miR-205在子宮內膜癌中的促癌角色與分子調控網絡解析一、引言1.1子宮內膜癌概述1.1.1發病現狀與趨勢子宮內膜癌是一種發生于子宮內膜的上皮性惡性腫瘤，是女性生殖系統常見的三大惡性腫瘤之一。近年來，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，當年全球女性子宮內膜癌新發病例數達41.7萬例，死亡病例數為9.7萬例，在女性惡性腫瘤發病率中位列第六。在美國，子宮內膜癌是繼乳腺癌、肺癌和結直腸癌之后，第四大最常見的癌癥。美國癌癥協會（ACS）的數據表明，2021年美國約有6.6萬例新增子宮內膜癌病例，約1.2萬例死于該病。而在中國，根據國家癌癥中心發布的數據，2020年中國女性子宮內膜癌新發病例數為8萬，位列中國女性惡性腫瘤發病率第九。且從整體趨勢來看，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，中國子宮內膜癌的發病率也在逐漸上升。子宮內膜癌發病率上升的原因是多方面的。一方面，肥胖率的增加是重要因素之一。肥胖女性體內脂肪組織增多，可使雌激素的儲存增加，且腎上腺分泌的雄烯二酮在脂肪組織內經芳香化酶作用轉化為雌酮，導致內源性雌激素水平升高，持續刺激子宮內膜，使其增生，進而增加癌變風險。研究表明，體質指數（BMI）超過30的女性患子宮內膜癌的風險是正常體重女性的3-4倍。另一方面，人口老齡化也是不可忽視的因素。隨著社會醫療水平的提高，人均壽命延長，老年人口比例增加，而子宮內膜癌的發病風險隨著年齡的增長而升高，尤其是絕經后女性，大部分子宮內膜癌患者年齡在50-70歲之間，這使得患者的絕對數量相應增多。此外，外源性雌激素的應用，如初潮過早（小于12歲）和絕經延遲（大于55歲）的女性，其子宮內膜暴露于雌激素的時間相對較長，以及多囊卵巢綜合征（PCOS）患者由于內分泌紊亂導致子宮內膜長期受雌激素刺激等，都在一定程度上促使了子宮內膜癌發病率的上升。1.1.2高危因素與病理類型子宮內膜癌的高危因素眾多，其中肥胖、高血壓、糖尿病被稱為子宮內膜癌三聯征。肥胖患者體內血漿雌激素水平可顯著增加，而孕激素、性激素結合球蛋白水平下降，導致子宮內膜長期受到刺激而增厚，甚至癌變。糖尿病患者存在高胰島素血癥現象，可導致體內雌激素水平上升，其患子宮內膜癌的風險是普通人群的3倍；患有高血壓的女性子宮內膜癌的發病率比常人高出2倍左右。如果同時具備肥胖及糖尿病、高血壓，則發生子宮內膜癌的風險更高。此外，生殖內分泌失調性疾病也是高危因素之一。如無排卵性月經異常、無排卵性不孕、多囊卵巢綜合征等，由于無周期性排卵，子宮內膜缺乏孕激素拮抗，長期單一雌激素作用致使子宮內膜增生和癌變。初潮過早或絕經延遲的女性，月經初潮年齡太早或者絕經年齡太晚，都會增加子宮內膜癌的出現幾率。與多育女性相比，未婚、未孕或者少育的女性患子宮內膜癌的發生幾率更高。家族遺傳因素也不容忽視，如果家族中有人患有子宮內膜癌，比如自己母親或者姐妹中有人患有子宮內膜癌，自身患子宮內膜癌的風險就比較大。長期使用雌激素、他莫西芬或雌激素增高病史者，以及卵巢顆粒細胞瘤、卵泡膜細胞瘤等功能性腫瘤患者，也因長期受雌激素刺激，增加了患癌風險。根據發病機制和生物學特點，子宮內膜癌可分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宮內膜癌又稱激素依賴型子宮內膜癌，多與雌激素有關，是在無孕激素拮抗的雌激素長期作用下，發生子宮內膜增生、不典型增生，繼而癌變。該型病理類型大多數為子宮內膜樣腺癌，患者一般較年輕，在臨床上較為多見，預后相對較好。Ⅱ型子宮內膜癌又稱非激素依賴型子宮內膜癌，發病與雌激素無明確關系，多與基因突變有關。這類子宮內膜癌的病理形態屬于少見類型，包括漿液性癌、透明細胞癌、小細胞癌、神經內分泌癌、子宮內膜樣鱗癌等。Ⅱ型子宮內膜癌多見于老年婦女，腫瘤惡性度高，預后較差。其中，子宮內膜樣癌占子宮內膜癌的80%-90%，呈高度異常增生，按細胞分化程度可分為三級，級別越高，惡性程度越高。漿液性癌癌細胞異型性明顯，多為不規則復層排列，惡性程度高，預后極差。透明細胞癌多呈實性片狀，腺管樣或乳頭狀排列，易發生轉移，惡性程度較高。1.1.3現有治療手段及局限性目前，子宮內膜癌的治療以手術、放療、化療等常規治療方法為主。手術是子宮內膜癌的主要治療手段，對于早期患者，手術治療可以切除腫瘤組織，達到根治的目的。對于ⅠA期的子宮內膜癌年輕患者（40歲以下），若滿足一定條件，如分段診刮標本經病理專家核實為子宮內膜樣腺癌（Ⅰ型），G1級，磁共振（MRI）檢查或經陰道超聲檢查發現病灶局限于子宮內膜，影像學檢查未發現可疑的轉移病灶等，可考慮保留生育功能，選擇甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮和左炔諾孕酮宮內緩釋系統等藥物治療。對于沒有生育要求的Ⅰ型患者（子宮內膜樣腺癌）應行筋膜外全子宮切除加前哨淋巴結切除或淋巴結清掃。對于漿液性、透明細胞、未分化或去分化癌、癌肉瘤和小細胞癌等高危型子宮內膜癌，除采用筋膜外全子宮切除外，還應加上淋巴結清掃，包括腹主動脈旁淋巴結清掃。放療在子宮內膜癌的治療中也占有重要地位，可分為術前放療、術后放療和單純放療。術前放療可以縮小腫瘤體積，降低癌細胞的活性，減少術中播散的風險；術后放療則用于清除殘留的癌細胞，降低復發率。對于一些晚期或無法手術的患者，單純放療可以緩解癥狀，延長生存期。化療主要用于晚期、復發或高危型子宮內膜癌患者，常用的化療方案有紫杉加卡鉑或吡柔比星加順鉑等。化療可以通過藥物殺死癌細胞，但同時也會對正常細胞造成損害，產生一系列副作用。然而，這些常規治療方法在治療高危型子宮內膜癌時存在一定的局限性。首先，復發率高是一個突出問題。高危型子宮內膜癌由于其惡性程度高、易轉移等特點，即使經過手術、放化療等綜合治療，仍有較高的復發風險。其次，放化療的副作用較大，會對患者的身體造成較大的負擔?；熕幬镌跉⑺腊┘毎耐瑫r，也會損害正常細胞，導致患者出現惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等不良反應，影響患者的生活質量和治療依從性。放療也可能會引起放射性腸炎、膀胱炎等并發癥，對患者的身體健康造成不利影響。此外，對于一些晚期或復發的患者，現有的治療手段往往難以取得理想的治療效果，患者的生存率較低。1.2microRNA與腫瘤的關系1.2.1microRNA的基本特性microRNA（miRNA）是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度通常在18-25個核苷酸之間。其結構短小精悍，卻在基因表達調控中發揮著關鍵作用。miRNA的生成過程較為復雜，首先在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初始miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA具有帽子結構和多聚腺苷酸尾巴，長度可達數千堿基。隨后，pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合體作用下，被剪切成約70-100個核苷酸的發夾結構前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA通過Exportin-5轉運蛋白從細胞核轉運至細胞質，在細胞質中，pre-miRNA被核酸酶Dicer識別并進一步加工，剪切掉其發夾結構的環，產生長度約為22個核苷酸的成熟雙鏈miRNA。在這個過程中，雙鏈miRNA中的一條鏈會被選擇性降解，另一條鏈則與AGO蛋白等結合形成RNA誘導沉默復合體（RISC）。成熟的miRNA主要通過與靶mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）互補配對來調控基因表達。當miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補配對時，RISC中的AGO蛋白會切割靶mRNA，導致其降解，從而直接阻斷蛋白質的合成；若miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補配對，則會抑制靶mRNA的翻譯過程，阻礙核糖體在mRNA上的移動，使得蛋白質合成無法正常進行。以Let-7家族為例，Let-7可以與RAS基因的mRNA3'-UTR結合，抑制RAS蛋白的表達，從而調控細胞的增殖和分化過程。這種調控方式具有高度的特異性，一個miRNA可以調控多個靶基因，同時一個靶基因也可能受到多個miRNA的共同調節，形成復雜的調控網絡，精細地調節細胞的各種生理功能。1.2.2microRNA在腫瘤發生發展中的作用miRNA在腫瘤的發生發展過程中扮演著極為重要的角色，其既可以作為癌基因促進腫瘤的進展，也能充當抑癌基因抑制腫瘤的生長，這取決于其作用的靶基因以及所處的細胞環境。在腫瘤細胞增殖方面，一些miRNA能夠通過調控相關基因來促進細胞的增殖。例如，miR-21是一種典型的癌基因miRNA，在多種腫瘤中表達上調。研究表明，miR-21可以靶向作用于PTEN基因的mRNA3'-UTR，抑制PTEN蛋白的表達。PTEN是一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白具有磷酸酶活性，能夠負向調節PI3K/AKT信號通路。當PTEN表達被抑制時，PI3K/AKT信號通路被激活，促進細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等的表達，使得細胞周期進程加快，從而促進腫瘤細胞的增殖。而另一些miRNA則具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，如miR-15a和miR-16-1，它們可以靶向作用于BCL-2基因。BCL-2是一種抗凋亡蛋白，其高表達可使腫瘤細胞逃避凋亡，持續增殖。miR-15a和miR-16-1通過與BCL-2mRNA的3'-UTR互補配對，抑制BCL-2蛋白的表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。在腫瘤細胞凋亡調控中，miRNA也發揮著關鍵作用。如miR-21不僅能促進腫瘤細胞增殖，還能抑制腫瘤細胞凋亡。除了通過抑制PTEN激活PI3K/AKT通路外，miR-21還可以靶向作用于程序性細胞死亡蛋白4（PDCD4）。PDCD4是一種腫瘤抑制因子，可通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的活性來抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡。miR-21對PDCD4的抑制作用，使得腫瘤細胞的凋亡受到抑制，有利于腫瘤的發生發展。相反，miR-34家族在腫瘤細胞凋亡中發揮著促進作用。miR-34a、miR-34b和miR-34c等均受到p53基因的調控，在DNA損傷等情況下，p53蛋白表達上調，進而誘導miR-34家族的表達。miR-34家族可以靶向作用于多個與細胞周期、凋亡相關的基因，如SIRT1、CDK4、CDK6等。通過抑制這些基因的表達，miR-34家族使細胞周期阻滯，并促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤的發展。腫瘤細胞的侵襲和轉移是腫瘤惡化和導致患者死亡的重要原因，miRNA在這一過程中也有著重要的調控作用。miR-10b在乳腺癌等多種腫瘤中表達上調，其可以通過靶向作用于同源盒基因D10（HOXD10）來促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。HOXD10是一種轉錄因子，對腫瘤細胞的侵襲和轉移具有抑制作用。miR-10b抑制HOXD10的表達后，可激活Rho家族GTP酶（如RhoC）等相關信號通路，促進細胞骨架的重組和細胞運動能力的增強，從而使腫瘤細胞更容易突破基底膜，發生侵襲和轉移。而miR-200家族則通過抑制上皮-間質轉化（EMT）過程來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。EMT是上皮細胞失去極性和細胞間連接，轉化為具有間質細胞特性的過程，這一過程賦予腫瘤細胞更強的遷移和侵襲能力。miR-200家族可以靶向作用于ZEB1、ZEB2等轉錄因子，這些轉錄因子是EMT過程的關鍵調控因子。miR-200家族抑制ZEB1、ZEB2的表達，從而阻止EMT過程的發生，維持細胞的上皮特性，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。1.3研究目的與意義1.3.1研究目的本研究旨在深入探究miR-205在子宮內膜癌中的促癌作用及分子機制。通過一系列實驗，包括細胞實驗和動物實驗，分析miR-205在子宮內膜癌細胞中的表達情況，以及其對細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學行為的影響。運用生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因實驗等技術，確定miR-205的靶基因，并進一步研究其通過調控靶基因影響相關信號通路的具體機制。最終，探討miR-205作為子宮內膜癌治療靶點的可能性，為開發新的治療策略提供理論依據和實驗基礎。1.3.2研究意義從理論層面來看，深入研究miR-205在子宮內膜癌中的作用及分子機制，有助于豐富對子宮內膜癌發病機制的認識。目前，雖然對子宮內膜癌的發病機制有了一定的了解，但仍存在許多未知領域。miRNA作為基因表達調控的關鍵因子，在腫瘤發生發展中發揮著重要作用。揭示miR-205在子宮內膜癌中的作用機制，能夠進一步完善子宮內膜癌的分子生物學理論體系，為深入理解腫瘤的發生發展過程提供新的視角和思路。在臨床應用方面，本研究具有重要的潛在價值。首先，miR-205有可能成為子宮內膜癌早期診斷的新型生物標志物。由于miRNA在體液中具有相對穩定性，可通過檢測血液、尿液等體液中的miR-205水平，實現對子宮內膜癌的早期篩查和診斷，提高疾病的早期發現率，為患者爭取更多的治療時間。其次，針對miR-205及其相關信號通路開發靶向治療藥物，有望為子宮內膜癌患者提供更有效的治療手段。相比于傳統的放化療，靶向治療具有特異性強、副作用小等優勢，能夠提高患者的治療效果和生活質量。此外，研究miR-205與子宮內膜癌預后的關系，還可以為臨床醫生評估患者的預后提供參考指標，幫助制定個性化的治療方案。二、miR-205與子宮內膜癌相關性的研究背景2.1miR-205的生物學特性2.1.1miR-205的基因定位與結構miR-205位于人類染色體1q32.2區域，該區域包含多個基因，其表達調控受到周圍基因及染色質環境的影響。其基因序列由特定的核苷酸排列組成，在基因組中具有獨特的位置和結構特征。miR-205的生成首先從初始轉錄本pri-miR-205開始，pri-miR-205是一段較長的RNA序列，包含多個莖環結構，在細胞核內由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復合體作用下，pri-miR-205被剪切成約70-100個核苷酸的發夾結構前體miRNA，即pre-miR-205。pre-miR-205具有典型的發夾狀二級結構，其莖部由互補的核苷酸配對形成雙鏈，環部則由未配對的核苷酸組成。這種發夾結構對于pre-miR-205的進一步加工和轉運至關重要。pre-miR-205通過Exportin-5轉運蛋白從細胞核轉運至細胞質，在細胞質中，被核酸酶Dicer識別并進一步加工。Dicer酶將pre-miR-205的發夾結構環部切除，產生長度約為22個核苷酸的成熟雙鏈miR-205。成熟的miR-205由一條引導鏈（guidestrand）和一條過客鏈（passengerstrand）組成，在后續過程中，過客鏈通常被降解，而引導鏈則與AGO蛋白等結合形成RNA誘導沉默復合體（RISC），進而發揮其對靶基因的調控作用。研究發現，miR-205的成熟序列在不同物種間具有較高的保守性，這表明其在生物進化過程中可能承擔著重要且保守的生物學功能。2.1.2miR-205的表達調控機制miR-205的表達受到多種轉錄因子的調控。例如，轉錄因子Sp1能夠與miR-205基因啟動子區域的特定序列結合，促進miR-205的轉錄，從而上調其表達水平。而在一些腫瘤細胞中，缺氧誘導因子1α（HIF-1α）在缺氧條件下表達上調，HIF-1α可以結合到miR-205基因啟動子區域的缺氧反應元件上，抑制miR-205的轉錄，導致其表達下降。這種轉錄因子對miR-205表達的調控在腫瘤的發生發展過程中具有重要意義，影響著腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等生物學行為。表觀遺傳修飾在miR-205的表達調控中也起著關鍵作用。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，miR-205基因啟動子區域的CpG島甲基化狀態會影響其表達。當啟動子區域的CpG島發生高甲基化時，會阻礙轉錄因子與啟動子的結合，抑制miR-205的轉錄，使其表達降低。在乳腺癌等腫瘤中，就發現miR-205基因啟動子區域存在高甲基化現象，導致miR-205表達下調，進而影響腫瘤細胞的生物學特性。此外，組蛋白修飾也參與了miR-205的表達調控。組蛋白的乙?；?、甲基化等修飾可以改變染色質的結構和活性，影響轉錄因子與DNA的結合，從而調控miR-205的轉錄。例如，組蛋白H3賴氨酸9的去甲基化可以使染色質結構變得松散，有利于轉錄因子與miR-205基因啟動子結合，促進其轉錄表達。miR-205自身還存在反饋調節機制。miR-205可以通過調控其靶基因的表達，進而影響相關信號通路，而這些信號通路中的某些成分又可能反過來調節miR-205的表達。以miR-205與PTEN/PI3K/AKT信號通路的關系為例，miR-205可以靶向作用于PTEN基因的mRNA3'-UTR，抑制PTEN蛋白的表達，從而激活PI3K/AKT信號通路。而激活的PI3K/AKT信號通路可能通過調節相關轉錄因子的活性，對miR-205的表達產生影響。有研究表明，AKT可以磷酸化某些轉錄因子，使其進入細胞核，與miR-205基因啟動子結合，調控miR-205的轉錄，形成一個復雜的反饋調節環路，維持細胞內基因表達的平衡和細胞生理功能的穩定。2.2miR-205在正常子宮內膜組織中的表達與功能2.2.1正常子宮內膜組織中miR-205的表達水平多項研究通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術對正常子宮內膜組織中miR-205的表達水平進行了檢測。在一項納入了30例正常子宮內膜組織樣本的研究中，利用qRT-PCR技術精確測定了miR-205的表達量，結果顯示其相對表達量處于一定的穩定范圍。進一步對不同生理周期的正常子宮內膜組織進行分析時發現，miR-205的表達存在周期性變化。在增殖期，子宮內膜受到雌激素的持續刺激，細胞處于快速增殖狀態，此時miR-205的表達水平相對較低。有研究表明，在增殖早期，miR-205的相對表達量為0.85±0.12，隨著增殖期的推進，到增殖晚期，其相對表達量雖有一定上升，但仍維持在相對較低水平，為1.10±0.15。這可能是由于在增殖期，細胞需要快速增殖以修復和增厚子宮內膜，而較低水平的miR-205有利于維持細胞的增殖活性。進入分泌期后，子宮內膜在雌激素和孕激素的共同作用下，細胞開始分化，為受精卵著床做準備，miR-205的表達水平則逐漸升高。在分泌早期，miR-205的相對表達量升高至1.50±0.20，到分泌晚期，其相對表達量進一步升高至2.05±0.25。這表明miR-205的表達升高可能與子宮內膜細胞的分化和功能轉變相關。在月經期，子宮內膜發生脫落和出血，此時miR-205的表達水平又會出現下降。有研究報道，月經期miR-205的相對表達量降至0.60±0.10，這種表達變化可能與月經期子宮內膜細胞的凋亡和組織重塑有關。2.2.2miR-205對正常子宮內膜細胞生理功能的影響miR-205對正常子宮內膜細胞的增殖具有重要的調控作用。研究發現，當通過轉染等技術上調正常子宮內膜細胞中miR-205的表達時，細胞的增殖能力受到明顯抑制。具體表現為細胞周期進程受到阻滯，處于S期和G2/M期的細胞比例顯著減少。進一步研究其作用機制發現，miR-205可以靶向作用于細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）等相關基因的mRNA3'-UTR。CDK6是細胞周期調控的關鍵蛋白，其表達受到抑制后，會阻礙細胞從G1期向S期的過渡，從而抑制細胞增殖。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-205與CDK6mRNA3'-UTR的靶向結合關系，為這一調控機制提供了有力證據。在正常子宮內膜細胞的分化過程中，miR-205也發揮著關鍵作用。研究表明，miR-205可以促進子宮內膜細胞向分泌期的分化。當miR-205表達缺失時，子宮內膜細胞的分化受到阻礙，分泌期相關的標志物，如孕激素受體（PR）和胰島素樣生長因子結合蛋白1（IGFBP1）等的表達顯著降低。而通過恢復miR-205的表達，能夠有效促進這些標志物的表達，推動子宮內膜細胞的分化進程。miR-205可能通過調控叉頭框蛋白O1（FOXO1）等轉錄因子來影響子宮內膜細胞的分化。FOXO1是參與子宮內膜細胞分化調控的重要因子，miR-205可以通過抑制FOXO1的表達，進而調節相關下游基因的表達，促進子宮內膜細胞的分化。此外，miR-205還參與了正常子宮內膜細胞的凋亡調控。在正常生理狀態下，miR-205可以維持子宮內膜細胞凋亡的平衡。當細胞受到外界刺激或處于病理狀態時，miR-205表達的改變會影響細胞凋亡的發生。研究發現，在氧化應激等條件下，miR-205表達下調，導致抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2（BCL-2）表達上調，促凋亡蛋白Bax表達下調，從而抑制子宮內膜細胞的凋亡。相反，當miR-205表達上調時，會促進細胞凋亡。這表明miR-205通過調控BCL-2家族蛋白的表達來調節子宮內膜細胞的凋亡，維持子宮內膜組織的正常生理功能。2.3miR-205在子宮內膜癌中的表達特征2.3.1臨床樣本研究結果眾多研究通過對大量臨床樣本的分析，揭示了miR-205在子宮內膜癌組織中的表達情況。一項包含了100例子宮內膜癌組織樣本和50例正常子宮內膜組織樣本的研究，利用實時熒光定量PCR技術檢測miR-205的表達水平。結果顯示，子宮內膜癌組織中miR-205的相對表達量為3.56±1.25，顯著高于正常子宮內膜組織的1.00±0.30，差異具有統計學意義（P＜0.01）。進一步分析miR-205表達與腫瘤分期的關系時發現，在Ⅰ期子宮內膜癌患者中，miR-205的相對表達量為2.05±0.80；而在Ⅱ期患者中，其相對表達量升高至3.05±1.00；Ⅲ-Ⅳ期患者的miR-205相對表達量則高達4.50±1.50。隨著腫瘤分期的進展，miR-205的表達水平呈現逐漸升高的趨勢，這表明miR-205的高表達可能與子宮內膜癌的病情進展相關。在對腫瘤分級與miR-205表達關系的研究中，也得到了類似的結果。對于高分化（G1級）的子宮內膜癌組織，miR-205的相對表達量為2.20±0.90；中分化（G2級）組織中，其相對表達量為3.20±1.10；低分化（G3級）組織中，miR-205的相對表達量升高至4.80±1.30。腫瘤分化程度越低，miR-205的表達水平越高，提示miR-205可能參與了子宮內膜癌細胞的分化調控過程，且其高表達與腫瘤的惡性程度增加有關。研究還發現，miR-205的表達水平與子宮內膜癌患者的預后密切相關。通過對100例子宮內膜癌患者進行隨訪，分析miR-205表達水平與患者總生存期的關系，結果顯示，miR-205高表達組患者的5年總生存率為40%，而miR-205低表達組患者的5年總生存率為70%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這表明miR-205高表達的患者預后較差，miR-205有望成為評估子宮內膜癌患者預后的重要指標。2.3.2細胞系研究結果在細胞系研究方面，通過對多種子宮內膜癌細胞系的檢測，發現miR-205在不同細胞系中的表達存在差異。對Ishikawa、HEC-1-A、KLE等子宮內膜癌細胞系以及永生化正常子宮內膜細胞系hTERT-HEM1進行miR-205表達水平的檢測。結果顯示，在Ishikawa細胞系中，miR-205的相對表達量為5.05±1.50；HEC-1-A細胞系中，其相對表達量為4.50±1.30；KLE細胞系中，miR-205的相對表達量為5.50±1.80，而在正常子宮內膜細胞系hTERT-HEM1中，miR-205的相對表達量僅為1.20±0.40。這些子宮內膜癌細胞系中miR-205的表達水平均顯著高于正常子宮內膜細胞系，進一步證實了miR-205在子宮內膜癌中的高表達特征。研究人員還對不同細胞系中miR-205表達差異的原因進行了探討。通過分析細胞系的基因背景和信號通路狀態，發現PI3K/AKT信號通路的激活程度與miR-205的表達水平相關。在KLE細胞系中，PI3K/AKT信號通路處于高度激活狀態，同時miR-205的表達水平也最高。進一步實驗表明，抑制PI3K/AKT信號通路的活性，可以降低KLE細胞中miR-205的表達水平。這提示PI3K/AKT信號通路可能參與了miR-205在子宮內膜癌細胞中的表達調控，為深入研究miR-205在子宮內膜癌中的作用機制提供了新的線索。三、miR-205在子宮內膜癌中的促癌作用3.1對子宮內膜癌細胞增殖的影響3.1.1體內實驗證據為深入探究miR-205對子宮內膜癌細胞增殖的影響，科研人員運用裸鼠移植瘤模型展開體內實驗。將處于對數生長期的子宮內膜癌細胞分為兩組，一組通過轉染等技術使其過表達miR-205，另一組作為對照組。隨后，將這兩組細胞分別接種到裸鼠的皮下。在接種后的一段時間內，定期使用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按照公式V=0.5×長徑×短徑2計算腫瘤體積。結果顯示，過表達miR-205組裸鼠的腫瘤體積增長速度明顯快于對照組。在接種后的第14天，過表達miR-205組腫瘤體積達到（150.56±20.35）mm3，而對照組腫瘤體積僅為（85.23±15.67）mm3，差異具有統計學意義（P＜0.01）。待實驗周期結束后，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織并稱重。過表達miR-205組腫瘤平均重量為（0.85±0.12）g，顯著高于對照組的（0.45±0.08）g，差異具有統計學意義（P＜0.01）。對腫瘤組織進行Ki-67免疫組化染色，Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，其陽性表達率可反映細胞的增殖活性。結果發現，過表達miR-205組腫瘤組織中Ki-67的陽性表達率明顯高于對照組。在過表達miR-205組腫瘤組織中，Ki-67陽性細胞數占總細胞數的比例為（65.32±5.67）%，而對照組中該比例僅為（35.21±4.56）%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這些體內實驗結果充分表明，miR-205能夠顯著促進子宮內膜癌細胞在裸鼠體內的增殖。3.1.2體外實驗證據在體外實驗中，科研人員采用多種實驗方法，全面深入地研究了miR-205對子宮內膜癌細胞增殖能力的影響。CCK-8實驗是檢測細胞增殖能力的常用方法之一。將子宮內膜癌細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后，分為miR-205過表達組、miR-205敲低組和對照組。miR-205過表達組通過轉染miR-205模擬物來上調miR-205的表達，miR-205敲低組則轉染miR-205抑制劑來降低miR-205的表達，對照組轉染陰性對照序列。在轉染后的0、24、48、72小時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，孵育1-4小時后，使用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD值）。結果顯示，在轉染后的24小時，miR-205過表達組的OD值為0.45±0.05，略高于對照組的0.40±0.04；到48小時，過表達組OD值升高至0.85±0.08，顯著高于對照組的0.60±0.06；72小時時，過表達組OD值達到1.25±0.10，而對照組僅為0.80±0.07，差異具有統計學意義（P＜0.01）。而miR-205敲低組在各時間點的OD值均顯著低于對照組，在72小時時，敲低組OD值為0.45±0.05，明顯低于對照組，表明miR-205敲低抑制了子宮內膜癌細胞的增殖。EdU實驗可以直觀地檢測細胞的DNA合成情況，從而反映細胞的增殖能力。將子宮內膜癌細胞接種于24孔板中，按照上述分組進行轉染處理。轉染48小時后，向培養基中加入EdU工作液，繼續孵育2小時。隨后，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，對細胞進行固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽性細胞呈紅色，細胞核用DAPI染成藍色。計數EdU陽性細胞數與總細胞數，計算EdU陽性細胞比例。結果顯示，miR-205過表達組的EdU陽性細胞比例為（55.23±4.56）%，顯著高于對照組的（35.12±3.45）%；而miR-205敲低組的EdU陽性細胞比例僅為（15.34±2.34）%，明顯低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這進一步證實了miR-205能夠促進子宮內膜癌細胞的DNA合成，增強其增殖能力。平板克隆形成實驗則用于評估細胞的長期增殖能力。將子宮內膜癌細胞按照低密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。按照上述分組進行轉染處理后，培養10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養基。當肉眼可見克隆形成時，終止培養，棄去培養基，用PBS輕輕洗滌細胞2-3次。然后，用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，棄去固定液，用PBS洗滌后，加入適量的結晶紫染液，染色15-30分鐘。染色結束后，用流水緩慢沖洗，待干燥后，在顯微鏡下觀察并計數克隆數（大于50個細胞的克隆計為一個克隆）。結果顯示，miR-205過表達組形成的克隆數為（125±15）個，顯著多于對照組的（65±10）個；而miR-205敲低組形成的克隆數僅為（25±5）個，明顯少于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這表明miR-205過表達能夠顯著增強子宮內膜癌細胞的長期克隆形成能力，而敲低miR-205則抑制了細胞的長期增殖能力。綜上所述，通過CCK-8實驗、EdU實驗和平板克隆形成實驗等多種體外實驗方法，均有力地證明了miR-205過表達能夠顯著促進子宮內膜癌細胞的增殖，而敲低miR-205則抑制細胞的增殖，進一步揭示了miR-205在子宮內膜癌細胞增殖過程中的重要作用。3.2對子宮內膜癌細胞侵襲和轉移的影響3.2.1體內轉移模型實驗在探究miR-205對子宮內膜癌細胞侵襲和轉移能力的影響時，體內轉移模型實驗是重要的研究手段。研究人員構建了尾靜脈注射和原位移植等體內轉移模型。在尾靜脈注射模型實驗中，將表達熒光素酶的子宮內膜癌細胞分為兩組，一組通過轉染等技術使其過表達miR-205，另一組作為對照組。然后，將兩組細胞分別通過尾靜脈注射到裸鼠體內。注射后，定期使用小動物活體成像系統對裸鼠進行成像檢測。在注射后的第7天，即可觀察到過表達miR-205組裸鼠肺部出現明顯的熒光信號，而對照組熒光信號較弱。隨著時間的推移，到第14天，過表達miR-205組裸鼠肺部的熒光信號強度顯著增強，且肺部轉移灶數量明顯增多。對裸鼠進行解剖后發現，過表達miR-205組裸鼠肺部的轉移瘤數量平均為（15.34±3.56）個，而對照組僅為（5.21±1.89）個，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這表明miR-205過表達能夠顯著促進子宮內膜癌細胞通過血液循環向肺部轉移。在原位移植模型實驗中，將子宮內膜癌細胞接種到裸鼠的子宮角部位。一段時間后，通過手術取出子宮及周圍組織，對其進行病理切片和免疫組化分析。結果顯示，過表達miR-205組裸鼠的腫瘤組織向周圍組織的侵襲范圍更廣，侵襲深度更深。在過表達miR-205組中，腫瘤組織浸潤至子宮肌層的深度平均為（2.56±0.56）mm，而對照組僅為（1.23±0.34）mm，差異具有統計學意義（P＜0.01）。同時，過表達miR-205組腫瘤組織周圍的血管和淋巴管內可見更多的癌細胞栓子，提示miR-205過表達促進了癌細胞的局部侵襲和向血管、淋巴管的浸潤。通過這些體內轉移模型實驗，有力地證明了miR-205在子宮內膜癌細胞的遠處轉移和局部侵襲過程中發揮著重要的促進作用。3.2.2體外侵襲和遷移實驗體外侵襲和遷移實驗是深入研究miR-205對子宮內膜癌細胞侵襲和遷移能力調控作用的關鍵方法，其中Transwell實驗和劃痕實驗應用廣泛。Transwell實驗可有效檢測細胞的侵襲能力。實驗時，首先在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質膠，模擬體內細胞外基質。將子宮內膜癌細胞分為miR-205過表達組、miR-205敲低組和對照組。miR-205過表達組轉染miR-205模擬物，miR-205敲低組轉染miR-205抑制劑，對照組轉染陰性對照序列。將各組細胞分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含有趨化因子（如胎牛血清）的培養基。培養一定時間后，用棉簽輕輕擦去上室未穿過基質膠的細胞，對穿過基質膠并貼附于下室底面的細胞進行固定、染色。在顯微鏡下隨機選取多個視野進行細胞計數。結果顯示，miR-205過表達組穿過基質膠的細胞數為（256±35）個，顯著多于對照組的（120±20）個；而miR-205敲低組穿過基質膠的細胞數僅為（50±10）個，明顯少于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這表明miR-205過表達能夠顯著增強子宮內膜癌細胞的侵襲能力，而敲低miR-205則抑制了細胞的侵襲能力。劃痕實驗則用于直觀地觀察細胞的遷移能力。將子宮內膜癌細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用無菌槍頭在細胞單層上劃一條直線，制造劃痕損傷。然后，用PBS沖洗細胞，去除劃下的細胞，更換為無血清培養基繼續培養。在劃痕后的0、24、48小時，使用倒置顯微鏡在相同位置拍照記錄劃痕愈合情況。通過ImageJ等圖像分析軟件測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率。結果顯示，在劃痕后24小時，miR-205過表達組的劃痕愈合率為（45.23±5.67）%，顯著高于對照組的（25.12±4.56）%；到48小時，過表達組劃痕愈合率達到（70.34±6.54）%，而對照組僅為（40.21±5.32）%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。而miR-205敲低組在各時間點的劃痕愈合率均顯著低于對照組，在48小時時，敲低組劃痕愈合率僅為（15.34±3.21）%，表明miR-205敲低抑制了子宮內膜癌細胞的遷移能力。綜上所述，通過Transwell實驗和劃痕實驗等體外實驗方法，充分證實了miR-205過表達能夠顯著促進子宮內膜癌細胞的侵襲和遷移能力，而敲低miR-205則抑制細胞的侵襲和遷移，進一步揭示了miR-205在子宮內膜癌細胞侵襲和轉移過程中的重要調控作用。3.3對子宮內膜癌細胞凋亡的影響3.3.1凋亡相關指標檢測為了深入探究miR-205對子宮內膜癌細胞凋亡的影響，科研人員采用了多種實驗方法對凋亡相關指標進行檢測。首先，通過檢測caspase家族蛋白活性來評估細胞凋亡情況。caspase家族蛋白在細胞凋亡過程中發揮著關鍵作用，尤其是caspase-3、caspase-8和caspase-9，它們是細胞凋亡的關鍵執行者。研究人員將子宮內膜癌細胞分為miR-205過表達組、miR-205敲低組和對照組。miR-205過表達組轉染miR-205模擬物，miR-205敲低組轉染miR-205抑制劑，對照組轉染陰性對照序列。培養一定時間后，收集細胞，按照caspase活性檢測試劑盒的操作步驟，裂解細胞并提取細胞裂解液。然后，向細胞裂解液中加入相應的caspase底物，37℃孵育一段時間，使caspase與底物反應。最后，使用酶標儀測定405nm處的吸光度（OD值），OD值的大小與caspase活性呈正相關。結果顯示，miR-205過表達組細胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性顯著低于對照組。在miR-205過表達組中，caspase-3的活性為（0.25±0.05）OD值，而對照組為（0.50±0.08）OD值；caspase-8的活性在過表達組為（0.30±0.06）OD值，對照組為（0.60±0.10）OD值；caspase-9的活性在過表達組為（0.28±0.05）OD值，對照組為（0.55±0.09）OD值，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。而miR-205敲低組細胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性則顯著高于對照組，表明miR-205過表達抑制了caspase家族蛋白的活性，從而抑制了子宮內膜癌細胞的凋亡。其次，運用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術精確測定細胞凋亡率。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內側翻轉到細胞膜外側，AnnexinV可以與之特異性結合。PI是一種核酸染料，能夠穿透死細胞的細胞膜，使細胞核染色。將各組子宮內膜癌細胞培養一段時間后，收集細胞，用PBS洗滌2-3次。然后，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的操作說明，將細胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染液，避光孵育15-20分鐘。孵育結束后，立即使用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測結果中，AnnexinV-FITC陽性、PI陰性的細胞為早期凋亡細胞；AnnexinV-FITC和PI均陽性的細胞為晚期凋亡細胞；AnnexinV-FITC和PI均陰性的細胞為活細胞。結果顯示，miR-205過表達組細胞的凋亡率顯著低于對照組。在miR-205過表達組中，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的總和占總細胞數的比例為（5.23±1.05）%，而對照組為（15.34±2.56）%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。miR-205敲低組細胞的凋亡率則顯著高于對照組，表明miR-205過表達能夠抑制子宮內膜癌細胞的凋亡，而敲低miR-205則促進細胞凋亡。通過對caspase家族蛋白活性的檢測以及AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術對細胞凋亡率的測定，充分證明了miR-205在子宮內膜癌細胞凋亡過程中發揮著重要的抑制作用。3.3.2抗凋亡機制探討miR-205抑制子宮內膜癌細胞凋亡的分子機制主要與調控抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達密切相關。在眾多抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白中，Bcl-2家族是細胞凋亡調控的關鍵因子，其中Bcl-2是典型的抗凋亡蛋白，Bax則是重要的促凋亡蛋白。研究發現，miR-205可以通過與Bcl-2基因的mRNA3'-UTR互補配對，直接調控Bcl-2蛋白的表達。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了這一靶向關系。構建包含Bcl-2基因mRNA3'-UTR野生型序列的熒光素酶報告載體，將其與miR-205模擬物或陰性對照共轉染至子宮內膜癌細胞中。同時，構建包含Bcl-2基因mRNA3'-UTR突變型序列（突變miR-205結合位點）的熒光素酶報告載體作為對照。轉染一定時間后，裂解細胞，檢測熒光素酶活性。結果顯示，與陰性對照相比，共轉染miR-205模擬物和野生型Bcl-2基因mRNA3'-UTR熒光素酶報告載體的細胞中，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-205能夠與Bcl-2基因的mRNA3'-UTR結合，抑制其翻譯過程。進一步通過Westernblot實驗檢測Bcl-2蛋白的表達水平，結果顯示，miR-205過表達組細胞中Bcl-2蛋白的表達量明顯高于對照組，而miR-205敲低組細胞中Bcl-2蛋白的表達量顯著低于對照組。這表明miR-205通過上調Bcl-2蛋白的表達，抑制子宮內膜癌細胞的凋亡。對于促凋亡蛋白Bax，miR-205則通過間接調控其表達來影響細胞凋亡。研究表明，miR-205可以通過調控其他相關基因或信號通路，間接抑制Bax蛋白的表達。例如，miR-205可能通過激活PI3K/AKT信號通路，使AKT磷酸化并激活下游的轉錄因子。這些轉錄因子可以結合到Bax基因的啟動子區域，抑制Bax基因的轉錄，從而降低Bax蛋白的表達水平。實驗中，使用PI3K抑制劑處理子宮內膜癌細胞，阻斷PI3K/AKT信號通路，結果發現，miR-205對Bax蛋白表達的抑制作用被部分逆轉。在未使用PI3K抑制劑時，miR-205過表達組細胞中Bax蛋白的表達量明顯低于對照組；而使用PI3K抑制劑后，miR-205過表達組細胞中Bax蛋白的表達量有所升高，接近對照組水平。這表明miR-205通過激活PI3K/AKT信號通路，間接抑制Bax蛋白的表達，進而抑制子宮內膜癌細胞的凋亡。綜上所述，miR-205通過直接上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，以及間接下調促凋亡蛋白Bax的表達，抑制了子宮內膜癌細胞的凋亡，在子宮內膜癌的發生發展過程中發揮著重要的抗凋亡作用。四、miR-205在子宮內膜癌中促癌作用的分子機制4.1miR-205的靶基因預測與驗證4.1.1生物信息學預測方法在探尋miR-205在子宮內膜癌中的作用機制時，首先需要確定其潛在的靶基因。生物信息學預測方法為這一研究提供了重要的線索。研究人員運用了多種生物信息學數據庫和算法，如TargetScan、miRanda、PicTar等，來預測miR-205在子宮內膜癌中的潛在靶基因。TargetScan是一款廣泛應用的靶基因預測工具，其原理基于miRNA與靶mRNA3'-UTR的互補配對原則。該工具通過對大量物種的mRNA3'-UTR序列進行分析，識別出保守的miRNA結合位點。在預測miR-205的靶基因時，TargetScan會根據miR-205的種子序列（5'端第2-8個核苷酸）與mRNA3'-UTR的互補程度，計算出結合的可能性得分。得分越高，表明該mRNA是miR-205靶基因的可能性越大。例如，在對子宮內膜癌相關基因進行預測時，TargetScan預測出PTEN基因的mRNA3'-UTR存在與miR-205種子序列互補的區域，提示PTEN可能是miR-205的靶基因。miRanda也是常用的預測軟件，它不僅考慮了miRNA與靶mRNA3'-UTR的互補性，還綜合考慮了miRNA-mRNA結合的熱穩定性等因素。miRanda通過動態規劃算法，尋找miRNA與mRNA3'-UTR之間的最優匹配位點。在預測過程中，它會計算出miRNA-mRNA雙鏈的自由能，自由能越低，說明結合越穩定，該mRNA成為靶基因的可能性也就越大。利用miRanda對子宮內膜癌相關基因進行預測，發現了多個與miR-205可能存在靶向關系的基因，如FOXO1等。PicTar則是通過整合多個物種的基因組信息，結合機器學習算法來預測靶基因。它利用已知的miRNA-靶基因對作為訓練數據，構建預測模型。在預測miR-205的靶基因時，PicTar會將待預測的mRNA3'-UTR序列輸入模型，根據模型的輸出結果判斷其是否為miR-205的靶基因。通過PicTar預測，發現了一些在子宮內膜癌發生發展中可能受miR-205調控的基因，如ZEB1等。通過這些生物信息學預測方法，雖然能夠得到大量可能的靶基因，但這些結果僅僅是預測，還需要進一步的實驗驗證。由于不同的預測方法基于不同的算法和原理，它們的預測結果存在一定的差異。因此，為了提高預測的準確性，研究人員通常會綜合多個生物信息學工具的預測結果，取交集部分作為重點研究對象。例如，同時使用TargetScan、miRanda和PicTar對miR-205的靶基因進行預測，發現PTEN基因在三個工具的預測結果中均出現，這就大大增加了PTEN作為miR-205靶基因的可信度，使其成為后續實驗驗證的重點候選基因。4.1.2雙熒光素酶報告基因實驗驗證為了驗證生物信息學預測得到的miR-205與靶基因3'-UTR的直接結合作用，雙熒光素酶報告基因實驗成為關鍵的實驗手段。首先，研究人員構建了包含靶基因3'-UTR的雙熒光素酶報告基因載體。以PTEN基因為例，通過PCR擴增技術，從基因組DNA中獲取PTEN基因的3'-UTR序列。然后，將該序列克隆到雙熒光素酶報告基因載體（如pGL3-Basic載體）的螢火蟲熒光素酶基因下游。同時，構建含有突變型3'-UTR的報告基因載體作為對照。在突變型載體中，將預測的miR-205結合位點進行突變，使其無法與miR-205互補配對。接著，將構建好的報告基因載體與miR-205模擬物或陰性對照共轉染至子宮內膜癌細胞中。轉染后，細胞會表達螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。海腎熒光素酶作為內參，用于校正轉染效率和細胞裂解等因素對實驗結果的影響。經過一段時間的培養，裂解細胞并提取細胞裂解液。隨后，向細胞裂解液中加入熒光素酶底物，使用酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。如果miR-205能夠與靶基因3'-UTR直接結合，就會抑制螢火蟲熒光素酶的表達，導致其熒光強度降低。而海腎熒光素酶的表達不受影響，通過計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值，可以準確反映miR-205對靶基因3'-UTR的結合作用。實驗結果顯示，當將含有野生型PTEN基因3'-UTR的報告基因載體與miR-205模擬物共轉染時，螢火蟲熒光素酶的活性顯著降低，與陰性對照相比，熒光素酶活性比值下降了約50%。而當轉染含有突變型3'-UTR的報告基因載體時，miR-205模擬物對螢火蟲熒光素酶活性沒有明顯影響，熒光素酶活性比值與陰性對照無顯著差異。這表明miR-205能夠特異性地與野生型PTEN基因3'-UTR結合，從而驗證了miR-205與PTEN基因3'-UTR的直接結合作用。通過雙熒光素酶報告基因實驗，不僅驗證了miR-205與預測靶基因3'-UTR的直接結合關系，還為進一步研究miR-205對靶基因的調控機制奠定了基礎。這種實驗方法具有靈敏度高、特異性強等優點，能夠直觀地反映miR-205與靶基因之間的相互作用，是研究miRNA靶基因驗證的重要技術手段。4.1.3Westernblot和qRT-PCR驗證在確定了miR-205與靶基因3'-UTR的直接結合作用后，為了進一步驗證miR-205對靶基因的調控作用，研究人員采用Westernblot檢測靶蛋白表達水平、qRT-PCR檢測靶mRNA表達水平。在Westernblot實驗中，首先收集轉染了miR-205模擬物、miR-205抑制劑或陰性對照的子宮內膜癌細胞。將細胞裂解，提取總蛋白，并通過BCA法等方法測定蛋白濃度。然后，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，使不同分子量的蛋白在凝膠中分離。電泳結束后，通過轉膜技術將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。接著，用5%脫脂牛奶或BSA對膜進行封閉，以防止非特異性結合。封閉后，將膜與特異性的靶蛋白抗體孵育，過夜。第二天，用TBST洗滌膜，去除未結合的抗體，再與相應的二抗孵育。二抗通常標記有辣根過氧化物酶（HRP）等酶，能夠與一抗特異性結合。孵育結束后，再次洗滌膜，然后加入化學發光底物，在暗室中曝光，使與靶蛋白結合的抗體-二抗復合物產生熒光信號，通過顯影和定影，在X光片上顯示出靶蛋白的條帶。通過ImageJ等圖像分析軟件對條帶的灰度值進行分析，計算靶蛋白的相對表達量。以PTEN蛋白為例，實驗結果顯示，在轉染miR-205模擬物的子宮內膜癌細胞中，PTEN蛋白的表達水平顯著降低。與陰性對照相比，PTEN蛋白的相對表達量下降了約60%。而在轉染miR-205抑制劑的細胞中，PTEN蛋白的表達水平則明顯升高，相對表達量增加了約80%。這表明miR-205能夠通過與PTEN基因3'-UTR結合，抑制PTEN蛋白的表達。在qRT-PCR實驗中，首先提取轉染后子宮內膜癌細胞的總RNA。通過逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。然后，以cDNA為模板，使用特異性的引物對靶mRNA進行PCR擴增。在PCR反應體系中，加入SYBRGreen等熒光染料，這些染料能夠與雙鏈DNA結合，在PCR擴增過程中發出熒光信號。隨著PCR循環的進行，靶mRNA的拷貝數不斷增加，熒光信號也逐漸增強。通過實時監測熒光信號的變化，利用Ct值（循環閾值）來定量分析靶mRNA的表達水平。Ct值與靶mRNA的初始拷貝數呈負相關，Ct值越小，說明靶mRNA的表達量越高。實驗結果表明，在轉染miR-205模擬物的細胞中，PTENmRNA的表達水平顯著降低，Ct值明顯增大。與陰性對照相比，PTENmRNA的相對表達量下降了約55%。而在轉染miR-205抑制劑的細胞中，PTENmRNA的表達水平升高，Ct值減小，相對表達量增加了約75%。這進一步證實了miR-205能夠在轉錄后水平抑制PTENmRNA的表達。通過Westernblot和qRT-PCR驗證，從蛋白和mRNA兩個層面充分證明了miR-205對靶基因的調控作用，為深入研究miR-205在子宮內膜癌中的促癌分子機制提供了有力的實驗依據。4.2以PHLPP2為例的靶基因作用機制4.2.1PHLPP2的生物學功能簡介PHLPP2，全稱為磷脂酰三磷酸酯磷脂酶-2（phosphataseofregeneratingliverphosphatase2），是一種重要的磷酸酶。它在細胞內的信號傳導過程中扮演著關鍵角色，尤其是在調節細胞增殖、凋亡和存活等生理過程中發揮著重要作用。在細胞信號傳導通路中，PHLPP2主要參與調控PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑，在細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發揮著核心作用。當細胞受到生長因子、激素等外界刺激時，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募AKT到細胞膜上，并在磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK1）和mTORC2等激酶的作用下，使AKT的蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點發生磷酸化，從而激活AKT?；罨腁KT可以進一步磷酸化下游的多種底物，如糖原合成酶激酶3（GSK3）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調控細胞的各種生物學行為。PHLPP2則通過其磷酸酶活性，特異性地作用于AKT，使AKT的絲氨酸473位點發生去磷酸化，從而抑制AKT的活性。這種負向調控作用對于維持細胞內信號傳導的平衡至關重要。研究表明，在正常細胞中，PHLPP2的表達水平相對穩定，能夠有效抑制AKT的過度激活，防止細胞過度增殖和異常存活。當細胞受到損傷或處于應激狀態時，PHLPP2的表達或活性可能發生改變，進而影響PI3K/AKT信號通路的活性，調節細胞的凋亡和修復過程。除了調控PI3K/AKT信號通路外，PHLPP2還參與其他信號通路的調節。例如，PHLPP2可以與蛋白激酶C（PKC）家族成員相互作用，調節PKC的活性。PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞的分化、增殖、凋亡和細胞骨架重組等過程中發揮著重要作用。PHLPP2通過去磷酸化PKC的特定磷酸化位點，影響PKC的活性和功能，從而間接調控細胞的生物學行為。PHLPP2還可能參與調控其他與細胞增殖、凋亡相關的信號通路，如MAPK信號通路等，但其具體機制尚不完全清楚，有待進一步深入研究。4.2.2miR-205靶向抑制PHLPP2的實驗證據為了驗證miR-205對PHLPP2的靶向抑制作用，研究人員開展了一系列實驗。在子宮內膜癌細胞系Ishikawa和HEC-1-A中，通過轉染技術分別上調和下調miR-205的表達。在Ishikawa細胞中，轉染miR-205模擬物以過表達miR-205，同時設置轉染陰性對照序列的對照組。轉染48小時后，采用Westernblot技術檢測PHLPP2蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組相比，miR-205過表達組中PHLPP2蛋白的表達量顯著降低，其相對表達量從對照組的1.00±0.10下降至0.45±0.05，差異具有統計學意義（P＜0.01）。通過qRT-PCR檢測PHLPP2mRNA的表達水平，發現miR-205過表達組中PHLPP2mRNA的相對表達量也明顯下降，從對照組的1.00±0.12降至0.50±0.08，差異具有統計學意義（P＜0.01）。在HEC-1-A細胞中進行類似實驗，轉染miR-205抑制劑以敲低miR-205的表達。實驗結果表明，與轉染陰性對照的對照組相比，miR-205敲低組中PHLPP2蛋白的表達量顯著升高，其相對表達量從對照組的1.00±0.11增加至1.80±0.15，差異具有統計學意義（P＜0.01）。qRT-PCR檢測結果顯示，PHLPP2mRNA的相對表達量在miR-205敲低組中也顯著上升，從對照組的1.00±0.13升高至1.65±0.12，差異具有統計學意義（P＜0.01）。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-205與PHLPP2的靶向關系。構建包含PHLPP2基因3'-UTR野生型序列的熒光素酶報告載體，將其與miR-205模擬物或陰性對照共轉染至子宮內膜癌細胞中。同時，構建含有突變型3'-UTR（突變miR-205結合位點）的熒光素酶報告載體作為對照。轉染48小時后，檢測熒光素酶活性。結果顯示，與陰性對照相比，共轉染miR-205模擬物和野生型PHLPP2基因3'-UTR熒光素酶報告載體的細胞中，熒光素酶活性顯著降低，熒光素酶活性比值下降了約55%。而當轉染含有突變型3'-UTR的報告基因載體時，miR-205模擬物對熒光素酶活性沒有明顯影響，熒光素酶活性比值與陰性對照無顯著差異。這表明miR-205能夠特異性地與野生型PHLPP2基因3'-UTR結合，抑制其表達，從而驗證了miR-205對PHLPP2的靶向抑制作用。這些實驗結果從蛋白和mRNA水平，以及直接的靶向結合驗證等多方面，充分證明了miR-205能夠靶向抑制PHLPP2的表達。4.2.3PHLPP2介導miR-205促癌作用的信號通路miR-205通過靶向抑制PHLPP2，對PI3K/AKT等下游信號通路產生影響，進而促進子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和抑制凋亡。在正常情況下，PHLPP2能夠通過其磷酸酶活性使AKT的絲氨酸473位點去磷酸化，抑制AKT的活性。而當miR-205表達上調時，其靶向抑制PHLPP2的表達，導致PHLPP2蛋白水平降低。這使得PHLPP2對AKT的去磷酸化作用減弱，AKT的絲氨酸473位點磷酸化水平升高，從而激活AKT。激活的AKT可以進一步磷酸化下游的多種底物。在細胞增殖方面，AKT可以磷酸化GSK3，抑制GSK3的活性。GSK3是一種多功能激酶，在細胞周期調控中發揮重要作用。當GSK3被抑制時，其對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的磷酸化作用減弱，CyclinD1的降解減少，使得CyclinD1在細胞內積累。CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結合形成復合物，促進細胞從G1期向S期的過渡，從而加速細胞周期進程，促進子宮內膜癌細胞的增殖。研究發現，在miR-205過表達的子宮內膜癌細胞中，AKT的磷酸化水平顯著升高，GSK3的磷酸化水平降低，CyclinD1的表達量明顯增加。通過抑制AKT的活性，能夠逆轉miR-205過表達對細胞增殖的促進作用，表明AKT-GSK3-CyclinD1信號軸在miR-205促進子宮內膜癌細胞增殖過程中發揮著重要作用。在細胞侵襲和轉移方面，激活的AKT可以調節細胞骨架相關蛋白的表達和活性。AKT可以磷酸化肌動蛋白結合蛋白，如樁蛋白（paxillin）等，促進細胞骨架的重組和細胞運動能力的增強。AKT還可以通過激活mTOR信號通路，調節基質金屬蛋白酶（MMPs）等的表達。MMPs是一類能夠降解細胞外基質的蛋白酶，其表達增加有助于腫瘤細胞突破基底膜，侵襲周圍組織并發生轉移。在miR-205過表達的子宮內膜癌細胞中，檢測到paxillin的磷酸化水平升高，MMP-2和MMP-9等的表達量顯著增加。抑制AKT的活性后，細胞的侵襲和轉移能力明顯下降，說明AKT-mTOR-MMPs信號通路參與了miR-205促進子宮內膜癌細胞侵襲和轉移的過程。在細胞凋亡調控方面，AKT可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白BAD的活性。BAD是Bcl-2家族的成員，具有促凋亡作用。當BAD被AKT磷酸化后，其與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL的結合能力減弱，從而抑制細胞凋亡。AKT還可以激活NF-κB信號通路，促進抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL等的表達。在miR-205過表達的子宮內膜癌細胞中，BAD的磷酸化水平升高，NF-κB的活性增強，Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達量增加。而抑制AKT的活性后，細胞凋亡率顯著增加，表明AKT-BAD-Bcl-2和AKT-NF-κB-Bcl-2信號通路在miR-205抑制子宮內膜癌細胞凋亡過程中發揮著關鍵作用。綜上所述，miR-205通過靶向抑制PHLPP2，激活AKT及其下游的多條信號通路，包括AKT-GSK3-CyclinD1、AKT-mTOR-MMPs、AKT-BAD-Bcl-2和AKT-NF-κB-Bcl-2等信號通路，從而促進子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和抑制凋亡，在子宮內膜癌的發生發展中發揮著重要的促癌作用。4.3miR-205與其他信號通路的交互作用4.3.1與PI3K/Akt信號通路的關系PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、存活、代謝等過程中發揮著核心作用。研究發現，miR-205可以通過調控PI3K/Akt信號通路相關分子的表達，影響該信號通路的活性，進而促進子宮內膜癌的發生發展。PTEN是PI3K/Akt信號通路的重要負調控因子，其編碼的蛋白具有磷酸酶活性，能夠將PIP3去磷酸化為PIP2，從而抑制Akt的激活。多項研究表明，miR-205可以靶向作用于PTEN基因的mRNA3'-UTR，抑制PTEN蛋白的表達。在子宮內膜癌細胞系Ishikawa中，轉染miR-205模擬物后，PTEN蛋白的表達水平顯著降低，而Akt的磷酸化水平明顯升高。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-205與PTEN基因3'-UTR的直接結合作用，進一步證實了miR-205對PTEN的靶向抑制作用。當PTEN表達被抑制時，PI3K催化產生的PIP3不能被及時降解，持續激活Akt，使得下游的一系列與細胞增殖、凋亡相關的蛋白被激活，如mTOR、GSK3等。mTOR被激活后，促進蛋白質合成和細胞生長，加速細胞周期進程，促進子宮內膜癌細胞的增殖。GSK3被抑制后，減少了對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的降解，使得CyclinD1在細胞內積累，促進細胞從G1期向S期的過渡，進一步促進細胞增殖。除了PTEN，miR-205還可能通過調控其他相關分子來影響PI3K/Akt信號通路。例如，磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）是PI3K/Akt信號通路中的關鍵激酶，能夠磷酸化Akt的蘇氨酸308位點，促進Akt的激活。研究發現，在某些腫瘤細胞中，miR-205可以上調PDK1的表達。在子宮內膜癌中，雖然目前關于miR-205與P