HMGB1：肝臟慢性炎癥與纖維化進程中的關鍵角色與干預新靶點一、引言1.1研究背景與意義肝臟作為人體重要的代謝和解毒器官，對維持機體正常生理功能起著關鍵作用。肝纖維化作為多種慢性肝病發展至肝硬化的必經階段，嚴重威脅人類健康。肝纖維化是指細胞外的基質在肝組織內過度增生，且增生速度超過降解速度，導致纖維組織沉積，進而破壞肝臟的結構和功能。若肝纖維化持續發展，會加重成為肝硬化，使肝臟的解毒、分泌等基本功能遭受巨大影響，正常的肝細胞因缺氧而變性、壞死，形成惡性循環，最終導致肝功能逐漸喪失，甚至誘發肝癌。慢性炎癥在肝纖維化的發生發展過程中扮演著關鍵角色，是纖維化形成的前提及進展的驅動力。持續的外源性刺激或損傷引發慢性炎癥，可誘導炎性級聯反應，促使細胞外基質過度沉積和纖維瘢痕形成，進而加劇肝纖維化，甚至可能惡化為肝硬化和肝細胞癌。病毒、細菌、膽汁酸、酒精代謝物等肝毒性物質均可引發肝細胞損傷和死亡，損傷的肝細胞激活核因子-κB（NF-κB）等信號通路，誘導腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）和CC類趨化因子配體2（CCL2）等促炎細胞因子和趨化因子的釋放，誘發炎癥反應。同時，細胞壞死、壞死性凋亡以及細胞焦亡等形式的肝細胞死亡也會伴隨大量炎癥介質的釋放，加劇炎癥反應，進一步激活肝星狀細胞（HSC）和庫普弗細胞（Kupffer細胞），從而引發肝纖維化。研究表明，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者肝細胞的死亡程度與肝纖維化的嚴重程度密切相關。高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）是一類廣泛存在于哺乳動物真核細胞核內的DNA結合蛋白，由215個氨基酸組成，分子量為25-30kDa，主要存在于腦、肝、肺、心、脾、腎及淋巴組織中。正常情況下，HMGB1在細胞核內作為分子伴侶與DNA結合，參與維持穩定染色體結構、促進DNA折疊、翻譯、復制與損傷修復等重要活動。然而，當細胞受到損傷或處于應激狀態時，HMGB1會釋放到細胞外，作為一種損傷相關模式分子（Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs），與晚期糖基化終產物受體（ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts，RAGE）、Toll樣受體（Toll-LikeReceptors，TLRs）等細胞表面受體結合，激活免疫系統，誘發組織炎性因子釋放及炎性細胞浸潤，使組織持續處于炎性損傷狀態。近年來，HMGB1在肝臟疾病中的研究備受關注，其在肝纖維化進程中的作用逐漸成為研究熱點。壞死的肝細胞分泌的HMGB1能夠與TLR4、TLR9結合，激活NF-κB信號，促進炎癥反應，還可與單鏈DNA、脂多糖（LPS）、IL-1β等其他炎癥因子形成復合物，啟動炎癥反應。HMGB1對中性粒細胞在肝損傷部位的募集也有一定的影響。更為重要的是，HMGB1能夠激活HSC，促進α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）生成并抑制基質金屬蛋白酶-2的表達，增加細胞外基質的沉積，從而加重肝纖維化。深入研究HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用機制，不僅有助于揭示肝纖維化的發病機制，還可能為肝纖維化的臨床診斷和治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。1.2研究目的與方法本研究旨在深入探究高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在肝臟慢性炎癥與纖維化過程中的具體作用及其潛在機制，并評估HMGB1抑制劑對肝纖維化的治療效果，為肝纖維化的臨床治療提供新的理論依據和治療靶點。為實現上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：動物實驗：選取健康的實驗動物，如小鼠或大鼠，構建肝纖維化動物模型。采用經典的四氯化碳（CCl4）誘導法，通過腹腔注射一定濃度和劑量的CCl4，每周2-3次，持續數周，誘導肝纖維化的發生。同時設置正常對照組，給予等量的溶劑（如橄欖油）腹腔注射。實驗過程中，定期觀察動物的一般狀態，包括飲食、體重、活動等情況。在實驗結束時，處死動物，采集肝臟組織和血液樣本。對肝臟組織進行病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，觀察肝臟組織的病理變化，評估肝纖維化程度；采用免疫組織化學染色或免疫熒光染色技術，檢測肝臟組織中HMGB1、α-SMA、CollagenI等蛋白的表達水平，分析其與肝纖維化程度的相關性；通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中ALT、AST、TNFα、IL-6等炎癥因子和肝纖維化指標（如HA、LN、PCIII等）的含量，評估肝臟的損傷程度和炎癥狀態。細胞實驗：分離和培養原代肝細胞、肝星狀細胞（HSC）和庫普弗細胞（Kupffer細胞）。采用不同濃度的HMGB1刺激細胞，觀察細胞的增殖、活化和凋亡情況。利用CCK-8法檢測細胞增殖活性；通過免疫印跡（Westernblot）檢測α-SMA、CollagenI、NF-κB、p-NF-κB等蛋白的表達，探究HMGB1對HSC活化和炎癥信號通路的影響；采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，分析HMGB1對肝細胞和HSC凋亡的影響。此外，還可利用RNA干擾技術（RNAi）或基因編輯技術（如CRISPR/Cas9）敲低或敲除細胞中的HMGB1基因，觀察細胞功能和信號通路的變化，進一步驗證HMGB1的作用機制。分子生物學技術：運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）技術檢測相關基因的mRNA表達水平，如HMGB1、RAGE、TLRs、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等，分析其在肝臟慢性炎癥與纖維化過程中的表達變化。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測細胞或組織中相應蛋白的表達水平，進一步驗證基因表達的變化，并深入研究信號通路的激活情況。利用免疫共沉淀（Co-IP）技術探究HMGB1與其他蛋白之間的相互作用，揭示其在信號傳導中的作用機制。1.3國內外研究現狀在肝臟疾病領域，HMGB1的研究逐漸成為熱點，國內外學者針對其在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用開展了大量研究，取得了一系列重要成果。國外方面，有研究通過構建小鼠肝纖維化模型，利用基因敲除或RNA干擾技術降低HMGB1表達，發現肝臟炎癥細胞浸潤顯著減少，TNFα、IL-6等炎癥因子水平降低，同時α-SMA、CollagenI等纖維化相關指標也明顯下降，表明HMGB1在肝纖維化進程中發揮關鍵作用，其可能通過激活炎癥信號通路，促進炎癥細胞募集和炎癥因子釋放，進而推動肝纖維化發展。在細胞實驗中，使用重組HMGB1刺激肝星狀細胞（HSC），發現HSC的增殖和活化明顯增強，且伴隨著NF-κB信號通路的激活，進一步證實了HMGB1對HSC的活化作用及相關信號傳導機制。還有研究關注到HMGB1的翻譯后修飾，如乙酰化、磷酸化、氧化和乳酸化等，發現這些修飾可調控HMGB1的釋放、定位和活性，影響其在肝臟疾病中的作用，為深入理解HMGB1的功能提供了新視角。國內研究也取得了諸多進展。通過對慢性乙型肝炎患者的臨床研究發現，血清HMGB1水平與肝纖維化程度呈正相關，HMGB1水平越高，肝纖維化分期越嚴重，提示HMGB1可作為評估肝纖維化程度的潛在生物標志物。在機制研究方面，國內學者發現HMGB1與晚期糖基化終產物受體（RAGE）、Toll樣受體（TLRs）等受體結合后，激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，導致炎癥因子釋放和HSC活化，從而促進肝臟慢性炎癥和纖維化的發展。此外，國內還開展了關于HMGB1抑制劑的研究，如甜菜堿、二氫楊柳素和乙酰氨基葡萄糖等，動物實驗表明這些抑制劑能夠有效減緩肝纖維化進程，為肝纖維化的治療提供了新的策略和方向。盡管國內外在HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的研究中取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。一方面，目前對于HMGB1在肝臟疾病中的作用機制尚未完全明確，尤其是在復雜的體內微環境中，HMGB1與其他細胞因子、信號通路之間的相互作用網絡仍有待深入探究。另一方面，雖然HMGB1抑制劑在動物實驗中顯示出良好的抗纖維化效果，但從動物實驗到臨床應用仍面臨諸多挑戰，如藥物的安全性、有效性、最佳給藥劑量和途徑等問題，還需要進一步的臨床前和臨床研究來驗證。本研究將在前人研究的基礎上，進一步深入探討HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中的作用機制，通過多維度的實驗設計，全面分析HMGB1與相關細胞因子、信號通路的相互關系，并系統評估HMGB1抑制劑的治療效果和安全性，為肝纖維化的臨床治療提供更堅實的理論依據和更有效的治療靶點，有望在HMGB1相關研究領域取得新的突破。二、HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的理論基礎2.1HMGB1的結構與功能2.1.1HMGB1的結構特征高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，在哺乳動物中廣泛存在。人類HMGB1由位于13號染色體上的基因編碼，其蛋白產物由215個氨基酸組成，分子量約為30kDa。從結構上看，HMGB1包含三個主要結構域：兩個DNA結合結構域，即A盒（氨基酸1-85）和B盒（氨基酸86-163），以及一個富含酸性氨基酸的C末端結構域（氨基酸164-215）。A盒和B盒具有相似的三維結構，都呈現出L形的折疊方式，這種獨特的結構使其能夠緊密地與DNA結合。A盒主要通過識別和結合DNA的特定序列，如富含AT的區域，來參與DNA的相關活動。研究發現，A盒與DNA的結合可以影響DNA的構象，促進DNA的彎曲和纏繞，從而為其他轉錄因子和酶提供合適的結合位點，對基因轉錄的起始和調控起到重要作用。B盒則在與DNA的相互作用中發揮著更為廣泛的功能，它不僅能夠與DNA的雙螺旋結構相互作用，還能與一些損傷的DNA結構特異性結合，在DNA損傷修復過程中扮演關鍵角色。例如，當DNA受到紫外線、化學物質等損傷時，B盒能夠快速識別損傷位點，并招募相關的修復蛋白，啟動DNA修復機制，確保基因組的穩定性。C末端結構域則富含谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸，帶有大量的負電荷。這一結構域雖然不直接參與DNA的結合，但它對HMGB1的整體功能有著重要的調節作用。一方面，C末端結構域的負電荷特性使其能夠與帶正電荷的組蛋白相互作用，調節染色質的結構和功能。研究表明，C末端結構域可以通過與組蛋白H1相互作用，影響核小體的間距和排列方式，從而調控基因的可及性和轉錄活性。另一方面，C末端結構域在HMGB1的細胞外功能中也發揮著重要作用，它可以影響HMGB1與細胞表面受體的結合親和力和特異性，進而調節炎癥反應和免疫應答。此外，HMGB1還含有三個保守的半胱氨酸殘基（Cys23、Cys45和Cys106），這些半胱氨酸殘基的氧化還原狀態對HMGB1的功能具有重要影響。在不同的氧化還原環境下，半胱氨酸殘基可以形成不同的二硫鍵或保持還原狀態，從而使HMGB1呈現出不同的功能形式。例如，完全還原的HMGB1具有趨化活性，能夠吸引免疫細胞向炎癥部位遷移；而當Cys23和Cys45之間形成二硫鍵時，HMGB1則表現出細胞因子活性，能夠激活免疫細胞，促進炎癥因子的釋放。2.1.2HMGB1的細胞內外功能在正常生理狀態下，HMGB1主要定位于細胞核內，作為一種重要的DNA結合蛋白，參與維持染色體的結構和功能。它通過與DNA和組蛋白的相互作用，協助穩定核小體的結構，使DNA能夠緊密地包裝在細胞核內，同時限制誘變劑和光子等有害物質對DNA的損傷，保護基因組的完整性。HMGB1在細胞核內還參與了DNA的復制、轉錄和修復等關鍵過程。在DNA復制過程中，HMGB1可以與復制起始位點的DNA序列結合，促進DNA解旋酶和引物酶等復制相關蛋白的募集，從而啟動DNA的復制。在基因轉錄過程中，HMGB1通過與轉錄因子和啟動子區域的DNA相互作用，調節基因的轉錄起始和延伸。研究發現，HMGB1可以與某些轉錄因子形成復合物，增強轉錄因子與DNA的結合能力，促進基因的轉錄表達。此外，當DNA受到損傷時，HMGB1能夠迅速結合到損傷部位，招募DNA修復酶，如DNA聚合酶、連接酶等，參與DNA損傷的修復過程，確保細胞遺傳信息的準確性。當細胞受到損傷、炎癥或應激等刺激時，HMGB1會從細胞核釋放到細胞外，作為一種損傷相關模式分子（DAMP），參與機體的免疫反應和炎癥調節。細胞外的HMGB1可以與多種細胞表面受體結合，如晚期糖基化終產物受體（RAGE）、Toll樣受體（TLRs）等，激活細胞內的信號傳導通路，引發一系列的炎癥反應。HMGB1與RAGE結合后，能夠激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信號通路。MAPK信號通路的激活可以導致細胞內多種轉錄因子的活化，如c-Jun、c-Fos等，這些轉錄因子進入細胞核后，與相應的基因啟動子區域結合，促進炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等的基因轉錄和表達。NF-κB信號通路的激活則促使NF-κB從細胞質轉移到細胞核內，與炎癥相關基因的啟動子區域結合，進一步增強炎癥因子的表達，從而放大炎癥反應。HMGB1與TLRs的結合也能激活細胞內的信號傳導通路。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結合后，通過招募髓樣分化因子88（MyD88）和含TIR結構域的適配器誘導IFN-β（TRIF）等接頭蛋白，激活下游的NF-κB和干擾素調節因子3（IRF3）等信號通路。NF-κB的激活促進炎癥因子的產生，而IRF3的激活則誘導I型干擾素的表達，進一步調節免疫反應和炎癥過程。細胞外的HMGB1還具有促進細胞遷移和組織修復的功能。在組織損傷后，HMGB1可以吸引成纖維細胞、內皮細胞等向損傷部位遷移，促進細胞增殖和基質合成，加速組織修復和再生。但在慢性炎癥和纖維化等病理條件下，過度釋放的HMGB1會持續激活炎癥信號通路，導致炎癥反應失控，促進細胞外基質的過度沉積，最終導致組織纖維化的發生和發展。2.2肝臟慢性炎癥和纖維化的發病機制2.2.1肝臟慢性炎癥的發生機制肝臟慢性炎癥是多種因素共同作用的結果，其中病毒感染、酒精損傷、藥物性肝損傷以及自身免疫異常等是常見的誘發因素。這些因素通過不同的機制導致肝細胞損傷，進而引發炎癥反應。病毒感染是導致肝臟慢性炎癥的重要原因之一，其中乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染最為常見。HBV屬于嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒屬，其基因組為雙鏈環狀DNA。HBV通過血液、母嬰和性傳播等途徑進入人體后，與肝細胞表面的特異性受體結合，進而侵入肝細胞。在肝細胞內，HBV利用宿主細胞的轉錄和翻譯系統進行病毒基因組的復制和病毒蛋白的合成。HBV感染引發肝臟慢性炎癥的機制主要包括以下幾個方面：一方面，HBV感染可直接導致肝細胞損傷，病毒在肝細胞內的復制過程會干擾肝細胞的正常代謝和功能，引起肝細胞的變性、壞死。另一方面，機體的免疫反應在HBV感染所致的肝臟炎癥中起著關鍵作用。HBV感染后，機體的免疫系統被激活，產生針對HBV的特異性免疫細胞，如細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等。這些免疫細胞在識別和清除被HBV感染的肝細胞的過程中，會釋放多種細胞因子和炎癥介質，如干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，導致肝細胞損傷和炎癥反應的發生。研究表明，HBV特異性CTL可通過穿孔素/顆粒酶途徑和Fas/FasL途徑誘導被感染肝細胞的凋亡，同時釋放的細胞因子可激活肝竇內皮細胞、庫普弗細胞等，進一步加劇炎癥反應。HCV屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA。HCV主要通過血液傳播，如輸血、共用注射器等。HCV感染肝細胞后，在細胞內進行復制和組裝，其非結構蛋白可干擾肝細胞的正常生理功能，導致肝細胞損傷。與HBV感染類似，HCV感染引發的肝臟慢性炎癥也與免疫反應密切相關。HCV感染后，機體的固有免疫和適應性免疫均被激活。固有免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞等，可通過識別HCV感染相關的模式分子，釋放細胞因子和趨化因子，招募炎癥細胞到肝臟，啟動炎癥反應。適應性免疫方面，HCV特異性T淋巴細胞可識別并殺傷被HCV感染的肝細胞，但同時也會導致肝細胞的損傷和炎癥的加劇。此外，HCV感染還可誘導機體產生自身抗體，引發自身免疫反應，進一步加重肝臟炎癥。長期大量飲酒是導致酒精性肝病的主要原因，可引發肝臟慢性炎癥。酒精進入人體后，主要在肝臟進行代謝。酒精首先被乙醇脫氫酶（ADH）氧化為乙醛，乙醛再被乙醛脫氫酶（ALDH）進一步氧化為乙酸。在這個代謝過程中，會產生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。ROS可攻擊肝細胞內的生物大分子，如脂質、蛋白質和DNA，導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質損傷和基因突變等，從而引起肝細胞損傷。此外，乙醛還具有直接的細胞毒性作用，可與肝細胞內的蛋白質結合，形成乙醛-蛋白質加合物，影響蛋白質的正常功能，導致肝細胞代謝紊亂和損傷。酒精性肝病中炎癥反應的發生還與腸道菌群失調和內毒素血癥密切相關。長期飲酒可破壞腸道黏膜屏障的完整性，導致腸道通透性增加，腸道內的細菌及其代謝產物，如脂多糖（LPS）等，易位進入血液循環，引起內毒素血癥。LPS可與肝臟中的庫普弗細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）結合，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，誘導腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）等促炎細胞因子的釋放，引發肝臟炎癥反應。同時，酒精還可抑制肝臟中枯否細胞的吞噬功能，使其對LPS的清除能力下降，進一步加重炎癥反應。藥物性肝損傷是指由藥物或其代謝產物引起的肝臟損害，也是導致肝臟慢性炎癥的常見原因之一。許多藥物，如抗生素、解熱鎮痛藥、抗結核藥等，都可能引起藥物性肝損傷。藥物性肝損傷的發生機制較為復雜，主要包括藥物的直接毒性作用和免疫介導的肝損傷。藥物的直接毒性作用是指藥物及其代謝產物對肝細胞的直接損傷，這些物質可干擾肝細胞的正常代謝過程，如抑制蛋白質合成、破壞線粒體功能等，導致肝細胞死亡。免疫介導的肝損傷則是指藥物或其代謝產物作為半抗原，與肝細胞內的蛋白質結合，形成抗原復合物，激活機體的免疫系統，產生針對肝細胞的免疫反應，導致肝細胞損傷和炎癥。在免疫介導的藥物性肝損傷中，T淋巴細胞、B淋巴細胞以及細胞因子等均發揮重要作用。例如，藥物特異性T淋巴細胞可識別并殺傷被藥物修飾的肝細胞，同時釋放細胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，引發炎癥反應。自身免疫性肝炎是一種由自身免疫反應介導的肝臟慢性炎癥性疾病。其發病機制主要與機體免疫系統對肝細胞的錯誤識別和攻擊有關。在自身免疫性肝炎患者中，機體的免疫系統失去了對自身肝細胞的耐受性，產生了針對肝細胞的自身抗體和自身反應性T淋巴細胞。這些自身抗體和T淋巴細胞可識別肝細胞表面的抗原，激活補體系統，導致肝細胞損傷和炎癥反應的發生。自身免疫性肝炎的發生還與遺傳因素、環境因素等密切相關。遺傳因素決定了個體對自身免疫性肝炎的易感性，某些基因多態性與自身免疫性肝炎的發病風險增加有關。環境因素，如病毒感染、藥物、化學物質等，可能作為觸發因素，誘發自身免疫反應，導致自身免疫性肝炎的發生。在肝臟慢性炎癥過程中，炎癥細胞和炎癥因子發揮著關鍵作用。炎癥細胞主要包括庫普弗細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等，它們通過趨化作用聚集到炎癥部位，釋放多種炎癥因子，進一步加重炎癥反應。庫普弗細胞是肝臟內的固有巨噬細胞，約占肝臟非實質細胞的80%。當肝臟受到損傷或感染時，庫普弗細胞被激活，通過表面的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，識別病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs），激活細胞內的信號傳導通路，如NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，誘導促炎細胞因子的表達和釋放。研究表明，庫普弗細胞激活后可釋放大量的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子，這些細胞因子可招募更多的炎癥細胞到肝臟，形成炎癥級聯反應，導致肝細胞損傷和炎癥的加劇。中性粒細胞是最早到達炎癥部位的免疫細胞之一，在肝臟慢性炎癥中也發揮重要作用。中性粒細胞可通過釋放活性氧（ROS）、蛋白酶等物質，直接殺傷病原體和受損細胞，但同時也會對周圍的正常肝細胞造成損傷。此外，中性粒細胞還可釋放多種趨化因子和細胞因子，如白細胞介素8（IL-8）、巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）等，吸引其他炎癥細胞到炎癥部位，參與炎癥反應。淋巴細胞在肝臟慢性炎癥中也扮演著重要角色，其中T淋巴細胞可分為輔助性T淋巴細胞（Th）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。Th細胞可分泌細胞因子，調節免疫反應和炎癥過程。例如，Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，促進細胞免疫反應，增強炎癥反應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，調節體液免疫反應，抑制炎癥反應。CTL則可直接殺傷被病原體感染或發生病變的肝細胞，導致肝細胞損傷和炎癥的發生。單核細胞在炎癥刺激下可分化為巨噬細胞，進一步參與炎癥反應，分泌炎癥因子，促進炎癥的發展。炎癥因子是一類參與炎癥反應的小分子蛋白質，在肝臟慢性炎癥過程中，多種炎癥因子的表達和釋放發生改變，它們相互作用，形成復雜的炎癥網絡，共同調節炎癥反應的強度和進程。促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，在肝臟慢性炎癥中發揮著重要的促炎作用。TNF-α可激活NF-κB信號通路，誘導多種炎癥基因的表達，促進炎癥細胞的募集和活化，同時還可直接誘導肝細胞凋亡。IL-1β可刺激肝細胞、庫普弗細胞等產生其他炎癥因子，如IL-6、前列腺素E2（PGE2）等，加重炎癥反應。IL-6可促進B淋巴細胞的增殖和分化，產生抗體，同時也可激活T淋巴細胞，增強免疫反應和炎癥反應。此外，趨化因子，如CXC趨化因子配體8（CXCL8）、CC趨化因子配體2（CCL2）等，在炎癥細胞的募集和遷移中發揮關鍵作用。CXCL8可吸引中性粒細胞向炎癥部位遷移，CCL2則可招募單核細胞和T淋巴細胞到炎癥部位，參與炎癥反應。而抗炎細胞因子，如IL-10、轉化生長因子β（TGF-β）等，則可抑制炎癥反應，發揮抗炎作用。IL-10可抑制巨噬細胞和T淋巴細胞的活化，減少促炎細胞因子的產生，從而減輕炎癥反應。TGF-β可抑制免疫細胞的增殖和活化，促進細胞外基質的合成，在肝臟炎癥和纖維化過程中具有雙重作用。在炎癥早期，TGF-β可抑制炎癥反應；但在炎癥后期，TGF-β的持續高表達可促進肝纖維化的發生和發展。2.2.2肝纖維化的形成機制肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的一種修復反應，其本質是細胞外基質（ECM）在肝臟內的過度沉積和異常分布，導致肝臟組織結構和功能的破壞。肝星狀細胞（HSC）的激活、細胞外基質合成與降解失衡以及炎癥細胞和細胞因子的參與是肝纖維化形成的關鍵環節。肝星狀細胞（HSC）位于肝臟竇周間隙，是肝纖維化過程中產生細胞外基質的主要細胞。在正常肝臟中，HSC處于靜止狀態，主要儲存維生素A和參與肝臟的脂質代謝。然而，當肝臟受到持續的損傷刺激，如病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等，HSC會被激活，發生表型轉化，從靜止的維生素A儲存細胞轉變為具有增殖、收縮、遷移和分泌細胞外基質能力的肌成纖維細胞樣細胞。HSC的激活是一個復雜的過程，涉及多種細胞因子、生長因子和信號通路的參與。TGF-β是目前已知的最重要的促纖維化細胞因子之一，在HSC激活和肝纖維化形成過程中發揮核心作用。TGF-β主要由庫普弗細胞、活化的HSC和肝細胞等產生。當肝臟發生損傷時，受損細胞釋放的DAMPs和PAMPs可激活庫普弗細胞，使其分泌大量的TGF-β。TGF-β與HSC表面的TGF-β受體結合，激活Smad信號通路。TGF-β首先與TGF-β受體I（TβRI）和TGF-β受體II（TβRII）結合，形成異源二聚體復合物。TβRII具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可磷酸化TβRI，激活的TβRI進而磷酸化下游的Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復合物，轉移到細胞核內，與靶基因的啟動子區域結合，調節基因轉錄，促進HSC的激活和細胞外基質的合成。研究表明，TGF-β/Smad信號通路可上調α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）、纖連蛋白（Fibronectin）等細胞外基質相關基因的表達，促使HSC向肌成纖維細胞樣細胞轉化，增加細胞外基質的合成。血小板衍生生長因子（PDGF）也是促進HSC激活和增殖的重要細胞因子。PDGF主要由血小板、巨噬細胞、內皮細胞等產生。在肝臟損傷部位，PDGF被釋放并與HSC表面的PDGF受體（PDGFR）結合。PDGFR屬于受體酪氨酸激酶家族，與PDGF結合后，其酪氨酸激酶活性被激活，使受體自身磷酸化，進而激活下游的多條信號通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt等。這些信號通路的激活可促進HSC的增殖、遷移和存活，增強HSC的活化狀態。ERK信號通路的激活可調節細胞周期相關蛋白的表達，促進HSC從G1期進入S期，從而促進細胞增殖。PI3K/Akt信號通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態。除了TGF-β和PDGF外，其他細胞因子和生長因子，如胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等，也可通過不同的信號通路參與HSC的激活和肝纖維化的形成。IGF-1可通過激活PI3K/Akt和ERK信號通路，促進HSC的增殖和細胞外基質的合成。EGF可與HSC表面的EGF受體結合，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，促進HSC的增殖和遷移。FGF可通過激活磷脂酶Cγ（PLCγ）和蛋白激酶C（PKC）等信號通路，調節HSC的功能，促進肝纖維化的發展。細胞外基質（ECM）是由多種蛋白質和糖胺聚糖組成的復雜網絡，在維持肝臟正常結構和功能中起著重要作用。在正常肝臟中，ECM的合成和降解處于動態平衡狀態，以保證肝臟的正常生理功能。然而，在肝纖維化過程中，這種平衡被打破，細胞外基質的合成增加，而降解減少，導致ECM在肝臟內過度沉積。在肝纖維化時，活化的HSC是合成細胞外基質的主要細胞，其合成的細胞外基質成分主要包括膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖等。其中，膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，約占肝臟干重的5%-10%。在肝纖維化過程中，I型和III型膠原蛋白的合成顯著增加，它們在肝臟內形成粗大的纖維束，取代正常的肝小葉結構，導致肝臟纖維化。纖連蛋白是一種多功能的糖蛋白，可與細胞表面的整合素受體結合，參與細胞的黏附、遷移和增殖等過程。在肝纖維化時，纖連蛋白的表達增加，可促進HSC的黏附和遷移，同時也可與其他細胞外基質成分相互作用，形成穩定的纖維網絡，加重肝纖維化。層粘連蛋白是基底膜的主要成分之一，在維持細胞的形態和功能方面具有重要作用。在肝纖維化過程中，層粘連蛋白的表達和分布發生改變，可影響肝細胞和HSC的相互作用，促進肝纖維化的發展。蛋白聚糖是一類由核心蛋白和糖胺聚糖組成的大分子復合物，可調節細胞外基質的物理性質和生物學活性。在肝纖維化時，某些蛋白聚糖的表達增加，如硫酸軟骨素、硫酸肝素等，可促進細胞外基質的沉積和纖維化的發展。細胞外基質的降解主要依賴于基質金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的平衡調節。MMPs是一類鋅離子依賴性的內肽酶，可降解細胞外基質的各種成分。在肝臟中，主要的MMPs包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等。MMP-1主要降解I型和III型膠原蛋白；MMP-2和MMP-9可降解明膠、IV型膠原蛋白和纖連蛋白等。TIMPs是一組內源性的MMPs抑制劑，可與MMPs形成1:1的復合物，抑制MMPs的活性。在正常肝臟中，MMPs和TIMPs的表達和活性保持相對平衡，以維持細胞外基質的穩態。然而，在肝纖維化過程中，TIMPs的表達上調，而MMPs的表達和活性受到抑制，導致細胞外基質的降解減少。研究表明，TGF-β可通過上調TIMPs的表達，抑制MMPs的活性，從而促進細胞外基質的沉積。此外，其他細胞因子和生長因子，如PDGF、IGF-1等，也可通過調節MMPs和TIMPs的表達和活性，影響細胞外基質的降解。在肝纖維化的發生發展過程中，炎癥細胞和細胞因子發揮著重要的促進作用。炎癥細胞，如庫普弗細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等，在肝臟損傷部位聚集，通過釋放多種細胞因子和炎癥介質，參與肝纖維化的形成。庫普弗細胞作為肝臟內的固有免疫細胞，在肝纖維化過程中扮演著關鍵角色。當肝臟受到損傷時，庫普弗細胞被激活，釋放大量的促炎細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2等。這些細胞因子和趨化因子可招募更多的炎癥細胞到肝臟，形成炎癥微環境，促進HSC的激活和肝纖維化的發展。TNF-α可通過激活NF-κB信號通路，上調TGF-β和PDGF等促纖維化細胞因子的表達，間接促進HSC的激活和細胞外基質的合成。IL-1β可刺激HSC增殖和分泌細胞外基質，同時還可增強TGF-β的促纖維化作用。中性粒細胞在肝纖維化過程中也發揮一定作用。中性粒細胞可釋放活性氧（ROS）和蛋白酶等物質，直接損傷肝細胞和細胞外基質，同時還可釋放細胞因子和趨化因子，如IL-82.3HMGB1與肝臟慢性炎癥和纖維化的關聯2.3.1HMGB1在肝臟炎癥中的作用在肝臟炎癥過程中，HMGB1的釋放機制較為復雜，涉及多種細胞類型和信號通路。當肝臟受到病毒感染、酒精損傷、藥物毒性等刺激時，肝細胞會發生損傷和壞死，此時HMGB1會從細胞核中釋放到細胞外。研究表明，在乙型肝炎病毒（HBV）感染所致的肝臟炎癥模型中，受損的肝細胞內HMGB1的表達明顯上調，且大量HMGB1釋放到細胞外間隙。這一過程可能與細胞內的氧化應激反應有關，氧化應激可促使HMGB1從染色質上解離，進而釋放到細胞外。有研究發現，在酒精性肝病模型中，酒精代謝產生的大量活性氧（ROS）可導致肝細胞內氧化還原平衡失調，激活蛋白激酶C（PKC）等信號通路，促使HMGB1從細胞核轉位至細胞質，并最終釋放到細胞外。除了肝細胞，肝臟中的免疫細胞，如庫普弗細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等，在受到炎癥刺激時也會主動分泌HMGB1。庫普弗細胞作為肝臟內的固有巨噬細胞，在識別病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）后，會被迅速激活，通過核因子-κB（NF-κB）等信號通路誘導HMGB1的表達和分泌。在脂多糖（LPS）誘導的肝臟炎癥模型中，庫普弗細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）與LPS結合后，激活下游的MyD88依賴和非依賴信號通路，促使NF-κB活化并轉移到細胞核內，與HMGB1基因啟動子區域結合，促進HMGB1的轉錄和翻譯，進而使其分泌到細胞外。細胞外的HMGB1通過與多種細胞表面受體結合，激活炎癥細胞，引發一系列炎癥反應。晚期糖基化終產物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）是HMGB1的主要受體，它們在炎癥細胞表面廣泛表達。當HMGB1與RAGE結合后，可激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激酶被激活后，可磷酸化下游的轉錄因子，如c-Jun、c-Fos等，使其進入細胞核內與相應的基因啟動子區域結合，促進炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等的基因轉錄和表達。NF-κB信號通路的激活則促使NF-κB從細胞質中的抑制蛋白IκB上解離，進入細胞核內與炎癥相關基因的啟動子區域結合，進一步增強炎癥因子的表達，從而放大炎癥反應。研究表明，在肝臟炎癥模型中，阻斷RAGE-HMGB1信號通路可顯著降低炎癥因子的表達水平，減輕肝臟炎癥損傷。HMGB1與TLRs的結合同樣能激活炎癥信號通路。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結合后，通過招募髓樣分化因子88（MyD88）和含TIR結構域的適配器誘導IFN-β（TRIF）等接頭蛋白，激活下游的NF-κB和干擾素調節因子3（IRF3）等信號通路。NF-κB的激活促進炎癥因子的產生，而IRF3的激活則誘導I型干擾素的表達，進一步調節免疫反應和炎癥過程。此外，HMGB1還可與TLR2、TLR9等結合，激活相應的信號通路，促進炎癥反應。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，HMGB1與TLR4結合，激活NF-κB信號通路，導致大量炎癥因子釋放，加劇肝臟組織的損傷。HMGB1還能與其他炎癥因子相互作用，形成復雜的炎癥網絡，共同調節肝臟炎癥反應。研究發現，HMGB1可與IL-1β、TNFα等炎癥因子形成復合物，增強它們的生物學活性。在巨噬細胞中，HMGB1與IL-1β結合后，可協同激活NF-κB信號通路，促進更多炎癥因子的釋放。HMGB1還可通過調節趨化因子的表達，影響炎癥細胞的募集和遷移。在肝臟炎癥時，HMGB1可誘導CC類趨化因子配體2（CCL2）等趨化因子的表達，吸引單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞向肝臟炎癥部位聚集，加重炎癥反應。此外，HMGB1還可與其他損傷相關分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、線粒體DNA等相互作用，協同激活炎癥細胞，促進炎癥反應的發生和發展。2.3.2HMGB1在肝纖維化中的作用肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化發生發展的核心環節，而HMGB1在這一過程中發揮著關鍵的促進作用。正常情況下，HSC處于靜止狀態，主要儲存維生素A并參與肝臟的脂質代謝。當肝臟受到持續的損傷刺激時，受損肝細胞和炎癥細胞釋放的HMGB1可與HSC表面的受體結合，激活HSC，使其發生表型轉化，從靜止的維生素A儲存細胞轉變為具有增殖、收縮、遷移和分泌細胞外基質能力的肌成纖維細胞樣細胞。研究表明，HMGB1主要通過與晚期糖基化終產物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）結合，激活HSC內的多條信號通路，從而促進其活化。當HMGB1與RAGE結合后，可激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。MAPK信號通路的激活可促進HSC的增殖和遷移，通過調節細胞周期相關蛋白的表達，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，促使HSC從G1期進入S期，實現細胞增殖。PI3K/Akt信號通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態，同時還可促進HSC合成和分泌細胞外基質。在體外實驗中，用重組HMGB1刺激HSC，可顯著上調RAGE的表達，并激活MAPK和PI3K/Akt信號通路，導致HSC的增殖和活化明顯增強。HMGB1與TLRs的結合也能激活HSC。以TLR4為例，HMGB1與TLR4結合后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴和非依賴信號通路，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路。NF-κB活化后轉移到細胞核內，與相關基因的啟動子區域結合，促進炎癥因子和細胞外基質相關基因的表達。研究發現，在TLR4基因敲除的小鼠中，HMGB1對HSC的激活作用明顯減弱，表明TLR4在HMGB1介導的HSC活化過程中起著重要作用。此外，HMGB1還可通過與TLR2、TLR9等結合，激活相應的信號通路，促進HSC的活化。在肝纖維化過程中，細胞外基質（ECM）的代謝失衡是導致纖維組織沉積的關鍵因素，而HMGB1對ECM的代謝具有重要影響。活化的HSC是合成ECM的主要細胞，HMGB1可通過多種途徑促進HSC合成ECM成分，如膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白等。在基因轉錄水平，HMGB1激活的NF-κB、MAPK等信號通路可上調I型膠原蛋白（CollagenI）、纖連蛋白（Fibronectin）等ECM相關基因的表達。研究表明，在HMGB1刺激的HSC中，CollagenI和Fibronectin的mRNA表達水平顯著升高。在蛋白質合成和分泌水平，HMGB1可促進HSC內相關蛋白質的合成和分泌過程，增加ECM在細胞外的沉積。與此同時，HMGB1還可通過抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性和上調其組織抑制劑（TIMPs）的表達，減少ECM的降解。MMPs是一類鋅離子依賴性的內肽酶，可降解ECM的各種成分，在維持ECM穩態中起著重要作用。然而，在肝纖維化時，HMGB1的作用導致MMPs的活性受到抑制。研究發現，HMGB1可通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制MMP-2和MMP-9等的活性，減少ECM的降解。TIMPs是一組內源性的MMPs抑制劑，HMGB1可上調TIMPs的表達，如TIMPs-1、TIMPs-2等，使其與MMPs結合形成復合物，從而抑制MMPs的活性。在肝纖維化動物模型中，檢測到肝臟組織中TIMPs的表達明顯升高，且與HMGB1的表達水平呈正相關。隨著肝纖維化的發展，HMGB1持續發揮作用，不斷加重肝臟的纖維化程度。在肝纖維化早期，HMGB1激活HSC，促使其合成和分泌少量的ECM，此時肝臟組織開始出現輕度的纖維組織增生。隨著損傷和炎癥的持續存在，HMGB1持續釋放，大量激活HSC，使其不斷增殖并合成更多的ECM，同時進一步抑制ECM的降解，導致ECM在肝臟內過度沉積。這些過度沉積的ECM逐漸形成纖維瘢痕組織，取代正常的肝小葉結構，破壞肝臟的正常組織結構和功能。在肝纖維化晚期，肝臟組織出現廣泛的纖維化，形成假小葉，肝功能嚴重受損，可發展為肝硬化，甚至導致肝癌的發生。研究表明，在肝硬化患者的肝臟組織中，HMGB1的表達水平顯著高于正常肝臟組織，且與肝纖維化程度密切相關。三、HMGB1在肝臟慢性炎癥與纖維化中作用的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗動物與分組本實驗選用6-8周齡的健康雄性C57BL/6小鼠，體重在20-25g之間，購自[動物供應商名稱]。小鼠飼養于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，給予標準飼料和自由飲水，適應環境1周后開始實驗。將小鼠隨機分為3組，每組10只：正常對照組：給予橄欖油腹腔注射，每周2次，持續8周。橄欖油作為溶劑，不會對小鼠肝臟產生損傷，用于模擬正常生理狀態下的肝臟情況。模型組：采用經典的四氯化碳（CCl4）誘導法建立肝纖維化模型。將CCl4與橄欖油按1:3的體積比混合，配制成25%的CCl4橄欖油溶液，按5ml/kg的劑量腹腔注射，每周2次，持續8周。CCl4進入體內后，通過細胞色素P450系統代謝產生三氯甲基自由基，引發脂質過氧化反應，導致肝細胞損傷和炎癥反應，進而激活肝星狀細胞，促進細胞外基質合成，最終導致肝纖維化的發生。干預組：在給予CCl4橄欖油溶液腹腔注射的同時，給予HMGB1抑制劑[抑制劑名稱]進行干預。將抑制劑溶解于適量的溶劑中，按[具體劑量]mg/kg的劑量腹腔注射，每周2次，持續8周。該抑制劑能夠特異性地阻斷HMGB1與其受體的結合，從而抑制HMGB1相關信號通路的激活，以探究其對肝纖維化進程的影響。3.1.2實驗試劑與儀器實驗試劑：四氯化碳（CCl4）、橄欖油、HMGB1抑制劑[抑制劑名稱]、HMGB1抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、I型膠原蛋白（CollagenI）抗體、腫瘤壞死因子α（TNFα）抗體、白細胞介素6（IL-6）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、PMSF、Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒、ELISA試劑盒（包括小鼠HMGB1、TNFα、IL-6、HA、LN、PCIII等）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒等。實驗儀器：電子天平、低溫高速離心機、PCR儀、酶標儀、凝膠成像系統、熒光顯微鏡、石蠟切片機、包埋機、恒溫培養箱、超凈工作臺、移液器、低溫冰箱等。3.1.3實驗模型的建立采用四氯化碳（CCl4）誘導的小鼠肝纖維化模型。實驗前將CCl4與橄欖油按1:3的體積比充分混合，配制成25%的CCl4橄欖油溶液。小鼠稱重后，用1%戊巴比妥鈉溶液按50mg/kg的劑量腹腔注射進行麻醉。待小鼠麻醉后，使用1ml注射器抽取適量的25%CCl4橄欖油溶液，按5ml/kg的劑量經腹腔緩慢注射給藥。注射過程中注意避開小鼠的內臟器官，確保給藥的準確性和安全性。正常對照組小鼠則給予等量的橄欖油腹腔注射。每周注射2次，持續8周。在造模過程中，密切觀察小鼠的一般狀態，包括精神狀態、飲食、體重、活動等情況。隨著造模時間的延長，模型組小鼠逐漸出現精神萎靡、活動減少、飲食下降、體重增長緩慢等癥狀，提示肝臟損傷和纖維化的發生。實驗結束時，對小鼠進行處死，采集肝臟組織和血液樣本，用于后續的檢測分析。3.1.4檢測指標與方法血清生化指標檢測：實驗結束時，小鼠禁食12h后，采用摘眼球取血法采集血液樣本，將血液置于離心管中，3000r/min離心15min，分離血清。使用全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）的活性，以評估肝臟的損傷程度。ALT和AST是肝細胞內的重要酶類，當肝細胞受損時，它們會釋放到血液中，導致血清中ALT和AST活性升高。同時，采用ELISA試劑盒檢測血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子的含量，以及透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、III型前膠原（PCIII）等肝纖維化指標的水平。ELISA法是基于抗原-抗體特異性結合的原理，通過酶標記物與底物的反應，產生可檢測的信號，從而定量測定樣本中目標物質的含量。肝臟組織病理學檢測：取部分肝臟組織，用4%多聚甲醛固定24h以上，然后進行常規的石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm。分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色后，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織的形態結構，包括肝細胞的形態、肝小葉的完整性、炎癥細胞浸潤等情況。正常肝臟組織中，肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤；而肝纖維化模型組小鼠肝臟組織可見肝細胞變性、壞死，肝小葉結構破壞，炎癥細胞浸潤明顯。Masson染色用于顯示肝臟組織中的膠原纖維，膠原纖維呈藍色，肝細胞呈紅色。通過觀察膠原纖維的分布和含量，評估肝纖維化的程度。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，可見匯管區和中央靜脈周圍膠原纖維增生，形成纖維間隔，甚至出現假小葉結構。免疫組織化學染色：將石蠟切片進行脫蠟、水化處理后，采用免疫組織化學染色法檢測肝臟組織中HMGB1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）的表達。具體步驟如下：首先，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性；然后，用正常山羊血清封閉1h，減少非特異性染色；接著，分別加入一抗（HMGB1抗體、α-SMA抗體、CollagenI抗體），4℃孵育過夜；次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG或HRP標記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育1h；最后，用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在光學顯微鏡下觀察，陽性表達呈棕黃色，根據陽性細胞的數量和染色強度進行半定量分析。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、α-SMA、CollagenI的表達均明顯增強，提示HMGB1在肝纖維化過程中可能促進了HSC的活化和細胞外基質的合成。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測：取部分肝臟組織，加入Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作說明，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行擴增，檢測HMGB1、RAGE、TLR4、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等基因的mRNA表達水平。PCR反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。以β-actin作為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目標基因的相對表達量。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、RAGE、TLR4、TNFα、IL-6、α-SMA、CollagenI等基因的mRNA表達水平均顯著高于正常對照組，進一步證實了HMGB1在肝臟慢性炎癥和纖維化過程中的重要作用。蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測：取肝臟組織，加入含蛋白酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后12000r/min離心15min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入一抗（HMGB1抗體、α-SMA抗體、CollagenI抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體等），4℃孵育過夜；次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG或HRP標記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育1h；最后，用ECL發光液顯色，凝膠成像系統拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目標蛋白的相對表達量。通過Westernblot檢測，可進一步驗證免疫組織化學和RT-qPCR的結果，同時探究HMGB1對相關信號通路的影響。在肝纖維化模型組小鼠肝臟組織中，HMGB1、α-SMA、CollagenI、p-NF-κB等蛋白的表達均明顯上調，表明HMGB1可能通過激活NF-κB信號通路，促進HSC的活化和細胞外基質的合成。3.2實驗結果3.2.1HMGB1在肝臟組織中的表達變化免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中HMGB1主要定位于細胞核，呈弱陽性表達，陽性細胞數量較少，染色強度較弱。在模型組中，隨著CCl4誘導時間的延長，肝臟組織中HMGB1的表達逐漸增強。從第2周開始，可見肝細胞和肝星狀細胞中HMGB1表達上調，陽性細胞數量增多，染色強度加深；至第4周，HMGB1在匯管區和中央靜脈周圍的肝細胞及炎癥細胞中均有明顯表達；到第8周，整個肝臟組織中HMGB1陽性表達廣泛分布，肝細胞、肝星狀細胞、炎癥細胞等均呈現強陽性染色，表明HMGB1的表達與肝纖維化的進展密切相關。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）進一步檢測肝臟組織中HMGB1蛋白的表達水平，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中HMGB1蛋白表達水平較低。模型組小鼠在CCl4誘導4周后，HMGB1蛋白表達水平開始顯著升高，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；誘導8周時，HMGB1蛋白表達水平進一步升高，約為正常對照組的3倍（P<0.01）。而干預組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，肝臟組織中HMGB1蛋白表達水平明顯降低，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測結果表明，正常對照組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達水平相對穩定。模型組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達水平在CCl4誘導2周后開始上升，4周時顯著高于正常對照組（P<0.05），8周時達到高峰，約為正常對照組的4倍（P<0.01）。干預組小鼠肝臟組織中HMGB1mRNA表達水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組，說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制HMGB1基因的轉錄水平。3.2.2HMGB1對炎癥因子表達的影響ELISA檢測結果顯示，正常對照組小鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等炎癥因子含量較低。模型組小鼠在CCl4誘導4周后，血清中TNFα、IL-6含量顯著升高，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；誘導8周時，TNFα、IL-6含量進一步升高，分別約為正常對照組的5倍和4倍（P<0.01），表明肝纖維化過程中炎癥反應逐漸加重。干預組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，血清中TNFα、IL-6含量明顯降低，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組。這說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制炎癥因子的釋放，減輕肝臟的炎癥反應，但不能完全恢復至正常水平。通過RT-qPCR檢測肝臟組織中TNFα、IL-6等炎癥因子基因的mRNA表達水平，結果與ELISA檢測結果一致。正常對照組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達水平較低。模型組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達水平在CCl4誘導2周后開始升高，4周時顯著高于正常對照組（P<0.05），8周時達到高峰，分別約為正常對照組的6倍和5倍（P<0.01）。干預組小鼠肝臟組織中TNFα、IL-6mRNA表達水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組，進一步證實了HMGB1抑制劑對炎癥因子基因轉錄的抑制作用。3.2.3HMGB1對纖維化相關指標的影響血清學檢測結果顯示，正常對照組小鼠血清中透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、III型前膠原（PCIII）等肝纖維化指標含量較低。模型組小鼠在CCl4誘導4周后，血清中HA、LN、PCIII含量顯著升高，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；誘導8周時，HA、LN、PCIII含量進一步升高，分別約為正常對照組的4倍、3倍和3.5倍（P<0.01），表明肝纖維化程度逐漸加重。干預組小鼠在給予HMGB1抑制劑處理后，血清中HA、LN、PCIII含量明顯降低，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組。這說明HMGB1抑制劑能夠有效抑制肝纖維化指標的升高，延緩肝纖維化的進程，但不能完全阻止肝纖維化的發生。肝臟組織病理學檢測結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊，匯管區和中央靜脈周圍無明顯膠原纖維沉積，Masson染色可見少量藍色膠原纖維。模型組小鼠在CCl4誘導8周后，肝小葉結構破壞，肝細胞變性、壞死，匯管區和中央靜脈周圍大量膠原纖維增生，形成纖維間隔，部分區域可見假小葉形成，Masson染色可見大量藍色膠原纖維沉積。干預組小鼠肝臟組織損傷程度較模型組明顯減輕，肝小葉結構相對完整，膠原纖維增生減少，纖維間隔變細，假小葉形成數量減少，Masson染色可見藍色膠原纖維沉積明顯減少。免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原蛋白（CollagenI）表達較弱，陽性細胞數量較少。模型組小鼠在CCl4誘導8周后，肝臟組織中α-SMA、CollagenI表達明顯增強，陽性細胞數量增多，主要分布于匯管區、中央靜脈周圍及纖維間隔處。干預組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI表達較模型組明顯減弱，陽性細胞數量減少，表明HMGB1抑制劑能夠抑制肝星狀細胞的活化和細胞外基質的合成。通過Westernblot檢測肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白的表達水平，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白表達水平較低。模型組小鼠在CCl4誘導8周后，α-SMA、CollagenI蛋白表達水平顯著升高，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。干預組小鼠肝臟組織中α-SMA、CollagenI蛋白表達水平在給予抑制劑處理后明顯下降，與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），但仍高于正常對照組，進一步驗證了HMGB1抑制劑對肝纖維化相關蛋白表達的抑制作用。四、HMGB1影響肝臟慢性炎癥與纖維化的作用機制4.1HMGB1與炎癥信號通路的相互作用在肝臟慢性炎癥與纖維化的病理進程中，HMGB1與炎癥信號通路之間存在著復雜且緊密的相互作用，這一過程涉及多種細胞類型和分子機制，其中以HMGB1通過與TLR4、RAGE等受體結合進而激活NF-κB等炎癥信號通路最為關鍵。當肝臟遭受損傷或處于應激狀態時，肝細胞、庫普弗細胞等會釋放HMGB1。以病毒感染引發的肝臟炎癥為例，乙型肝炎病毒（HBV）感染肝細胞后，肝細胞會因病毒的復制和免疫攻擊而受損，此時細胞內的HMGB1會從細胞核轉位至細胞質，并最終釋放到細胞外。在酒精性肝病中，酒精代謝產生的大量活性氧（ROS）可導致肝細胞內氧化還原失衡，促使HMGB1從染色質上解離并釋放。細胞外的HMGB1可與多種細胞表面受體結合，其中TLR4和RAGE是其主要的受體。在肝臟中，庫普弗細胞、肝星狀細胞（HSC）等細胞表面均廣泛表達TLR4和RAGE。當HMGB1與TLR4結合時，會引發一系列復雜的分子事件。首先，HMGB1與TLR4的胞外結構域特異性結合，導致TLR4發生構象變化。這種構象變化促使TLR4招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過其死亡結構域與TLR4的TIR結構域相互作用，形成MyD88-TLR4復合物。隨后，MyD88會招募IL-1受體相關激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1和IRAK4。IRAK4被激活后，會磷酸化IRAK1，使其從MyD88-TLR4復合物中解離，并進一步激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1進而激活IκB激酶（IKK）復合物，IKK復合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。IKKβ會磷酸化IκBα，使其從NF-κB/IκBα復合物中解離。被釋放的NF-κB（主要是p65/p50異二聚體）會發生核轉位，進入細胞核后與炎癥相關基因的啟動子區域結合，如腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL-6）等基因的啟動子，啟動這些基因的轉錄，從而促進炎癥因子的表達和釋放，加劇肝臟炎癥反應。在脂多糖（LPS）誘導的肝臟炎癥模型中，LPS作為TLR4的經典配體，與HMGB1協同作用，可顯著增強NF-κB信號通路的激活。研究發現，當同時給予LPS和HMGB1刺激時，肝臟組織中TNFα、IL-6等炎癥因子的表達水平明顯高于單獨給予LPS或HMGB1刺激時的水平。這表明HMGB1與TLR4的結合能夠放大炎癥信號，使炎癥反應更加劇烈。HMGB1與RAGE的結合同樣能激活炎癥信號通路。RAGE屬于免疫球蛋白超家族成員，其胞外結構域包含多個免疫球蛋白樣結構域，能夠特異性地識別和結合HMGB1。當HMGB1與RAGE結合后，會激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路和NF-κB信號通路。在MAPK信號通路中，HMGB1-RAGE結合會導致RAGE招募含有Src同源2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），SHP-2進而激活Ras蛋白。Ras蛋白激活后，會依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，最終使ERK磷酸化并進入細胞核，磷酸化并激活一系列轉錄因子，如c-Jun、c-Fos等，這些轉錄因子與相應的基因啟動子區域結合，促進炎癥因子的基因轉錄和表達。在NF-κB信號通路方面，HMGB1與RAGE結合還可通過激活PI3K/Akt信號通路間接激活NF-κB。具體來說，HMGB1-RAGE結合會激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3會招募并激活Akt，Akt通過磷酸化IκB激酶（IKK）復合物中的IKKβ，促進IκBα的磷酸化和降解，從而釋放NF-κB，使其進入細胞核啟動炎癥基因的轉錄。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，HMGB1與RAGE結合，激活MAPK和NF-κB信號通路，導致大量炎癥因子釋放，如TNFα、IL-6等，這些炎癥因子會進一步損傷肝細胞，加重肝臟組織的損傷程度。研究表明，使用RAGE抑制劑阻斷HMGB1與RAGE的結合后，肝臟組織中的炎癥因子表達水平顯著降低，肝細胞損傷也明顯減輕，這進一步證實了HMGB1通過RAGE激活炎癥信號通路在肝臟損傷中的重要作用。HMGB1與炎癥信號通路的相互作用是一個復雜的網絡，除了上述主要的信號傳導途徑外，還涉及其他細胞因子和信號分子的參與。例如，HMGB1激活的炎癥信號通路可誘導趨化因子的表達，如CC類趨化因子配體2（CCL2）等，這些趨化因子能夠吸引炎癥細胞，如單核細胞、淋巴細胞等向肝臟炎癥部位聚集，進一步加重炎癥反應。HMGB1還可與其他損傷相關分子模式（DAMPs），如熱休克蛋白（HSPs）、線粒體DNA等相互作用，協同激活炎癥細胞，促進炎癥信號通路的激活。4.2HMGB1對肝星狀細胞激活的調控機制在肝臟纖維化進程中，肝星狀細胞（HSC）的激活是核心環節，而高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在這一過程中發揮著關鍵的調控作用。正常情況下，HSC處于靜止狀態，主要功能為儲存維生素A以及參與肝臟脂質代謝。但當肝臟遭受持續損傷刺激，如病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等，受損肝細胞和炎癥細胞會釋放HMGB1。以乙肝病毒感染為例，病毒感染肝細胞后，引發免疫反應導致肝細胞受損，受損肝細胞會釋放HMGB1。在酒精性肝病中，酒精代謝產生的乙醛等有害物質損傷肝細胞，也促使HMGB1釋放。釋放到細胞外的HMGB1可與HSC表面的受體晚期糖基化終產物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）結合，從而激活HSC內的多條信號通路，誘導其活化。當HMGB1與RAGE結合后，會激活RAGE下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。在MAPK信號通路中，RAGE與HMGB1結合后，會招募含有Src同源2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2），SHP-2進而激活Ras蛋白。Ras蛋白激活后，依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，最終使ERK磷酸化并進入細胞核。進入細胞核的ERK會磷酸化并激活一系列轉錄因子，如c-Jun、c-Fos等，這些轉錄因子與細胞周期相關基因的啟動子區域結合，調節細胞周期相關蛋白的表達，如上調細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等的表達，促使HSC從G1期進入S期，實現細胞增殖。PI3K/Akt信號通路的激活則可抑制HSC的凋亡，維持其活化狀態。PI3K被激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3會招募并激活Akt，Akt通過抑制促凋亡蛋白Bad的活性、激活抗凋亡蛋白Bcl-2等途徑，抑制HSC的凋亡。Akt還能促進HSC合成和分泌細胞外基質，如通過激活下游的mTOR信號通路，促進蛋白質合成，增加細胞外基質成分如膠原蛋白、纖連蛋白等的合成。在體外實驗中，用重組HMGB1刺激HSC，可顯著上調RAGE的表達，并激活MAPK和PI3K/Akt信號通路，導致HSC的增殖和活化明顯增強。HMGB1與TLRs的結合同樣能激活HSC，其中以與TLR4的結合研究較為深入。當HMGB1與TLR4結合時，會引發一系列復雜的分子事件。首先，HMGB1與TLR4的胞外結構域特異性結合，導致TLR4發生構象變化。這種構象變化促使TLR4招募髓樣分化因子88（MyD88），MyD88通過其死亡結構域與TLR4的TIR結構域相互作用，形成MyD88-TLR4復合物。隨后，MyD88會招募IL-1受體相關激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1和IRAK4。IRAK4被激活后，會磷酸化IRAK1，使其從MyD88-TLR4復合物中解離，并進一步激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1進而激活IκB激酶（IKK）復合物，IKK復合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。IKKβ會磷酸化IκBα，使其從NF-κB/IκBα復合物中解離。被釋放的NF-κB（主要是p65/p50異二聚體）會發生核轉位，進入細胞核后與相關基因的啟動子區域結合，促進炎癥因子和細胞外基質相關基因的表達。研究發現，在TLR4基因敲除的小鼠中，HMGB1對HSC的激活作用明顯減弱，表明TLR4在HMGB1介導的HSC活化過程中起著重要作用。此外，HMGB1還可通過與TLR2、TLR9等結合，激活相應的信號通路，促進HSC的活化。在肝纖維化過程中，HMGB1除了通過激活信號通路促進HSC的活化和增殖外，還能影響HSC的表型轉化，使其從靜止的維生素A儲存細胞轉變為具有增殖、收縮、遷移和分泌細胞外基質能力的肌成纖維細胞樣細胞。這一表型轉化過程伴隨著一系列基因和蛋白表達的改變，如α-平滑肌肌動蛋白（α-