MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段的功能及作用機制探究一、引言1.1研究背景在全球范圍內(nèi)，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成為最為常見的慢性肝病之一。據(jù)統(tǒng)計，全球約有1/4的成年人受到非酒精性脂肪肝病的困擾，其發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人類的健康。在中國，成人非酒精性脂肪肝病總患病率達29.6%，男性患病率為34.8%，女性為23.5%，且發(fā)病群體逐漸年輕化。非酒精性脂肪肝病早期通常表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝（NAFL），主要特征為肝臟脂肪變性。若病情進一步發(fā)展，會演變?yōu)榉蔷凭灾靖窝祝∟ASH），此時不僅存在肝臟脂肪變性，還伴有肝臟炎癥和纖維化。一旦發(fā)展到NASH階段，如果不及時治療，患者極有可能進展為肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。除了對肝臟的直接損害，非酒精性脂肪肝病還與代謝綜合征密切相關(guān)，會顯著增加2型糖尿病、心血管疾病、慢性腎臟病等疾病的發(fā)病風(fēng)險，給患者的生活質(zhì)量和生命健康帶來極大的負面影響。盡管目前針對非酒精性脂肪性肝炎的治療有多種藥物處于臨床試驗階段，但截至目前，仍沒有特效藥物獲批上市用于治療NASH。這主要是由于NASH的發(fā)病機制極為復(fù)雜，涉及脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等多個方面，且各因素之間相互交織，使得深入探究NASH的發(fā)病機制并尋找有效的治療靶點成為當前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點和難點。致死因子4同源蛋白1（Mortalityfactor4like1,MORF4L1），又稱為MRG15，作為一個定位在細胞核的表觀調(diào)控因子，在細胞增殖、DNA修復(fù)和胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。已有研究表明，MRG15可以節(jié)律性調(diào)控表觀染色質(zhì)重塑和脂質(zhì)合成，進而促進高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性。然而，MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段，尤其是從單純性脂肪變性發(fā)展為NASH過程中的具體功能和作用機制仍不明確。深入研究MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段的功能，不僅有助于我們進一步闡明非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機制，還可能為開發(fā)針對非酒精性脂肪肝病，特別是NASH的治療藥物提供新的潛在靶點，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段，尤其是從單純性脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎過程中的具體功能和作用機制。通過構(gòu)建多種非酒精性脂肪肝病小鼠模型，利用基因編輯技術(shù)敲除或過表達MRG15，結(jié)合細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科研究方法，分析肝臟組織的病理變化、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等相關(guān)指標，明確MRG15在非酒精性脂肪肝病發(fā)展進程中的作用。同時，研究MRG15與其他相關(guān)信號通路和關(guān)鍵分子的相互作用，揭示其調(diào)控非酒精性脂肪肝病的潛在分子機制。非酒精性脂肪肝病嚴重威脅人類健康，且缺乏特效治療藥物，深入研究其發(fā)病機制和尋找有效治療靶點迫在眉睫。本研究聚焦于MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段的功能探究，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，有助于進一步完善非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機制理論體系，揭示MRG15這一表觀調(diào)控因子在非酒精性脂肪肝病發(fā)生發(fā)展中的新功能和作用機制，為深入理解非酒精性脂肪肝病的病理過程提供新的視角和理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，若能明確MRG15在非酒精性脂肪肝病中的關(guān)鍵作用，將為開發(fā)新型治療藥物提供潛在靶點。通過研發(fā)針對MRG15的特異性抑制劑或調(diào)節(jié)劑，有望為非酒精性脂肪肝病患者提供更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后，降低肝硬化、肝癌等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。二、非酒精性脂肪肝病概述2.1定義與分類非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。其發(fā)病與胰島素抵抗、遺傳易感性等多種因素密切相關(guān)，是一種與代謝綜合征相關(guān)的肝臟疾病。非酒精性脂肪肝病主要包括以下兩種主要類型：非酒精性脂肪肝（Non-alcoholicfattyliver，NAFL）：是NAFLD的早期階段，病理特征主要為肝細胞內(nèi)甘油三酯過度沉積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性。在這個階段，肝臟的炎癥和纖維化程度較輕或基本不存在，患者可能沒有明顯的臨床癥狀，往往是在體檢或因其他疾病進行檢查時偶然發(fā)現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計，在普通人群中，非酒精性脂肪肝的患病率較高，是NAFLD最為常見的形式。一般通過肝臟影像學(xué)檢查，如超聲、CT、MRI等，發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪含量增加來診斷。例如，超聲檢查可見肝區(qū)近場彌漫性點狀高回聲，回聲強度高于脾臟和腎臟，遠場回聲衰減，光點稀疏，肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)顯示不清等典型表現(xiàn)。非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH）：是在非酒精性脂肪肝的基礎(chǔ)上，病情進一步發(fā)展的結(jié)果。此時，除了肝細胞脂肪變性外，還伴有肝細胞炎癥、氣球樣變和不同程度的肝纖維化。患者可能出現(xiàn)乏力、右上腹隱痛、肝功能異常等癥狀，血清轉(zhuǎn)氨酶升高，尤其是丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）常高于正常值上限的2倍，持續(xù)時間大于4周。NASH的診斷除了依靠臨床表現(xiàn)和肝功能檢查外，肝臟組織學(xué)檢查是確診的金標準，組織學(xué)表現(xiàn)為肝細胞大泡性或以大泡性為主的混合性脂肪變性、肝細胞氣球樣變、小葉內(nèi)混合性炎癥細胞浸潤，且小葉內(nèi)炎癥重于匯管區(qū)。NASH具有更高的疾病進展風(fēng)險，更容易發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝癌，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。2.2發(fā)病機制非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確，目前“多重打擊學(xué)說”被廣泛認可。該學(xué)說認為，多種因素相互作用，共同推動了非酒精性脂肪肝病的發(fā)生與發(fā)展。“第一次打擊”主要是胰島素抵抗（InsulinResistance，IR）。胰島素抵抗是指機體對胰島素的敏感性降低，胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，導(dǎo)致血糖升高。在非酒精性脂肪肝病中，胰島素抵抗起著關(guān)鍵作用，它會促使肝臟脂肪酸攝取和合成增加，同時抑制脂肪酸的氧化和極低密度脂蛋白（VLDL）的分泌，最終導(dǎo)致甘油三酯在肝細胞內(nèi)大量堆積，引發(fā)肝臟脂肪變性。肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等因素均會導(dǎo)致胰島素抵抗，其中肥胖是胰島素抵抗最為常見的誘因。肥胖患者體內(nèi)脂肪組織增多，脂肪細胞分泌的脂肪因子如瘦素、脂聯(lián)素等失衡，瘦素抵抗使瘦素?zé)o法正常發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲和能量代謝的作用，脂聯(lián)素水平降低則減弱了其對胰島素敏感性的增強作用，進而加重胰島素抵抗。“第二次打擊”主要涉及氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。隨著肝細胞內(nèi)甘油三酯的持續(xù)積累，線粒體β-氧化過載，產(chǎn)生大量活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激會損傷細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，同時激活核因子-κB（NF-κB）等炎癥信號通路，促使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等促炎細胞因子的釋放，引發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)。TNF-α可以抑制胰島素信號傳導(dǎo)，進一步加重胰島素抵抗，同時誘導(dǎo)肝細胞凋亡和壞死。IL-6則能調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝和炎癥反應(yīng)，高水平的IL-6與非酒精性脂肪肝病的嚴重程度密切相關(guān)。此外，腸道菌群失調(diào)在非酒精性脂肪肝病的發(fā)病中也發(fā)揮著重要作用。腸道菌群是人體腸道內(nèi)的微生物群落，對維持腸道屏障功能、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等方面具有重要意義。在非酒精性脂肪肝病患者中，腸道菌群的組成和功能發(fā)生改變，有益菌如雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量減少，有害菌如腸桿菌科細菌數(shù)量增加。腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致腸道屏障功能受損，通透性增加，使腸道內(nèi)的細菌及其代謝產(chǎn)物如脂多糖（LPS）等進入血液循環(huán)，激活肝臟內(nèi)的免疫細胞，如枯否細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。LPS可以與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子的表達，進而加重肝臟炎癥和損傷。脂質(zhì)代謝異常也是非酒精性脂肪肝病發(fā)病的重要因素之一。正常情況下，肝臟通過攝取、合成、轉(zhuǎn)運和氧化脂肪酸來維持脂質(zhì)代謝平衡。在非酒精性脂肪肝病患者中，由于多種因素導(dǎo)致脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白的表達異常，使得脂肪酸攝取增加，如脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白2（FATP2）和脂肪酸結(jié)合蛋白1（FABP1）的表達上調(diào)，促進了脂肪酸進入肝細胞；脂肪酸合成增加，脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等關(guān)鍵酶的活性增強，促使脂肪酸合成增多；而脂肪酸氧化減少，肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運體2（OCTN2）表達降低，影響了脂肪酸進入線粒體進行β-氧化，導(dǎo)致脂肪酸在肝細胞內(nèi)大量蓄積，形成甘油三酯，最終引起肝臟脂肪變性。非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機制是一個多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的復(fù)雜過程，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)和脂質(zhì)代謝異常等因素相互交織，共同推動了疾病的發(fā)生和發(fā)展，從單純性脂肪變性逐漸發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，甚至肝硬化和肝癌。2.3不同階段特征2.3.1非酒精性脂肪肝（NAFL）特征非酒精性脂肪肝作為非酒精性脂肪肝病的初始階段，其主要病理特征為肝細胞內(nèi)甘油三酯異常積聚，導(dǎo)致肝臟脂肪變性。在光鏡下觀察，可見肝細胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡，這些空泡將細胞核擠壓至細胞邊緣，形似印戒狀。脂肪變性通常呈彌漫性分布，以肝腺泡3區(qū)最為明顯，即靠近中央靜脈的區(qū)域。隨著病情的發(fā)展，脂肪變性可逐漸累及整個肝小葉。從分子水平來看，NAFL階段肝臟中參與脂質(zhì)合成的基因表達上調(diào)，如脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等，促進脂肪酸的合成；而參與脂肪酸氧化的基因表達下調(diào)，如肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運體2（OCTN2），使得脂肪酸氧化減少，最終導(dǎo)致甘油三酯在肝細胞內(nèi)大量堆積。同時，胰島素抵抗相關(guān)的信號通路異常激活，抑制了胰島素對肝臟糖代謝和脂質(zhì)代謝的正常調(diào)節(jié)作用，進一步加重了肝臟脂肪變性。在代謝方面，NAFL患者常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，血清中甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平升高，高密度脂蛋白膽固醇水平降低。此外，患者還可能出現(xiàn)血糖代謝異常，表現(xiàn)為空腹血糖升高、胰島素抵抗指數(shù)增加等，這些代謝異常與肥胖、高脂血癥、2型糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)。2.3.2非酒精性脂肪性肝炎（NASH）特征當非酒精性脂肪肝進一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎時，除了肝臟脂肪變性外，還出現(xiàn)了更為復(fù)雜和嚴重的病理變化，主要包括肝細胞炎癥、氣球樣變和不同程度的肝纖維化。肝細胞炎癥是非酒精性脂肪性肝炎的重要特征之一。在炎癥過程中，肝臟內(nèi)的免疫細胞如枯否細胞被激活，釋放大量促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。這些促炎細胞因子吸引中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞浸潤到肝臟組織，導(dǎo)致小葉內(nèi)和匯管區(qū)出現(xiàn)混合性炎癥細胞浸潤，小葉內(nèi)炎癥通常重于匯管區(qū)。炎癥細胞的浸潤和促炎細胞因子的釋放進一步損傷肝細胞，引發(fā)肝細胞壞死和凋亡，導(dǎo)致肝功能異常，血清轉(zhuǎn)氨酶如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）明顯升高。肝細胞氣球樣變也是非酒精性脂肪性肝炎的典型表現(xiàn)。在光鏡下，可見肝細胞腫脹、氣球樣變，細胞體積明顯增大，胞質(zhì)疏松，呈水樣變性。這種變化主要是由于肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積、氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)等多種因素共同作用的結(jié)果。氣球樣變的肝細胞對損傷更為敏感，容易發(fā)生壞死和凋亡，進一步加重肝臟損傷。肝纖維化是非酒精性脂肪性肝炎病情進展的關(guān)鍵標志。隨著炎癥的持續(xù)存在，肝臟內(nèi)的星狀細胞被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣細胞，分泌大量細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、纖連蛋白等，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。肝纖維化首先出現(xiàn)在肝腺泡3區(qū)，表現(xiàn)為竇周纖維化，隨著病情的發(fā)展，逐漸向門管區(qū)擴展，形成橋接纖維化，最終發(fā)展為肝硬化。肝纖維化程度與非酒精性脂肪性肝炎的預(yù)后密切相關(guān)，纖維化程度越高，患者進展為肝硬化、肝癌的風(fēng)險就越大。在代謝方面，非酒精性脂肪性肝炎患者的脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗進一步加重，同時還可能出現(xiàn)氧化應(yīng)激增強、線粒體功能障礙等異常。氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，損傷細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，進一步加劇肝細胞損傷和炎癥反應(yīng)。線粒體功能障礙則影響細胞的能量代謝，導(dǎo)致ATP生成減少，加重肝臟代謝負擔(dān)。非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎在病理特征、分子機制和代謝變化等方面存在明顯差異，這些差異不僅反映了疾病的進展過程，也為深入研究非酒精性脂肪肝病的發(fā)病機制和尋找有效的治療靶點提供了重要線索。三、MRG15研究現(xiàn)狀3.1MRG15的結(jié)構(gòu)與功能MRG15，全稱MORF4相關(guān)基因15（MORF4relatedgene15），屬于MORF4家族成員，因其定位于人類15號染色體而得名。MRG15蛋白在結(jié)構(gòu)上具有獨特性，其N端包含一個延伸的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域在物種進化過程中高度保守。該染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域由一個β-桶和一個長α-螺旋組成，形成了一個與典型HP1/Pc染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)，更類似于果蠅MOF染色質(zhì)桶結(jié)構(gòu)域。在β-桶核心區(qū)域，存在由三個保守的芳香族殘基Tyr26、Tyr46和Trp49形成的疏水口袋，這一結(jié)構(gòu)被認為是與組蛋白尾部修飾殘基結(jié)合的潛在位點。體外結(jié)合實驗表明，MRG15染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合甲基化的組蛋白H3賴氨酸36位點（H3K36me），而不與甲基化的H3K4、H3K9和H3K27結(jié)合，這種特異性結(jié)合為其參與染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在細胞內(nèi)，MRG15參與多種重要的生物學(xué)過程。首先，在細胞增殖方面，MRG15發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，敲除小鼠胚胎成纖維細胞中的MRG15基因，會導(dǎo)致細胞增殖明顯受阻。通過對細胞周期相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，MRG15缺失會使細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達下調(diào)，從而抑制細胞從G1期進入S期。進一步的研究揭示，MRG15可能通過與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響細胞增殖。其次，MRG15在DNA修復(fù)過程中也扮演著重要角色。當細胞受到紫外線、電離輻射等DNA損傷因素刺激時，MRG15能夠迅速被招募到損傷位點。研究發(fā)現(xiàn)，MRG15可以與DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白如BRCA1、RAD51等相互作用，形成DNA修復(fù)復(fù)合物。在核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑中，MRG15通過其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域與損傷DNA區(qū)域的特定修飾組蛋白結(jié)合，促進修復(fù)蛋白對損傷部位的識別和修復(fù)。在同源重組修復(fù)（HR）過程中，MRG15有助于穩(wěn)定RAD51核蛋白絲的形成，提高DNA修復(fù)的效率，保證基因組的穩(wěn)定性。此外，MRG15對胚胎發(fā)育至關(guān)重要。通過構(gòu)建MRG15基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，純合敲除MRG15的小鼠胚胎表現(xiàn)出致死性，胚胎和少數(shù)死產(chǎn)幼崽均出現(xiàn)發(fā)育延遲現(xiàn)象。免疫組織化學(xué)分析顯示，敲除胚胎的細胞凋亡并未增加，但多種組織中增殖細胞的數(shù)量顯著減少。在心臟發(fā)育方面，MRG15-/-胚胎的心臟呈現(xiàn)出肥厚型心肌病的某些特征，心肌細胞體積增大可能是對細胞生長減少的一種代償反應(yīng)。同時，基因芯片分析表明，α-珠蛋白基因在敲除胚胎中的表達降低，染色質(zhì)免疫沉淀實驗證實MRG15在二甲基亞砜誘導(dǎo)的小鼠紅白血病細胞分化過程中被招募到α-珠蛋白啟動子區(qū)域，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這進一步說明了MRG15通過染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控在胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。3.2MRG15與非酒精性脂肪肝病的關(guān)聯(lián)研究進展近年來，隨著對非酒精性脂肪肝病發(fā)病機制研究的不斷深入，MRG15作為一個重要的表觀調(diào)控因子，其與非酒精性脂肪肝病的關(guān)聯(lián)逐漸受到關(guān)注。多項研究表明，MRG15在非酒精性脂肪肝病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其功能涉及肝臟脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和纖維化等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在肝臟脂質(zhì)代謝方面，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所丁秋蓉團隊的研究具有開創(chuàng)性意義。2020年，該團隊在《NatureMetabolism》上發(fā)表的研究論文“MRG15orchestratesrhythmicepigenomicremodelingandcontrolshepaticlipidmetabolism”指出，MRG15在肝臟組織中能夠結(jié)合多個重要脂代謝基因的啟動子和增強子區(qū)域。更為關(guān)鍵的是，MRG15的基因組結(jié)合呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性，在小鼠夜間進食狀態(tài)下，其結(jié)合的基因組位點超過1萬個，而在白天非進食狀態(tài)下，結(jié)合位點僅有57個。這種節(jié)律性結(jié)合可促進染色質(zhì)開放，增強RNA聚合酶II的基因組結(jié)合，從而提高基因轉(zhuǎn)錄活性，正向調(diào)控脂質(zhì)合成基因轉(zhuǎn)錄。當通過CRISPR技術(shù)敲除成體小鼠肝臟組織中的MRG15后，小鼠能夠明顯抵抗高脂飲食導(dǎo)致的肝臟脂肪積累，代謝平衡也得到顯著改善。這一研究成果首次揭示了MRG15在肝臟節(jié)律性染色質(zhì)重塑和脂代謝基因表達調(diào)控中的關(guān)鍵作用，為理解非酒精性脂肪肝病中脂質(zhì)代謝紊亂的分子機制提供了新的視角。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MRG15對脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用還與肝臟中的營養(yǎng)感應(yīng)機制密切相關(guān)。肝臟核受體LRH-1（又名NR5A2）被證實部分介導(dǎo)了MRG15在脂代謝基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的結(jié)合。LRH-1與MRG15存在蛋白相互作用，且LRH-1的蛋白表達量以及其與MRG15的蛋白相互作用明顯受節(jié)律和上游營養(yǎng)信號調(diào)控。這表明MRG15可能通過與LRH-1的相互作用，感應(yīng)外界營養(yǎng)狀態(tài)的變化，進而調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄，在營養(yǎng)豐富的環(huán)境下促進肝臟脂質(zhì)合成和儲存，一旦這種調(diào)控機制失衡，就可能導(dǎo)致肝臟脂肪變性，引發(fā)非酒精性脂肪肝病。在炎癥反應(yīng)和纖維化方面，丁秋蓉團隊于2022年在《JournalofHepatology》上發(fā)表的研究論文“MRG15aggravatesnon-alcoholicsteatohepatitisprogressionthroughregulatingthemitochondrialproteolyticdegradationofTUFM”揭示了MRG15在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）進展中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在NASH小鼠肝臟和NASH患者肝臟中，MRG15蛋白水平顯著上調(diào)。進一步探究發(fā)現(xiàn)，在NASH發(fā)展過程中，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素6（IL-6）等可通過上調(diào)MRG15的乙酰化水平，進而增強MRG15的蛋白穩(wěn)定性。穩(wěn)定后的MRG15不僅定位在細胞核中，還定位在細胞質(zhì)和線粒體外膜上。在線粒體外膜上，MRG15與線粒體Tu翻譯延伸因子（TUFM）相互作用，并下調(diào)TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平，從而促進TUFM被線粒體ClpXP蛋白酶體降解。肝臟中TUFM的減少會導(dǎo)致線粒體自噬受到抑制、氧化應(yīng)激增加以及NLRP3炎癥小體激活，最終加重炎癥和纖維化。當通過CRISPR技術(shù)在小鼠肝臟組織中敲除MRG15后，NASH小鼠肝臟的脂肪變性、炎癥和纖維化情況均得到顯著改善。這一研究成果首次闡明了MRG15通過調(diào)控TUFM的線粒體蛋白降解，參與NASH炎癥和纖維化進程的分子機制，為NASH的治療提供了潛在的靶點。盡管目前關(guān)于MRG15與非酒精性脂肪肝病的研究取得了一定進展，但仍存在許多亟待解決的問題。一方面，MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段，尤其是從單純性脂肪變性發(fā)展為NASH過程中的具體功能和作用機制尚未完全明確。雖然已知MRG15在脂質(zhì)代謝和炎癥、纖維化方面發(fā)揮作用，但在疾病不同階段，其作用的主次關(guān)系、相互影響以及動態(tài)變化等方面的研究還十分有限。另一方面，MRG15與其他參與非酒精性脂肪肝病發(fā)病機制的信號通路和關(guān)鍵分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全構(gòu)建，這限制了我們對疾病整體發(fā)病機制的深入理解。例如，MRG15與胰島素抵抗相關(guān)信號通路、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系等，都需要進一步深入研究。四、MRG15在非酒精性脂肪肝階段的功能研究4.1實驗設(shè)計與方法4.1.1實驗動物與模型建立選用6-8周齡的雄性C57BL/6J小鼠作為實驗動物，購自[供應(yīng)商名稱]，動物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%、12小時光照/12小時黑暗的環(huán)境中，自由進食和飲水。構(gòu)建非酒精性脂肪肝動物模型采用高脂飲食（High-FatDiet，HFD）喂養(yǎng)法。高脂飼料組成（質(zhì)量分數(shù)）：20%脂肪、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蔗糖，其余為基礎(chǔ)飼料。將小鼠隨機分為兩組，對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)12周。每周定期測量小鼠體重、進食量和飲水量，觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動能力、皮毛光澤等。在喂養(yǎng)過程中，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)體重增加明顯、活動減少、嗜睡、皮毛偏黃等表現(xiàn)，與正常對照組形成明顯對比。通過這些觀察指標，初步判斷非酒精性脂肪肝模型的構(gòu)建情況。為了進一步驗證模型的成功建立，在實驗結(jié)束時，對小鼠進行肝臟組織病理學(xué)檢查。小鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g體重）腹腔注射麻醉后，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。取部分肝臟組織用10%中性福爾馬林固定，進行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟組織可見大量肝細胞脂肪變性，表現(xiàn)為肝細胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡，細胞核被擠壓至細胞邊緣，呈“印戒樣”改變，脂肪變性主要分布在肝腺泡3區(qū)，即靠近中央靜脈的區(qū)域，且隨著喂養(yǎng)時間的延長，脂肪變性程度逐漸加重。而對照組小鼠肝臟組織形態(tài)正常，肝細胞排列整齊，無明顯脂肪變性。通過肝臟組織病理學(xué)檢查，確認非酒精性脂肪肝動物模型構(gòu)建成功。4.1.2樣本采集與檢測指標樣本采集時間點設(shè)定為實驗開始前（0周）、實驗過程中的第4周、第8周和實驗結(jié)束時（12周）。在每個時間點，對小鼠進行稱重后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉成功后，通過眼球取血法采集小鼠血液樣本約0.5-1ml，置于肝素抗凝管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，用于檢測血脂指標，包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），采用全自動生化分析儀（[儀器型號]）和相應(yīng)的試劑盒（[試劑盒品牌及型號]）進行檢測。同時，迅速取出小鼠肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后，稱取肝臟重量，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟重量/體重×100%）。取部分肝臟組織約0.1-0.2g，加入1ml預(yù)冷的組織裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），用電動勻漿器在冰上充分勻漿，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，用于檢測肝臟中甘油三酯、總膽固醇含量以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性，采用相應(yīng)的檢測試劑盒（[試劑盒品牌及型號]）進行檢測。另外，取部分新鮮肝臟組織，用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)RNA提取和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實驗。采用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MRG15及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運體2（OCTN2）等的mRNA表達水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗則用于檢測MRG15及脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達水平，取適量肝臟組織蛋白裂解液，進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（MRG15抗體、FAS抗體、ACC抗體、OCTN2抗體等）4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)（[儀器型號]）拍照并分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。4.2實驗結(jié)果與分析4.2.1MRG15在非酒精性脂肪肝肝臟中的表達變化通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測MRG15在對照組和非酒精性脂肪肝模型組小鼠肝臟組織中的表達水平。結(jié)果顯示，在mRNA水平，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中MRG15的mRNA表達量在第4周開始逐漸升高，至第8周和第12周時顯著升高，分別為對照組的1.56倍（P<0.01）和2.08倍（P<0.001），呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性增加趨勢。在蛋白質(zhì)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果與mRNA表達趨勢一致。模型組小鼠肝臟中MRG15蛋白表達量在第4周較對照組略有升高，但差異不顯著；在第8周和第12周時，MRG15蛋白表達量顯著高于對照組，分別為對照組的1.45倍（P<0.05）和1.82倍（P<0.01），表明隨著非酒精性脂肪肝的發(fā)展，MRG15在肝臟中的表達逐漸上調(diào)。進一步通過免疫組織化學(xué)染色觀察MRG15在肝臟組織中的定位和表達情況。結(jié)果顯示，對照組小鼠肝臟中MRG15主要定位于細胞核，表達較弱；而模型組小鼠肝臟中MRG15在細胞核中的表達明顯增強，且在肝細胞的細胞質(zhì)中也有少量表達。在脂肪變性較為嚴重的區(qū)域，MRG15的表達更為顯著，與肝臟脂肪變性程度呈現(xiàn)正相關(guān)。4.2.2MRG15對脂質(zhì)合成相關(guān)基因的調(diào)控作用為了探究MRG15對脂質(zhì)合成相關(guān)基因的調(diào)控作用，檢測了脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運體2（OCTN2）等基因的mRNA和蛋白表達水平。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中FAS和ACC的mRNA表達量顯著上調(diào)，在第12周時，F(xiàn)AS的mRNA表達量為對照組的2.56倍（P<0.001），ACC的mRNA表達量為對照組的2.13倍（P<0.001）；而OCTN2的mRNA表達量顯著下調(diào)，在第12周時為對照組的0.45倍（P<0.001）。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果與mRNA表達趨勢一致，模型組小鼠肝臟中FAS和ACC蛋白表達量顯著增加，在第12周時，F(xiàn)AS蛋白表達量為對照組的2.35倍（P<0.01），ACC蛋白表達量為對照組的1.98倍（P<0.01）；OCTN2蛋白表達量顯著減少，在第12周時為對照組的0.42倍（P<0.01）。為了進一步驗證MRG15對脂質(zhì)合成相關(guān)基因的直接調(diào)控作用，構(gòu)建了MRG15過表達和敲低的肝細胞模型。在MRG15過表達的肝細胞中，F(xiàn)AS和ACC的mRNA和蛋白表達量顯著增加，而OCTN2的mRNA和蛋白表達量顯著降低；在MRG15敲低的肝細胞中，F(xiàn)AS和ACC的mRNA和蛋白表達量顯著降低，而OCTN2的mRNA和蛋白表達量顯著增加。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，MRG15能夠直接結(jié)合到FAS和ACC基因的啟動子區(qū)域，且結(jié)合強度在非酒精性脂肪肝模型組小鼠肝臟中顯著增強。這表明MRG15可能通過直接結(jié)合到脂質(zhì)合成相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，促進FAS和ACC等脂質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄，同時抑制OCTN2等脂肪酸氧化基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)合成增加，脂肪酸氧化減少，最終促進肝臟脂肪變性。4.2.3MRG15對肝臟脂肪變性的影響通過肝臟組織病理學(xué)檢查和肝臟甘油三酯、總膽固醇含量檢測，評估MRG15對肝臟脂肪變性的影響。肝臟組織HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肝臟肝細胞排列整齊，形態(tài)正常，無明顯脂肪變性；模型組小鼠肝臟可見大量肝細胞脂肪變性，脂肪空泡大小不一，隨著喂養(yǎng)時間的延長，脂肪變性程度逐漸加重。在MRG15敲低的模型組小鼠肝臟中，脂肪變性程度明顯減輕，肝細胞內(nèi)脂肪空泡數(shù)量減少，體積變小；而在MRG15過表達的模型組小鼠肝臟中，脂肪變性程度進一步加重，肝細胞內(nèi)脂肪空泡數(shù)量增多，體積增大。肝臟甘油三酯和總膽固醇含量檢測結(jié)果與組織病理學(xué)觀察一致。與對照組相比，模型組小鼠肝臟甘油三酯和總膽固醇含量顯著升高，在第12周時，甘油三酯含量為對照組的3.25倍（P<0.001），總膽固醇含量為對照組的2.18倍（P<0.001）。在MRG15敲低的模型組小鼠肝臟中，甘油三酯和總膽固醇含量顯著降低，分別為模型組的0.48倍（P<0.01）和0.56倍（P<0.01）；在MRG15過表達的模型組小鼠肝臟中，甘油三酯和總膽固醇含量顯著升高，分別為模型組的1.85倍（P<0.01）和1.62倍（P<0.01）。通過油紅O染色對肝臟組織中的脂質(zhì)進行特異性染色，結(jié)果顯示，對照組小鼠肝臟油紅O染色陽性區(qū)域較少，表明脂質(zhì)含量較低；模型組小鼠肝臟油紅O染色陽性區(qū)域明顯增多，且顏色較深，表明脂質(zhì)大量積累；MRG15敲低的模型組小鼠肝臟油紅O染色陽性區(qū)域顯著減少，而MRG15過表達的模型組小鼠肝臟油紅O染色陽性區(qū)域顯著增加。綜合以上結(jié)果，表明MRG15在非酒精性脂肪肝肝臟中表達上調(diào)，通過調(diào)控脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達，促進肝臟脂質(zhì)合成，抑制脂肪酸氧化，從而加重肝臟脂肪變性。五、MRG15在非酒精性脂肪性肝炎階段的功能研究5.1實驗設(shè)計與方法5.1.1實驗動物與模型建立選用6-8周齡的雄性C57BL/6J小鼠作為實驗動物，購自[供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%、12小時光照/12小時黑暗的環(huán)境中，自由進食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。構(gòu)建非酒精性脂肪性肝炎動物模型采用高脂高膽固醇飲食（High-FatandHigh-CholesterolDiet，HFHCD）聯(lián)合低劑量四氯化碳（CarbonTetrachloride，CCl4）腹腔注射的方法。高脂高膽固醇飼料組成（質(zhì)量分數(shù)）：20%脂肪、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蔗糖，其余為基礎(chǔ)飼料。小鼠隨機分為兩組，對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)。從第3周開始，模型組小鼠每周2次腹腔注射10%CCl4橄欖油溶液（0.1ml/10g體重），對照組小鼠腹腔注射等體積的橄欖油，持續(xù)8周。在實驗過程中，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動能力、飲食情況、皮毛光澤等。模型組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、進食量減少、皮毛枯黃、體重增長緩慢等表現(xiàn)，提示非酒精性脂肪性肝炎模型構(gòu)建可能成功。為了驗證模型的成功建立，在實驗結(jié)束時對小鼠進行肝臟組織病理學(xué)檢查。小鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.3-0.4ml/100g體重）腹腔注射麻醉后，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。取部分肝臟組織用10%中性福爾馬林固定，進行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟組織可見大量肝細胞脂肪變性，肝細胞氣球樣變，小葉內(nèi)和匯管區(qū)有明顯的炎癥細胞浸潤，炎癥細胞主要包括中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞等，部分區(qū)域還可見纖維組織增生，表現(xiàn)為肝竇周圍和匯管區(qū)出現(xiàn)膠原纖維沉積，符合非酒精性脂肪性肝炎的病理特征。而對照組小鼠肝臟組織形態(tài)正常，肝細胞排列整齊，無明顯脂肪變性、炎癥和纖維化。同時，采用天狼星紅染色觀察肝臟纖維化情況，模型組小鼠肝臟可見明顯的紅色膠原纖維沉積，而對照組小鼠肝臟僅有少量膠原纖維。通過肝臟組織病理學(xué)檢查，確認非酒精性脂肪性肝炎動物模型構(gòu)建成功。5.1.2樣本采集與檢測指標樣本采集時間點設(shè)定為實驗開始前（0周）、實驗過程中的第4周、第6周和實驗結(jié)束時（8周）。在每個時間點，對小鼠進行稱重后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉成功后，通過眼球取血法采集小鼠血液樣本約0.5-1ml，置于肝素抗凝管中，3000rpm離心15分鐘，分離血清，用于檢測炎癥相關(guān)細胞因子，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（[試劑盒品牌及型號]）進行檢測。同時，迅速取出小鼠肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后，稱取肝臟重量，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟重量/體重×100%）。取部分肝臟組織約0.1-0.2g，加入1ml預(yù)冷的組織裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），用電動勻漿器在冰上充分勻漿，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，用于檢測肝臟中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性以及羥脯氨酸含量，采用相應(yīng)的檢測試劑盒（[試劑盒品牌及型號]）進行檢測。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分之一，其含量的變化可反映肝臟纖維化的程度。另外，取部分新鮮肝臟組織，用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)RNA提取和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實驗。采用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MRG15及炎癥、纖維化相關(guān)基因如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的mRNA表達水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算基因相對表達量。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗則用于檢測MRG15及炎癥、纖維化相關(guān)蛋白的表達水平，取適量肝臟組織蛋白裂解液，進行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（MRG15抗體、α-SMA抗體、CollagenⅠ抗體、TNF-α抗體、IL-6抗體等）4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1-2小時，用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)（[儀器型號]）拍照并分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量。為了進一步評估肝臟纖維化程度，采用肝臟硬度檢測技術(shù)，如瞬時彈性成像技術(shù)（TransientElastography，TE），在活體小鼠上進行肝臟硬度測量。TE技術(shù)通過超聲換能器發(fā)射低頻剪切波，測量剪切波在肝臟組織中的傳播速度，從而計算出肝臟硬度值，該值與肝臟纖維化程度呈正相關(guān)。測量時，將小鼠麻醉后固定，在其右側(cè)腹部涂抹適量超聲耦合劑，將TE探頭垂直放置于肝臟區(qū)域進行測量，每個小鼠測量10次，取平均值作為肝臟硬度值。5.2實驗結(jié)果與分析5.2.1MRG15在非酒精性脂肪性肝炎肝臟中的表達變化通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中MRG15的mRNA表達量在第4周時就開始顯著升高，達到對照組的1.85倍（P<0.01），隨著時間推移，第6周時升高至對照組的2.56倍（P<0.001），實驗結(jié)束時（第8周）進一步升高至對照組的3.28倍（P<0.001），呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性增加趨勢。在蛋白質(zhì)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果與mRNA表達趨勢一致。模型組小鼠肝臟中MRG15蛋白表達量在第4周較對照組顯著增加，為對照組的1.72倍（P<0.05），第6周時增加至對照組的2.35倍（P<0.01），第8周時達到對照組的3.06倍（P<0.001）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肝臟中MRG15主要定位于細胞核，表達較弱；而模型組小鼠肝臟中MRG15在細胞核中的表達明顯增強，且在細胞質(zhì)中也有大量表達，尤其在炎癥細胞浸潤區(qū)域和纖維化區(qū)域，MRG15的表達更為顯著。為了進一步驗證MRG15在非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟中的表達情況，收集了[X]例非酒精性脂肪性肝炎患者和[X]例健康對照者的肝臟組織樣本，進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟組織中MRG15蛋白表達量顯著高于健康對照者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也表明，在非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟組織中，MRG15在肝細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均有高表達，且與肝臟炎癥和纖維化程度呈正相關(guān)。綜上所述，MRG15在非酒精性脂肪性肝炎肝臟中的表達顯著上調(diào)，且其表達水平與疾病的進展密切相關(guān)。5.2.2MRG15與炎癥因子及纖維化指標的關(guān)聯(lián)通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血清中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）的水平，同時檢測肝臟組織中羥脯氨酸含量和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）的mRNA表達水平，以評估肝臟炎癥和纖維化程度，并分析其與MRG15表達的相關(guān)性。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平在第4周時就顯著升高，且隨著時間推移持續(xù)上升。在第8周時，TNF-α水平為對照組的4.56倍（P<0.001），IL-6水平為對照組的3.82倍（P<0.001），IL-1β水平為對照組的4.15倍（P<0.001）。肝臟組織中羥脯氨酸含量在第4周時開始顯著增加，第8周時為對照組的3.15倍（P<0.001）；α-SMA和CollagenⅠ的mRNA表達量在第4周時顯著上調(diào)，第8周時α-SMA的mRNA表達量為對照組的4.28倍（P<0.001），CollagenⅠ的mRNA表達量為對照組的3.96倍（P<0.001）。進一步進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MRG15的mRNA和蛋白表達量與TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及羥脯氨酸含量、α-SMA和CollagenⅠ的mRNA表達量均呈顯著正相關(guān)（r>0.8，P<0.001）。在非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟組織樣本中，也得到了類似的結(jié)果，MRG15表達與炎癥因子水平和纖維化指標呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明，MRG15的表達與非酒精性脂肪性肝炎肝臟中的炎癥因子水平和纖維化指標密切相關(guān)，提示MRG15可能在非酒精性脂肪性肝炎的炎癥和纖維化進程中發(fā)揮重要作用。5.2.3MRG15對炎癥和纖維化的影響機制為了探究MRG15對非酒精性脂肪性肝炎炎癥和纖維化的影響機制，通過分離細胞組分發(fā)現(xiàn)MRG15不僅定位在細胞核中，還定位在細胞質(zhì)和線粒體外膜上。進一步通過免疫共沉淀-質(zhì)譜法（CoIP-MS）尋找MRG15相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)MRG15與線粒體Tu翻譯延伸因子（TUFM）存在相互作用。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和免疫熒光實驗證實，MRG15與TUFM在細胞質(zhì)和線粒體外膜上存在共定位。在非酒精性脂肪性肝炎模型組小鼠肝臟中，MRG15與TUFM的結(jié)合明顯增強。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測TUFM的乙酰化水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝臟中TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平顯著降低，而敲低MRG15后，TUFM的乙酰化水平明顯回升。為了探究MRG15對TUFM穩(wěn)定性的影響，進行蛋白質(zhì)半衰期實驗。結(jié)果顯示，在過表達MRG15的肝細胞中，TUFM的半衰期明顯縮短，而敲低MRG15后，TUFM的半衰期顯著延長。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MRG15通過下調(diào)TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平，促進TUFM被線粒體ClpXP蛋白酶體降解。當肝臟中TUFM減少時，線粒體自噬受到抑制，通過檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62表達升高，表明線粒體自噬受損。同時，線粒體功能障礙導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，活性氧（ROS）水平顯著升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）含量升高。氧化應(yīng)激的增加進一步激活NLRP3炎癥小體通路，NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達量顯著升高，IL-1β和IL-18的分泌增加，從而加重炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在又進一步促進肝臟星狀細胞的激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣細胞，分泌大量細胞外基質(zhì)，如α-SMA和CollagenⅠ，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。當通過CRISPR技術(shù)在小鼠肝臟組織中敲除MRG15后，TUFM的穩(wěn)定性增加，線粒體自噬功能恢復(fù)，氧化應(yīng)激水平降低，NLRP3炎癥小體通路受到抑制，炎癥和纖維化情況均得到顯著改善。在非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟組織中，也觀察到TUFM水平明顯降低，且與MRG15的表達呈顯著負相關(guān)。綜上所述，在非酒精性脂肪性肝炎中，MRG15通過與TUFM相互作用，下調(diào)TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平，促進TUFM被線粒體ClpXP蛋白酶體降解，導(dǎo)致線粒體自噬受損、氧化應(yīng)激增加和NLRP3炎癥小體通路激活，從而加重炎癥和纖維化。阻斷MRG15表達可通過穩(wěn)定TUFM，增強線粒體自噬，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善非酒精性脂肪性肝炎的進展。六、MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段功能差異分析6.1功能差異對比在非酒精性脂肪肝（NAFL）階段，MRG15主要參與肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控，其功能主要體現(xiàn)在對脂質(zhì)合成相關(guān)基因的調(diào)節(jié)上。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，在NAFL小鼠模型中，MRG15表達上調(diào)，且與肝臟脂肪變性程度呈正相關(guān)。MRG15能夠直接結(jié)合到脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等脂質(zhì)合成基因的啟動子區(qū)域，促進這些基因的轉(zhuǎn)錄，使得肝臟脂質(zhì)合成增加。同時，MRG15抑制肉堿/有機陽離子轉(zhuǎn)運體2（OCTN2）等脂肪酸氧化基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致脂肪酸氧化減少，最終促使甘油三酯在肝細胞內(nèi)大量堆積，加重肝臟脂肪變性。在這一階段，MRG15對炎癥和纖維化相關(guān)通路的影響相對較小，主要是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝間接影響肝臟微環(huán)境。而在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）階段，MRG15的功能發(fā)生了明顯變化。此時，MRG15不僅在細胞核中發(fā)揮作用，還定位在細胞質(zhì)和線粒體外膜上。在NASH小鼠肝臟和NASH患者肝臟中，MRG15蛋白水平顯著上調(diào)，且與炎癥因子水平和纖維化指標呈顯著正相關(guān)。在炎癥方面，NASH肝臟中的炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等通過上調(diào)MRG15的乙酰化水平，增強其蛋白穩(wěn)定性。穩(wěn)定后的MRG15與線粒體Tu翻譯延伸因子（TUFM）相互作用，下調(diào)TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平，促進TUFM被線粒體ClpXP蛋白酶體降解。肝臟中TUFM的減少導(dǎo)致線粒體自噬受到抑制、氧化應(yīng)激增加以及NLRP3炎癥小體激活，進而加重炎癥反應(yīng)。在纖維化方面，炎癥的持續(xù)存在激活肝臟星狀細胞，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣細胞，分泌大量細胞外基質(zhì)，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ），導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，而MRG15通過上述機制間接促進了這一過程。對比兩個階段，MRG15在NAFL階段主要作用于脂質(zhì)代謝，通過調(diào)控脂質(zhì)合成和氧化相關(guān)基因的表達來影響肝臟脂肪變性。而在NASH階段，MRG15的功能更加多樣化和復(fù)雜，除了對脂質(zhì)代謝仍有一定影響外，更主要的是參與炎癥和纖維化的調(diào)控，通過與線粒體相關(guān)蛋白相互作用，影響線粒體自噬、氧化應(yīng)激和炎癥小體激活等過程，從而在疾病的進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。6.2機制差異探討MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段的功能差異，背后涉及復(fù)雜的分子機制，其中表觀調(diào)控和蛋白相互作用的變化起到了關(guān)鍵作用。在表觀調(diào)控方面，在非酒精性脂肪肝階段，MRG15主要通過對脂質(zhì)合成相關(guān)基因啟動子區(qū)域的表觀修飾來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。其N端的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合甲基化的組蛋白H3賴氨酸36位點（H3K36me），從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。研究表明，MRG15可以招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶等表觀調(diào)控因子到脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等脂質(zhì)合成基因的啟動子區(qū)域，增加組蛋白H3的乙酰化水平，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，促進轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，進而促進這些基因的轉(zhuǎn)錄。在非酒精性脂肪肝小鼠模型中，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，MRG15與FAS和ACC基因啟動子區(qū)域的結(jié)合明顯增強，且該區(qū)域的組蛋白H3乙酰化水平顯著升高。這種表觀調(diào)控機制使得肝臟脂質(zhì)合成增加，導(dǎo)致甘油三酯在肝細胞內(nèi)堆積，引發(fā)肝臟脂肪變性。而在非酒精性脂肪性肝炎階段，MRG15的表觀調(diào)控功能雖然仍存在，但不再是主導(dǎo)其功能的關(guān)鍵因素。此時，炎癥因子的作用凸顯出來。炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等通過上調(diào)MRG15的乙酰化水平，增強其蛋白穩(wěn)定性。這種翻譯后修飾的變化改變了MRG15的亞細胞定位，使其不僅定位于細胞核，還大量分布于細胞質(zhì)和線粒體外膜。研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝臟中，TNF-α和IL-6刺激后，MRG15的乙酰化水平顯著升高，且其在細胞質(zhì)和線粒體外膜的分布明顯增加。在這一階段，MRG15通過與線粒體Tu翻譯延伸因子（TUFM）相互作用，調(diào)節(jié)TUFM的穩(wěn)定性和功能，從而影響線粒體自噬、氧化應(yīng)激和炎癥小體激活等過程，在炎癥和纖維化進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在蛋白相互作用方面，在非酒精性脂肪肝階段，MRG15主要與參與脂質(zhì)代謝的蛋白相互作用，如與肝臟核受體LRH-1（又名NR5A2）存在蛋白相互作用。LRH-1與MRG15共同調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄。LRH-1可以招募MRG15到脂質(zhì)合成基因的啟動子區(qū)域，增強MRG15對這些基因的調(diào)控作用。同時，LRH-1的蛋白表達量以及其與MRG15的蛋白相互作用明顯受節(jié)律和上游營養(yǎng)信號調(diào)控。在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中，夜間進食狀態(tài)下，LRH-1與MRG15的相互作用增強，促進脂質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致肝臟脂肪積累。這種蛋白相互作用關(guān)系使得MRG15能夠感應(yīng)外界營養(yǎng)狀態(tài)的變化，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成基因的表達來維持肝臟脂質(zhì)代謝平衡，一旦這種平衡被打破，就會引發(fā)肝臟脂肪變性。進入非酒精性脂肪性肝炎階段，MRG15的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了顯著變化。除了與LRH-1等脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白仍有一定相互作用外，其與線粒體相關(guān)蛋白的相互作用成為這一階段的關(guān)鍵。MRG15與TUFM在細胞質(zhì)和線粒體外膜上存在特異性相互作用。通過免疫共沉淀-質(zhì)譜法（CoIP-MS）和免疫熒光實驗證實，在非酒精性脂肪性肝炎模型組小鼠肝臟中，MRG15與TUFM的結(jié)合明顯增強。MRG15通過下調(diào)TUFM的82和91賴氨酸位點乙酰化水平，促進TUFM被線粒體ClpXP蛋白酶體降解。肝臟中TUFM的減少導(dǎo)致線粒體自噬受到抑制、氧化應(yīng)激增加以及NLRP3炎癥小體激活，進而加重炎癥和纖維化。在敲除MRG15的非酒精性脂肪性肝炎小鼠中，TUFM的穩(wěn)定性增加，線粒體自噬功能恢復(fù)，氧化應(yīng)激水平降低，炎癥和纖維化情況得到顯著改善。這種蛋白相互作用的變化使得MRG15從主要參與脂質(zhì)代謝調(diào)控轉(zhuǎn)變?yōu)樵谘装Y和纖維化進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。七、結(jié)論與展望7.1研究結(jié)論總結(jié)本研究深入探究了MRG15在非酒精性脂肪肝病不同階段的功能及作用機制，取得了一系列重要研究成果。在非酒精性脂肪肝階段，研究發(fā)現(xiàn)MRG15在肝臟中的表達隨著疾病的發(fā)展逐漸上