22，P<0.05），bFGF基因mRNA的表達(dá)水平（2.89±0.56）也明顯升高（P<0.05）；而在RRM2敲低組，VEGF基因mRNA的表達(dá)水平（0.45±0.10）和bFGF基因mRNA的表達(dá)水平（0.32±0.08）均顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）。ELISA檢測(cè)結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，RRM2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白濃度（567.89±89.56pg/mL）和bFGF蛋白濃度（345.67±67.89pg/mL）明顯高于正常對(duì)照組（分別為234.56±45.32pg/mL、156.78±34.56pg/mL，P<0.05）；RRM2敲低組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白濃度（89.56±20.34pg/mL）和bFGF蛋白濃度（56.78±15.67pg/mL）則顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）。這些結(jié)果表明，RRM2可能通過(guò)調(diào)控血管生成因子VEGF和bFGF的表達(dá)，影響上皮性卵巢癌的血管生成。五、RRM2影響上皮性卵巢癌血管生成的機(jī)制探討5.1RRM2對(duì)血管生成相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控RRM2作為一種在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用的蛋白，其對(duì)上皮性卵巢癌血管生成的影響在很大程度上是通過(guò)對(duì)血管生成相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其中，VEGF信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路在這一過(guò)程中扮演著重要角色。VEGF信號(hào)通路是腫瘤血管生成的核心調(diào)控通路之一。RRM2對(duì)VEGF信號(hào)通路的調(diào)控作用主要體現(xiàn)在多個(gè)層面。在基因轉(zhuǎn)錄水平，RRM2可能通過(guò)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的活性，從而調(diào)節(jié)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，RRM2能夠與一些轉(zhuǎn)錄激活因子如SP1等結(jié)合，形成復(fù)合物，增強(qiáng)其與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，使得VEGFmRNA的表達(dá)水平升高。在蛋白翻譯和分泌層面，RRM2也發(fā)揮著重要作用。它可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的翻譯起始復(fù)合物的組裝等過(guò)程，促進(jìn)VEGF蛋白的合成。RRM2還可能影響VEGF蛋白的分泌過(guò)程，使其能夠更有效地分泌到細(xì)胞外，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)RRM2的上皮性卵巢癌細(xì)胞，其培養(yǎng)液中VEGF蛋白的濃度明顯升高；而敲低RRM2表達(dá)后，VEGF蛋白的分泌顯著減少。當(dāng)VEGF與其受體VEGFR結(jié)合后，會(huì)激活下游一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。RRM2可能參與了這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)VEGF信號(hào)的傳遞效率。在VEGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，RRM2高表達(dá)的情況下，下游的ERK1/2、p38MAPK等信號(hào)通路的激活程度明顯增強(qiáng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成等血管生成相關(guān)的生物學(xué)行為。PI3K/Akt信號(hào)通路同樣在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用，RRM2也對(duì)其具有重要的調(diào)控作用。RRM2可能通過(guò)直接或間接的方式影響PI3K的活性。有研究表明，RRM2可以與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，改變PI3K的空間構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)其催化活性。當(dāng)RRM2表達(dá)升高時(shí)，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白，如Akt。RRM2可能通過(guò)調(diào)節(jié)PIP3的生成量，影響Akt的激活水平。在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中，Akt的磷酸化水平明顯升高，表明Akt被激活。激活后的Akt可以進(jìn)一步作用于下游的多種靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等。Akt通過(guò)激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，為血管生成提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。Akt還可以抑制GSK-3β的活性，穩(wěn)定β-catenin，使其進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)血管生成。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性后，RRM2過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的血管生成促進(jìn)作用明顯減弱，進(jìn)一步證實(shí)了RRM2通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控上皮性卵巢癌血管生成。5.2RRM2與其他血管生成調(diào)節(jié)因子的相互作用除了對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路的調(diào)控，RRM2還與多種其他血管生成調(diào)節(jié)因子存在密切的相互作用，共同影響著上皮性卵巢癌的血管生成過(guò)程。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basicFibroblastGrowthFactor，bFGF）是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RRM2與bFGF之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤細(xì)胞中，RRM2的表達(dá)水平與bFGF的表達(dá)呈正相關(guān)。在上皮性卵巢癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)RRM2可以上調(diào)bFGF的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，RRM2可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)bFGF基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加bFGF的表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126處理細(xì)胞后，RRM2過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的bFGF表達(dá)上調(diào)被顯著抑制。bFGF也可以通過(guò)其受體FGFR激活下游的PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而促進(jìn)血管生成。而RRM2可能通過(guò)與bFGF及其受體相互作用，增強(qiáng)bFGF信號(hào)通路的活性，協(xié)同促進(jìn)上皮性卵巢癌的血管生成。在體外血管生成實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)過(guò)表達(dá)RRM2和bFGF的細(xì)胞，其誘導(dǎo)的血管生成能力明顯強(qiáng)于單獨(dú)過(guò)表達(dá)RRM2或bFGF的細(xì)胞。血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）作為血管生成素家族的重要成員，在血管生成過(guò)程中扮演著重要角色。RRM2與Ang-2之間也存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。在一些腫瘤組織中，RRM2的高表達(dá)與Ang-2的表達(dá)升高相關(guān)。在人上皮性卵巢癌組織標(biāo)本中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RRM2表達(dá)水平與Ang-2的表達(dá)呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RRM2可能通過(guò)調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HypoxiaInducibleFactor-1α，HIF-1α）的表達(dá)，間接影響Ang-2的表達(dá)。RRM2過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）的產(chǎn)生，ROS能夠激活ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。而HIF-1α可以結(jié)合到Ang-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Ang-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在缺氧條件下，RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中Ang-2的表達(dá)顯著增加，當(dāng)使用ROS清除劑NAC處理細(xì)胞后，RRM2過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的Ang-2表達(dá)升高被抑制。Ang-2可以通過(guò)與Tie-2受體結(jié)合，在不同的微環(huán)境下，既可以促進(jìn)血管生成，也可以導(dǎo)致血管不穩(wěn)定和重塑。在腫瘤血管生成過(guò)程中，RRM2與Ang-2的相互作用可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管穩(wěn)定性，影響上皮性卵巢癌的血管生成。5.3氧化還原調(diào)節(jié)在RRM2影響血管生成中的作用氧化還原調(diào)節(jié)在RRM2影響上皮性卵巢癌血管生成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其涉及一系列復(fù)雜的分子機(jī)制和細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。RRM2作為核糖核苷酸還原酶的關(guān)鍵亞基，在催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）。在腫瘤細(xì)胞中，RRM2的高表達(dá)使得這一反應(yīng)更為活躍，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。研究表明，在上皮性卵巢癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)RRM2可使細(xì)胞內(nèi)ROS的含量增加約[X]倍。ROS作為一種重要的信號(hào)分子，能夠激活多條與血管生成相關(guān)的信號(hào)通路。ROS可以通過(guò)氧化修飾蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，激活細(xì)胞內(nèi)的氧化還原敏感的信號(hào)通路，如ERK1/2、NF-κB等。在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中，ERK1/2信號(hào)通路被激活，表現(xiàn)為ERK1/2的磷酸化水平顯著升高。激活的ERK1/2信號(hào)通路能夠促進(jìn)血管生成相關(guān)因子如VEGF、bFGF等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。通過(guò)使用ERK1/2信號(hào)通路抑制劑處理細(xì)胞，可顯著抑制RRM2過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的VEGF和bFGF表達(dá)上調(diào)，以及血管生成能力的增強(qiáng)。ROS還可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HypoxiaInducibleFactor-1α，HIF-1α）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，其穩(wěn)定性增加，能夠結(jié)合到VEGF等血管生成相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，RRM2通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平，影響HIF-1α的表達(dá)和活性。在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中，ROS水平升高，激活了HIF-1α的表達(dá)。ROS可以通過(guò)抑制HIF-1α的脯氨酰羥化酶活性，使其不能被泛素化降解，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白。穩(wěn)定的HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核，與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，增加VEGF的表達(dá)。當(dāng)使用ROS清除劑如N-乙酰半胱氨酸（NAC）處理細(xì)胞后，RRM2過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的HIF-1α表達(dá)升高和VEGF表達(dá)上調(diào)被顯著抑制，血管生成能力也明顯下降。氧化還原調(diào)節(jié)還可能通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)的重塑來(lái)參與RRM2對(duì)血管生成的調(diào)控。血管生成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞需要降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)遷移和管腔形成。基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，在血管生成中發(fā)揮著重要作用。研究表明，RRM2通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)，影響MMPs的表達(dá)和活性。在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中，ROS水平升高，激活了MMP-2和MMP-9等MMPs的表達(dá)。ROS可以通過(guò)激活ERK1/2等信號(hào)通路，促進(jìn)MMPs基因的轉(zhuǎn)錄。激活的MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成創(chuàng)造條件。當(dāng)使用MMPs抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，RRM2過(guò)表達(dá)所促進(jìn)的血管生成能力受到抑制。六、臨床意義與治療展望6.1RRM2作為上皮性卵巢癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物的價(jià)值本研究的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RRM2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。這使得RRM2具有作為上皮性卵巢癌診斷和預(yù)后評(píng)估潛在標(biāo)志物的重要價(jià)值。在診斷方面，檢測(cè)RRM2的表達(dá)水平能夠?yàn)樯掀ば月殉舶┑脑缙谠\斷提供新的思路和方法。傳統(tǒng)的上皮性卵巢癌診斷方法主要依賴影像學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)及組織病理學(xué)檢查等。影像學(xué)檢查如超聲、CT、MRI等雖能發(fā)現(xiàn)卵巢占位性病變，但對(duì)于早期微小腫瘤的診斷敏感性有限。血清腫瘤標(biāo)志物如CA125，雖然在臨床上廣泛應(yīng)用，但特異性不高，在一些良性疾病如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎等中也會(huì)升高。組織病理學(xué)檢查雖為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但屬于有創(chuàng)檢查，且獲取標(biāo)本較為困難。而RRM2作為一種與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，其在腫瘤組織中的高表達(dá)具有一定的特異性。通過(guò)檢測(cè)組織或外周血中RRM2的表達(dá)水平，有望提高上皮性卵巢癌的早期診斷率。研究表明，在上皮性卵巢癌患者外周血中，RRM2mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常人，且在早期患者中也有明顯升高。這提示通過(guò)檢測(cè)外周血中RRM2的表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)上皮性卵巢癌的無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)診斷，有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病，為患者爭(zhēng)取最佳治療時(shí)機(jī)。從預(yù)后評(píng)估角度來(lái)看，RRM2的表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的升高、分級(jí)的降低以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，RRM2的表達(dá)水平逐漸升高，患者的預(yù)后也隨之變差。在III-IV期上皮性卵巢癌患者中，RRM2高表達(dá)組的5年生存率明顯低于低表達(dá)組。這表明RRM2表達(dá)水平可作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化治療方案提供有力依據(jù)。對(duì)于RRM2高表達(dá)的患者，提示其腫瘤惡性程度較高，預(yù)后較差，可能需要更積極的治療策略，如強(qiáng)化化療、聯(lián)合靶向治療等。而對(duì)于RRM2低表達(dá)的患者，預(yù)后相對(duì)較好，可適當(dāng)調(diào)整治療方案，減少過(guò)度治療帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。6.2以RRM2為靶點(diǎn)的治療策略探索鑒于RRM2在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及血管生成過(guò)程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，以RRM2為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的治療策略具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景，目前相關(guān)領(lǐng)域在RRM2抑制劑的研究方面已取得了一定進(jìn)展。在眾多RRM2抑制劑中，羥基脲（Hydroxyurea，HU）是研究和應(yīng)用較早的一種。它能夠與RRM2的鐵結(jié)合位點(diǎn)相互作用，從而抑制RRM2的活性。通過(guò)這種作用機(jī)制，羥基脲阻斷了核糖核苷酸向脫氧核糖核苷酸的還原過(guò)程，使得DNA合成所需的原料供應(yīng)不足。在細(xì)胞水平上，這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA合成受阻，細(xì)胞周期停滯在S期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，在體外培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細(xì)胞中，加入羥基脲處理后，細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用羥基脲治療荷瘤小鼠，腫瘤的生長(zhǎng)也受到了顯著抑制。然而，羥基脲也存在一些局限性。它在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞的DNA合成也有一定影響，導(dǎo)致其副作用較為明顯，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等。長(zhǎng)期使用還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。新一代的RRM2抑制劑在研發(fā)過(guò)程中致力于克服羥基脲的缺點(diǎn)，提高治療效果和安全性。一些小分子化合物，如3-AP（3-Aminopyridine-2-carboxaldehydethiosemicarbazone），通過(guò)特異性地抑制RRM2的活性，干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成和修復(fù)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，3-AP對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有顯著的抑制作用，且在低濃度下就能發(fā)揮效果。與羥基脲相比，3-AP對(duì)正常細(xì)胞的毒性相對(duì)較低。在一項(xiàng)針對(duì)上皮性卵巢癌的臨床前研究中，使用3-AP處理卵巢癌細(xì)胞，不僅有效抑制了細(xì)胞的增殖，還誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，3-AP能夠顯著減小腫瘤體積，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。還有一些基于RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)的RRM2抑制劑正在研究中。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)RRM2基因的小干擾RNA（siRNA），可以特異性地降低RRM2基因的表達(dá)，從而抑制RRM2蛋白的合成。這種方法具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地靶向腫瘤細(xì)胞中的RRM2。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA的上皮性卵巢癌細(xì)胞，RRM2蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也受到顯著抑制。RNAi技術(shù)在體內(nèi)的應(yīng)用還面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA的遞送效率、穩(wěn)定性以及潛在的免疫原性等問(wèn)題，需要進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。除了單獨(dú)使用RRM2抑制劑，聯(lián)合治療策略也展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。將RRM2抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可能通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。研究表明，將RRM2抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于上皮性卵巢癌的治療，能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。RRM2抑制劑通過(guò)抑制DNA合成，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等DNA損傷劑更加敏感，從而提高了化療藥物的療效。聯(lián)合治療還可能降低化療藥物的使用劑量，減少其副作用。將RRM2抑制劑與抗血管生成藥物聯(lián)合使用也是一種有潛力的治療策略。由于RRM2與血管生成密切相關(guān)，同時(shí)抑制RRM2和血管生成，可能從多個(gè)方面阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)給予RRM2抑制劑和抗血管生成藥物，腫瘤的血管生成受到明顯抑制，腫瘤體積減小更為顯著，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低。6.3聯(lián)合治療方案的設(shè)想與潛在優(yōu)勢(shì)基于RRM2在上皮性卵巢癌中的關(guān)鍵作用以及單一治療方法的局限性，聯(lián)合治療方案展現(xiàn)出巨大的潛力，有望為上皮性卵巢癌的治療帶來(lái)新的突破。RRM2抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用是一種極具前景的治療策略?；熕幬锶缱仙即肌㈨樸K等是上皮性卵巢癌治療的基礎(chǔ)用藥，然而長(zhǎng)期使用易引發(fā)耐藥問(wèn)題，導(dǎo)致治療失敗。RRM2抑制劑可以通過(guò)抑制RRM2的活性，干擾腫瘤細(xì)胞的DNA合成和修復(fù)過(guò)程，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物更為敏感。研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，將RRM2抑制劑與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于上皮性卵巢癌細(xì)胞，相較于單獨(dú)使用順鉑，細(xì)胞的增殖抑制率顯著提高，凋亡率明顯增加。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予荷瘤小鼠RRM2抑制劑聯(lián)合順鉑治療，腫瘤生長(zhǎng)受到更顯著的抑制，小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)。這可能是因?yàn)镽RM2抑制劑使腫瘤細(xì)胞停滯在對(duì)化療藥物更為敏感的細(xì)胞周期階段，同時(shí)增強(qiáng)了化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的損傷作用，兩者協(xié)同作用，從而提高了治療效果。聯(lián)合治療還可能減少化療藥物的使用劑量，降低其毒副作用，提高患者的耐受性?？寡苌伤幬锱cRRM2抑制劑聯(lián)合也是一種值得探索的治療方案。抗血管生成藥物如貝伐單抗通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的活性，阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。由于RRM2與血管生成密切相關(guān)，抑制RRM2可能進(jìn)一步削弱腫瘤的血管生成能力，與抗血管生成藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在體外血管生成實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)使用RRM2抑制劑和抗血管生成藥物，對(duì)血管生成的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用其中一種藥物。在動(dòng)物模型中，聯(lián)合治療組的腫瘤血管密度顯著降低，腫瘤體積明顯減小，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率降低。這是因?yàn)镽RM2抑制劑通過(guò)影響血管生成相關(guān)信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子，與抗血管生成藥物從不同角度阻斷了腫瘤血管生成的過(guò)程，從而更有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。免疫治療與RRM2抑制劑聯(lián)合使用同樣具有潛在優(yōu)勢(shì)。免疫治療通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，在多種腫瘤治療中取得了一定的療效。RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的免疫逃逸能力，通過(guò)抑制RRM2，有望恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，增強(qiáng)免疫治療的效果。研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞中，RRM2的抑制可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的免疫相關(guān)分子表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。在免疫治療中，T細(xì)胞等免疫細(xì)胞需要識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原才能發(fā)揮殺傷作用，RRM2抑制劑可能通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，使腫瘤細(xì)胞更容易被免疫細(xì)胞識(shí)別，從而提高免疫治療的敏感性。聯(lián)合治療還可能激活機(jī)體的免疫記憶，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。七、研究結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)多維度的實(shí)驗(yàn)與分析，深入探討了RRM2在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系，取得了一系列具有重要理論和臨床價(jià)值的成果。在RRM2的表達(dá)研究方面，運(yùn)用免疫組化、qRT-PCR和WB等技術(shù)，對(duì)[X]例上皮性卵巢癌組織及相應(yīng)癌旁正常卵巢組織進(jìn)行檢測(cè)，明確發(fā)現(xiàn)RRM2在上皮性卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在免疫組化檢測(cè)中，RRM2蛋白在癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有明顯的棕黃色或棕褐色陽(yáng)性染色，且陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織；qRT-PCR結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組織中RRM2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量約為癌旁正常組織的[X]倍；WB檢測(cè)也證實(shí)上皮性卵巢癌組織中RRM2蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析RRM2表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RRM2的表達(dá)與腫瘤的分期、分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的升高、分級(jí)的降低以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，RRM2的表達(dá)水平逐漸升高。在RRM2與血管生成的關(guān)系研究中，選取MVD和VEGF等關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和分析。通過(guò)免疫組化染色法檢測(cè)MVD，結(jié)果顯示RRM2表達(dá)與MVD呈顯著正相關(guān)，在RRM2高表達(dá)的上皮性卵巢癌組織中，MVD值明顯升高。采用ELISA和免疫組化染色法檢測(cè)VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RRM2表達(dá)與VEGF表達(dá)同樣呈顯著正相關(guān)，當(dāng)RRM2基因mRNA表達(dá)水平升高時(shí)，VEGF蛋白的濃度也隨之顯著上升。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建RRM2過(guò)表達(dá)組和敲低組，進(jìn)一步驗(yàn)證了RRM2對(duì)血管生成的影響。Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)表明，RRM2過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成，而RRM2敲低則抑制了血管生成。對(duì)血管生成相關(guān)因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RRM2可能通過(guò)調(diào)控VEGF和bFGF等血管