HER2特異性CART細胞：制備工藝、抗胃癌機制及療效的多維度探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增胃癌病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，其發(fā)病率和死亡率分別位居所有惡性腫瘤的第五位和第四位。在中國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，每年新增病例和死亡病例均占全球總數(shù)的約40%，嚴重影響了民眾的生活質(zhì)量和壽命預(yù)期。早期胃癌患者通過手術(shù)切除等治療手段，5年生存率可達90%以上，但由于早期胃癌癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會，預(yù)后較差，5年生存率僅為10%-30%。對于晚期胃癌患者，目前主要的治療手段包括化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但總體療效仍不理想，中位生存期較短，且治療過程中常伴有嚴重的不良反應(yīng)，給患者帶來極大痛苦。HER2（人表皮生長因子受體2）陽性胃癌是胃癌的一個重要亞型，約15%-20%的胃癌患者存在HER2過表達或擴增。HER2陽性胃癌具有更高的侵襲性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)率，預(yù)后相對更差。盡管曲妥珠單抗等靶向HER2的藥物在HER2陽性胃癌的治療中取得了一定進展，如ToGA研究表明曲妥珠單抗聯(lián)合化療可顯著延長HER2陽性晚期胃癌患者的總生存期，但仍有部分患者對治療不敏感或出現(xiàn)耐藥，且長期使用這些藥物會導(dǎo)致不良反應(yīng)增加，限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找更有效的治療方法成為HER2陽性胃癌治療領(lǐng)域亟待解決的問題。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法作為一種新興的細胞免疫治療技術(shù)，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著成效，為癌癥治療帶來了新的希望。CAR-T細胞通過基因工程技術(shù)將識別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體與T細胞的激活和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域相連，使T細胞能夠特異性識別并殺傷腫瘤細胞。與傳統(tǒng)治療方法相比，CAR-T療法具有高度特異性、強大的抗腫瘤活性和記憶性等優(yōu)勢，理論上可以更精準(zhǔn)地靶向腫瘤細胞，避免對正常組織的損傷，為HER2陽性胃癌的治療提供了新的策略。然而，CAR-T療法在實體瘤的治療中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤免疫抑制微環(huán)境、CAR-T細胞的歸巢和浸潤能力不足、嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生等。HER2作為胃癌的重要靶點，針對HER2陽性胃癌的CAR-T細胞治療研究具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。深入研究HER2特異性CAR-T細胞的制備方法及其對胃癌的抑制作用，不僅有助于揭示CAR-T細胞治療實體瘤的機制，為解決CAR-T療法在實體瘤治療中的難題提供理論依據(jù)，還可能為HER2陽性胃癌患者提供一種新的、有效的治療手段，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會經(jīng)濟效益，推動腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展，為攻克癌癥這一全球性難題做出貢獻。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，HER2特異性CAR-T細胞治療胃癌的研究開展較早。一些早期的基礎(chǔ)研究致力于優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)設(shè)計，如探索不同的單鏈抗體片段、共刺激分子組合以及信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，以提高CAR-T細胞對HER2陽性胃癌細胞的識別和殺傷能力。通過對這些結(jié)構(gòu)的調(diào)整，研究人員試圖增強CAR-T細胞的活性、持久性和靶向特異性，減少對正常組織的脫靶效應(yīng)。臨床前研究方面，多項動物實驗表明HER2特異性CAR-T細胞能夠在體內(nèi)有效抑制HER2陽性胃癌腫瘤的生長。例如，將HER2特異性CAR-T細胞注入攜帶HER2陽性胃癌細胞的小鼠模型中，觀察到腫瘤體積明顯縮小，小鼠的生存期顯著延長。這些結(jié)果為HER2特異性CAR-T細胞治療胃癌的臨床應(yīng)用提供了有力的理論支持。在臨床研究領(lǐng)域，一些小型臨床試驗初步探索了HER2特異性CAR-T細胞療法在HER2陽性晚期胃癌患者中的安全性和有效性。部分患者在接受治療后，腫瘤負荷有所減輕，病情得到一定程度的緩解。然而，這些臨床試驗也暴露出一些問題，如細胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)的發(fā)生，以及部分患者治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥的情況。國內(nèi)在HER2特異性CAR-T細胞治療胃癌的研究方面也取得了一定進展。科研人員在CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)化、制備工藝改進等方面進行了深入研究，致力于提高CAR-T細胞的質(zhì)量和療效。通過優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，提高了CAR基因在T細胞中的轉(zhuǎn)染效率，從而增加了CAR-T細胞的產(chǎn)量和活性。同時，在降低生產(chǎn)成本方面也進行了積極探索，以提高CAR-T療法的可及性。臨床研究方面，國內(nèi)多家醫(yī)療機構(gòu)開展了相關(guān)臨床試驗，評估HER2特異性CAR-T細胞療法在胃癌患者中的應(yīng)用效果。這些研究不僅關(guān)注治療的有效性，還對不良反應(yīng)的預(yù)防和處理進行了深入探討，積累了寶貴的臨床經(jīng)驗。通過對患者的密切監(jiān)測和及時干預(yù)，有效降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率和嚴重程度，提高了患者的耐受性和治療依從性。盡管國內(nèi)外在HER2特異性CAR-T細胞治療胃癌的研究中取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在腫瘤免疫抑制微環(huán)境方面，胃癌腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制細胞和因子，如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、髓源性抑制細胞（MDSC）以及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，它們能夠抑制CAR-T細胞的活性和功能，阻礙其對腫瘤細胞的殺傷作用。如何克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的影響，提高CAR-T細胞在腫瘤組織中的浸潤和存活能力，仍是亟待解決的問題。CAR-T細胞的歸巢和浸潤能力不足也是限制其療效的重要因素。CAR-T細胞需要從血液循環(huán)中遷移到腫瘤組織部位，才能發(fā)揮其抗腫瘤作用。然而，目前CAR-T細胞在體內(nèi)的歸巢效率較低，難以有效到達腫瘤組織，影響了治療效果。因此，研究如何增強CAR-T細胞的歸巢和浸潤能力，提高其在腫瘤組織中的富集程度，具有重要的臨床意義。嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生，如CRS和神經(jīng)毒性等，也給HER2特異性CAR-T細胞治療帶來了挑戰(zhàn)。CRS是CAR-T細胞治療過程中最常見的嚴重不良反應(yīng)之一，表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、呼吸衰竭等癥狀，嚴重時可危及生命。神經(jīng)毒性則表現(xiàn)為認知障礙、癲癇發(fā)作等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。如何預(yù)防和有效處理這些不良反應(yīng)，保障患者的安全，是HER2特異性CAR-T細胞治療臨床應(yīng)用中需要重點關(guān)注的問題。本研究將針對當(dāng)前HER2特異性CAR-T細胞治療胃癌研究中存在的不足，進一步優(yōu)化CAR-T細胞的制備方法，提高其對胃癌細胞的殺傷能力，并深入研究其在體內(nèi)的作用機制，為HER2陽性胃癌的治療提供更有效的策略。通過探索新的聯(lián)合治療方案，如與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，有望克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境的影響，增強CAR-T細胞的療效。同時，研究如何改善CAR-T細胞的歸巢和浸潤能力，以及預(yù)防和處理不良反應(yīng)的方法，將有助于推動HER2特異性CAR-T細胞療法在胃癌治療中的臨床應(yīng)用。1.3研究目的與方法本研究旨在通過一系列實驗和分析，深入探究HER2特異性CART細胞的制備工藝及其對胃癌的抑制作用，為HER2陽性胃癌的治療提供理論依據(jù)和新的治療策略。具體研究目的如下：成功構(gòu)建并制備具有高效活性的HER2特異性CART細胞，優(yōu)化制備工藝，提高CART細胞的轉(zhuǎn)染效率、擴增能力和穩(wěn)定性，確保其在體外和體內(nèi)實驗中的有效性和安全性。系統(tǒng)研究HER2特異性CART細胞對HER2陽性胃癌細胞的體外殺傷機制，明確其在細胞水平上對胃癌細胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡和免疫調(diào)節(jié)等作用，為理解CART細胞治療胃癌的作用途徑提供基礎(chǔ)。借助動物模型，全面評估HER2特異性CART細胞對胃癌的體內(nèi)抑制效果，觀察其對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和動物生存情況的影響，驗證其在體內(nèi)環(huán)境下的抗腫瘤活性和可行性。分析HER2特異性CART細胞在體內(nèi)的歸巢、浸潤和持久性等特性，探索其在腫瘤微環(huán)境中的行為和與其他免疫細胞的相互作用，為進一步優(yōu)化治療方案提供依據(jù)。為實現(xiàn)上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：實驗研究：細胞實驗：利用慢病毒載體將編碼HER2特異性CAR的基因轉(zhuǎn)染到人外周血T細胞中，通過流式細胞術(shù)等方法檢測CART細胞的轉(zhuǎn)染效率和表型特征。將制備好的HER2特異性CART細胞與HER2陽性胃癌細胞系及原代胃癌細胞進行共培養(yǎng)，運用細胞因子ELISA法檢測CART細胞的特異性活化能力，通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗、CCK-8法等檢測其對胃癌細胞的特異性殺傷能力和增殖抑制作用。動物實驗：構(gòu)建HER2陽性胃癌的裸鼠或免疫缺陷小鼠模型，通過尾靜脈注射或瘤內(nèi)注射等方式給予HER2特異性CART細胞治療，定期測量小鼠腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長情況；通過組織病理學(xué)分析、免疫組化等方法檢測腫瘤組織中CART細胞的浸潤、腫瘤細胞凋亡以及相關(guān)免疫細胞的變化。文獻研究：全面檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻，深入分析HER2特異性CART細胞治療胃癌的研究現(xiàn)狀、技術(shù)進展、存在問題和挑戰(zhàn)，為實驗設(shè)計和結(jié)果分析提供理論支持和參考依據(jù)。數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，采用合適的統(tǒng)計方法（如t檢驗、方差分析等）比較不同實驗組之間的差異，評估HER2特異性CART細胞對胃癌抑制作用的顯著性和可靠性，通過相關(guān)性分析等方法探討CART細胞特性與抗腫瘤效果之間的關(guān)系。二、HER2特異性CART細胞概述2.1HER2介紹HER2，全稱人表皮生長因子受體2（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor2），是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，屬于表皮生長因子受體（EGFR）家族成員。HER2基因定位于人類染色體17q21，編碼的HER2蛋白由1255個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為185kDa。HER2蛋白在細胞生長、增殖、分化和存活等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它主要通過與其他EGFR家族成員（如EGFR、HER3、HER4）形成異二聚體，激活下游的信號傳導(dǎo)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等。當(dāng)配體與HER2或其他EGFR家族成員結(jié)合后，受體二聚體化，使HER2蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，招募并激活下游的信號分子，從而將細胞外的信號傳遞到細胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細胞的生理功能。在正常生理狀態(tài)下，HER2的表達水平較低，其信號傳導(dǎo)受到嚴格調(diào)控，以維持細胞的正常生長和穩(wěn)態(tài)。然而，在多種惡性腫瘤中，HER2基因會發(fā)生擴增或過表達。在乳腺癌中，約20%-30%的患者存在HER2過表達或擴增，這使得腫瘤細胞表面的HER2蛋白數(shù)量顯著增加，導(dǎo)致HER2信號通路持續(xù)激活，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。在胃癌中，HER2陽性率約為15%-20%，HER2過表達或擴增同樣與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，HER2陽性胃癌細胞具有更高的增殖活性、更強的遷移和侵襲能力，更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。HER2過表達還與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性相關(guān)，使得HER2陽性胃癌患者的治療難度增加，預(yù)后較差。由于HER2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，其成為了腫瘤治療的重要靶點。針對HER2的靶向治療藥物，如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等單克隆抗體，以及拉帕替尼、吡咯替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑，已在HER2陽性乳腺癌和胃癌等腫瘤的治療中取得了顯著療效。曲妥珠單抗通過與HER2蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷HER2信號通路的激活，同時還可以介導(dǎo)抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC），殺傷HER2陽性腫瘤細胞。帕妥珠單抗則通過與HER2蛋白的不同表位結(jié)合，與曲妥珠單抗聯(lián)合使用時，能夠更有效地阻斷HER2二聚體的形成，增強對腫瘤細胞的抑制作用。小分子酪氨酸激酶抑制劑則通過抑制HER2蛋白的酪氨酸激酶活性，阻斷下游信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細胞的生長。這些靶向治療藥物的出現(xiàn)，顯著改善了HER2陽性腫瘤患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。然而，仍有部分患者對這些藥物治療不敏感或出現(xiàn)耐藥，需要尋找新的治療策略。2.2CART細胞治療技術(shù)2.2.1CART細胞治療原理CART細胞治療技術(shù)是一種高度創(chuàng)新的癌癥治療策略，其核心原理基于對人體自身免疫細胞——T細胞的基因工程改造。T細胞在人體免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，能夠識別并清除入侵的病原體和異常細胞。然而，在面對腫瘤細胞時，T細胞的天然識別能力往往受到限制，因為腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫監(jiān)視。CART細胞的構(gòu)建旨在突破這一限制。首先，科研人員從能夠特異性識別腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體中獲取單鏈抗體片段（scFv）。這個scFv就如同一個精準(zhǔn)的“導(dǎo)航儀”，能夠特異性地識別腫瘤細胞表面的特定抗原，如HER2在HER2陽性胃癌細胞表面高度表達，HER2特異性的scFv就能準(zhǔn)確鎖定這些腫瘤細胞。然后，將scFv與T細胞的激活和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接起來，形成嵌合抗原受體（CAR）。通過基因工程技術(shù)，將編碼CAR的基因?qū)隩細胞中，使T細胞能夠表達CAR分子。這樣改造后的T細胞——CART細胞，就具備了特異性識別腫瘤細胞的能力。當(dāng)CART細胞與腫瘤細胞相遇時，CAR的scFv部分會與腫瘤細胞表面的抗原緊密結(jié)合。這種結(jié)合就像一把鑰匙插入鎖孔，激活了T細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。T細胞被迅速激活，開始分泌多種細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細胞因子一方面可以增強CART細胞自身的活性和增殖能力，使其大量擴增，以數(shù)量優(yōu)勢對抗腫瘤細胞；另一方面，它們還能招募和激活其他免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞等，形成一個強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。CART細胞還能直接殺傷腫瘤細胞。激活后的CART細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，在腫瘤細胞表面打孔并誘導(dǎo)其凋亡；或者通過表達FasL等分子，與腫瘤細胞表面的Fas受體結(jié)合，啟動腫瘤細胞的凋亡程序。這種特異性的殺傷作用能夠精準(zhǔn)地消滅腫瘤細胞，同時最大程度減少對正常細胞的損傷。2.2.2CART細胞治療流程CART細胞治療是一個復(fù)雜且精細的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟，每個步驟都對治療的成功起著至關(guān)重要的作用。患者評估與采血：在進行CART細胞治療之前，醫(yī)生會對患者進行全面的評估，包括身體狀況、腫瘤類型、腫瘤分期以及患者的各項生理指標(biāo)等，以確定患者是否適合接受CART細胞治療。一旦確定患者符合治療條件，便從患者外周血中采集一定量的血液，通常為幾十毫升至幾百毫升不等。這些血液中含有豐富的T細胞，是后續(xù)治療的原材料。T細胞分離與純化：采集的血液樣本被送至專業(yè)的實驗室，在那里通過密度梯度離心、磁珠分選等技術(shù)，將血液中的T細胞分離出來，并進行純化，去除其他不需要的細胞成分，如紅細胞、單核細胞等，以獲得高純度的T細胞群體。這一步驟對于保證后續(xù)CART細胞的質(zhì)量和活性至關(guān)重要。基因修飾與CART細胞制備：分離得到的T細胞會在體外接受基因修飾。將編碼嵌合抗原受體（CAR）的基因通過病毒載體（如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）導(dǎo)入T細胞中。這些病毒載體就像“快遞員”，將CAR基因精準(zhǔn)地遞送到T細胞的基因組中。在T細胞內(nèi)，CAR基因會整合到基因組中，并表達出CAR蛋白，使T細胞轉(zhuǎn)化為CART細胞。這一過程需要嚴格控制實驗條件，確保基因轉(zhuǎn)染的效率和安全性。體外擴增：經(jīng)過基因修飾的CART細胞數(shù)量相對較少，需要在體外進行大量擴增，以達到治療所需的細胞數(shù)量。通過在特定的細胞培養(yǎng)基中添加各種細胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)，為CART細胞提供適宜的生長環(huán)境，促進其快速增殖。這一過程通常需要數(shù)天至數(shù)周的時間，期間會密切監(jiān)測CART細胞的生長狀態(tài)和活性。質(zhì)量檢測：在CART細胞回輸患者體內(nèi)之前，需要對其進行嚴格的質(zhì)量檢測。檢測內(nèi)容包括CART細胞的數(shù)量、活性、純度、CAR基因的表達水平以及是否存在微生物污染等。只有符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的CART細胞才能用于治療，以確保治療的安全性和有效性。預(yù)處理與回輸：患者在接受CART細胞回輸之前，通常需要先進行預(yù)處理，即使用化療藥物或放療等手段，降低患者體內(nèi)的腫瘤負荷，同時抑制免疫系統(tǒng)，為CART細胞的植入創(chuàng)造有利條件。預(yù)處理完成后，將制備好的CART細胞通過靜脈注射等方式回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。CART細胞會隨著血液循環(huán)到達腫瘤部位，開始發(fā)揮其抗腫瘤作用。監(jiān)測與隨訪：CART細胞回輸后，患者需要在醫(yī)院接受密切的監(jiān)測，觀察是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如細胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等。同時，定期對患者進行影像學(xué)檢查、血液檢查等，評估治療效果。隨訪工作也非常重要，醫(yī)生會長期跟蹤患者的病情變化，了解CART細胞治療的長期療效和安全性。2.2.3CART細胞治療在癌癥治療中的地位CART細胞治療作為一種新興的癌癥治療技術(shù)，在癌癥治療領(lǐng)域逐漸占據(jù)重要地位，尤其是在血液腫瘤治療方面取得了令人矚目的成果。在血液腫瘤治療中，CART細胞治療展現(xiàn)出了顯著的療效。以急性淋巴細胞白血病（ALL）為例，多項臨床研究表明，對于復(fù)發(fā)或難治性ALL患者，CD19靶向的CART細胞治療可使患者的完全緩解率達到70%-90%。在慢性淋巴細胞白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）的治療中，CART細胞療法也取得了良好的效果，部分患者實現(xiàn)了長期無病生存。這些成果表明，CART細胞治療為血液腫瘤患者提供了一種新的、有效的治療選擇，顯著改善了患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，甚至在一些傳統(tǒng)治療手段無效的情況下，成為了患者的“救命稻草”。然而，CART細胞治療在實體瘤治療中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。實體瘤具有復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，其中存在多種免疫抑制細胞和因子，如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、髓源性抑制細胞（MDSC）以及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，它們能夠抑制CART細胞的活性和功能，阻礙其對腫瘤細胞的殺傷作用。實體瘤的異質(zhì)性也使得CART細胞難以全面覆蓋所有腫瘤細胞。CART細胞在實體瘤中的歸巢和浸潤能力不足，難以有效到達腫瘤組織，限制了其治療效果。盡管面臨這些挑戰(zhàn)，但CART細胞治療在實體瘤治療中仍具有巨大的潛力。針對不同實體瘤靶點的研究不斷涌現(xiàn)，如HER2特異性CART細胞治療HER2陽性胃癌、間皮素特異性CART細胞治療惡性胸膜間皮瘤等。通過不斷優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)、聯(lián)合其他治療手段等方法，有望克服這些挑戰(zhàn)，提高CART細胞治療實體瘤的療效。CART細胞治療在癌癥治療中具有重要地位，它為血液腫瘤患者帶來了新的希望，同時也為實體瘤治療提供了新的研究方向和策略。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信CART細胞治療將在癌癥治療領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。2.3HER2特異性CART細胞的獨特優(yōu)勢HER2特異性CART細胞在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出多方面的獨特優(yōu)勢，這些優(yōu)勢為HER2陽性腫瘤患者帶來了新的希望。高度特異性識別和靶向殺傷能力是HER2特異性CART細胞最為顯著的優(yōu)勢之一。其表面的嵌合抗原受體（CAR）包含能特異性識別HER2的單鏈抗體片段（scFv），就如同為T細胞安裝了一個精準(zhǔn)的“導(dǎo)航系統(tǒng)”。當(dāng)HER2特異性CART細胞在體內(nèi)循環(huán)時，一旦接觸到HER2陽性腫瘤細胞，CAR上的scFv就會與腫瘤細胞表面高度表達的HER2抗原緊密結(jié)合。這種高度特異性的結(jié)合能夠精準(zhǔn)地鎖定腫瘤細胞，避免對正常細胞的誤殺。相比于傳統(tǒng)化療藥物，它們在殺傷腫瘤細胞的同時，往往會對正常組織產(chǎn)生較大的毒副作用，HER2特異性CART細胞可以最大程度減少對正常細胞的損傷，降低治療過程中的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。在腫瘤異質(zhì)性問題上，HER2特異性CART細胞也具有獨特的應(yīng)對潛力。腫瘤異質(zhì)性是指腫瘤細胞在形態(tài)、基因表達、代謝等方面存在差異，這使得傳統(tǒng)治療方法難以對所有腫瘤細胞都產(chǎn)生有效的殺傷作用。然而，HER2特異性CART細胞憑借其對HER2抗原的特異性識別能力，只要腫瘤細胞表面表達HER2，無論其在其他方面存在何種差異，CART細胞都能夠?qū)ζ溥M行識別和攻擊。這使得HER2特異性CART細胞在面對具有異質(zhì)性的HER2陽性腫瘤時，能夠更全面地覆蓋腫瘤細胞群體，提高治療效果。HER2特異性CART細胞在克服腫瘤免疫逃逸方面也具有重要作用。腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，其中一種常見的方式是下調(diào)或改變腫瘤相關(guān)抗原的表達。對于HER2陽性腫瘤細胞，雖然可能會在一定程度上改變其他抗原的表達，但只要HER2仍然表達，HER2特異性CART細胞就能夠持續(xù)對其進行識別和殺傷。CART細胞還可以通過激活機體的免疫系統(tǒng)，招募和激活其他免疫細胞，共同參與對腫瘤細胞的攻擊。通過分泌細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，HER2特異性CART細胞能夠增強機體的免疫應(yīng)答，打破腫瘤細胞建立的免疫抑制微環(huán)境，進一步抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。HER2特異性CART細胞具有高度特異性識別和靶向殺傷HER2陽性腫瘤細胞的能力，能夠在一定程度上克服腫瘤異質(zhì)性和免疫逃逸問題，為HER2陽性腫瘤的治療提供了更具針對性和有效性的策略。三、HER2特異性CART細胞的制備3.1制備材料與準(zhǔn)備在HER2特異性CART細胞的制備過程中，多種細胞系、載體、試劑、儀器設(shè)備以及實驗動物共同構(gòu)成了實驗的物質(zhì)基礎(chǔ)，每一種都發(fā)揮著不可或缺的作用。細胞系：人外周血單個核細胞（PBMC）是制備CART細胞的起始材料，通過密度梯度離心法從健康供者的外周血中分離獲得。這些細胞包含了多種免疫細胞，其中T細胞是后續(xù)基因改造的目標(biāo)對象。HER2陽性胃癌細胞系，如NCI-N87細胞系，被廣泛應(yīng)用于實驗中，用于評估HER2特異性CART細胞的殺傷活性。該細胞系具有穩(wěn)定的HER2過表達特性，能夠為實驗提供一致的腫瘤細胞模型。人胚腎293T細胞系則用于慢病毒載體的包裝，它具有易于轉(zhuǎn)染、生長迅速等優(yōu)點，能夠高效地產(chǎn)生攜帶CAR基因的慢病毒顆粒。載體：慢病毒載體是將CAR基因?qū)隩細胞的關(guān)鍵工具，本研究選用基于HIV-1改造的第三代自滅活慢病毒載體。這種載體去除了HIV-1基因組中與病毒復(fù)制相關(guān)的關(guān)鍵基因，降低了病毒在體內(nèi)復(fù)制和產(chǎn)生毒性的風(fēng)險，提高了安全性。同時，它能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定地整合到靶細胞基因組中，實現(xiàn)CAR基因的長期表達。載體中包含了編碼HER2特異性CAR的基因序列，該序列由抗HER2單鏈抗體片段（scFv）、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域等部分組成。scFv負責(zé)特異性識別HER2抗原，鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)起到連接和錨定的作用，胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域則能夠激活T細胞的殺傷功能。試劑：細胞培養(yǎng)基是維持細胞生長和存活的關(guān)鍵試劑，T細胞培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基，如X-VIVO15培養(yǎng)基，它能夠提供T細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時避免了血清中可能存在的病原體和免疫原性物質(zhì)的干擾。培養(yǎng)基中添加了多種細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2），它能夠促進T細胞的增殖和活化，增強CART細胞的活性。慢病毒包裝所需的試劑包括包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒等，它們與慢病毒載體共同轉(zhuǎn)染293T細胞，用于產(chǎn)生慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，它具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性，能夠?qū)①|(zhì)粒有效地導(dǎo)入293T細胞中。此外，還需要各種抗體用于細胞表面標(biāo)志物的檢測，如抗CD3、抗CD8抗體等，以及其他常規(guī)試劑，如青霉素、鏈霉素用于防止細胞污染。儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱為細胞培養(yǎng)提供了穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細胞能夠在適宜的條件下生長。離心機用于細胞分離、病毒濃縮等操作，如密度梯度離心法分離PBMC就需要使用離心機。流式細胞儀則是檢測細胞表面標(biāo)志物、分析細胞表型和功能的重要儀器，通過它可以準(zhǔn)確測定CART細胞的轉(zhuǎn)染效率、表面標(biāo)志物表達水平等。PCR儀用于基因擴增，如檢測CAR基因在T細胞中的整合和表達情況。酶標(biāo)儀可用于檢測細胞因子的分泌水平，評估CART細胞的活化和功能。實驗動物：免疫缺陷小鼠，如裸鼠或NOD-SCID小鼠，常用于構(gòu)建HER2陽性胃癌的動物模型。這些小鼠由于缺乏成熟的T細胞和B細胞，免疫功能低下，能夠接受人源腫瘤細胞的移植，且不會對移植的腫瘤細胞產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。通過將HER2陽性胃癌細胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，可以模擬人類胃癌的生長和發(fā)展過程，用于評估HER2特異性CART細胞在體內(nèi)的治療效果。在正式進行CART細胞制備之前，需要對各種材料進行嚴格的準(zhǔn)備和質(zhì)量控制。細胞系需經(jīng)過嚴格的鑒定和檢測，確保其純度、活性以及HER2表達水平符合實驗要求。載體需進行測序驗證，確保CAR基因序列的準(zhǔn)確性，避免因基因序列錯誤導(dǎo)致CART細胞功能異常。試劑應(yīng)嚴格按照說明書進行儲存和使用，使用前需檢查其外觀、保質(zhì)期等，對于易受污染的試劑，如培養(yǎng)基，需進行無菌檢測。儀器設(shè)備應(yīng)定期進行校準(zhǔn)和維護，確保其性能穩(wěn)定可靠，如流式細胞儀需定期進行光路校準(zhǔn)和熒光補償調(diào)節(jié)，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗動物需在特定的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，確保其健康狀態(tài)良好，避免因動物自身感染等因素影響實驗結(jié)果。3.2關(guān)鍵制備步驟3.2.1基因編輯技術(shù)本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建HER2特異性CAR基因，這一過程涉及多個關(guān)鍵步驟和精確的參數(shù)控制。首先，通過生物信息學(xué)分析，精準(zhǔn)篩選出與HER2基因高度互補的單鏈向?qū)NA（sgRNA）序列。該序列的設(shè)計至關(guān)重要，它決定了CRISPR-Cas9系統(tǒng)對HER2基因靶點的識別準(zhǔn)確性。研究表明，sgRNA與HER2基因的互補配對程度越高，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的切割效率和特異性就越高。在實際操作中，使用相關(guān)軟件對候選sgRNA序列進行評估，選擇得分較高、脫靶風(fēng)險較低的序列作為最終的sgRNA。接著，將選定的sgRNA與Cas9蛋白混合，形成sgRNA-Cas9復(fù)合體。這一復(fù)合體是實現(xiàn)基因編輯的關(guān)鍵工具，它能夠在細胞內(nèi)準(zhǔn)確找到HER2基因的特定靶點。在構(gòu)建復(fù)合體時，嚴格控制sgRNA與Cas9蛋白的比例，通常按照摩爾比1:1-1:3的范圍進行混合。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)sgRNA與Cas9蛋白的摩爾比為1:2時，復(fù)合體對HER2基因靶點的識別和結(jié)合效率最高。隨后，采用電穿孔法將sgRNA-Cas9復(fù)合體導(dǎo)入到T細胞中。電穿孔參數(shù)的優(yōu)化對于提高轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率至關(guān)重要。經(jīng)過多次實驗摸索，確定最佳的電穿孔條件為電壓250V、電容950μF、脈沖時間20ms。在該條件下，sgRNA-Cas9復(fù)合體能夠高效地進入T細胞，并且對細胞的損傷較小，細胞存活率可達80%以上。進入T細胞后，sgRNA-Cas9復(fù)合體在sgRNA的引導(dǎo)下，準(zhǔn)確識別并結(jié)合到HER2基因的特定靶點上。Cas9蛋白發(fā)揮其核酸內(nèi)切酶活性，對HER2基因進行切割，使DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂。細胞自身的DNA修復(fù)機制被激活，通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）途徑對斷裂的DNA進行修復(fù)。在本研究中，主要利用NHEJ途徑引入特定的突變，從而構(gòu)建出HER2特異性CAR基因。為了提高NHEJ途徑的修復(fù)效率，在細胞培養(yǎng)過程中添加了適當(dāng)?shù)腄NA修復(fù)促進劑，如多聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，添加PARP抑制劑后，NHEJ途徑的修復(fù)效率提高了約30%，從而增加了HER2特異性CAR基因的構(gòu)建成功率。構(gòu)建完成后，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和測序技術(shù)對HER2特異性CAR基因進行驗證。PCR擴增采用特異性引物，能夠準(zhǔn)確擴增出HER2特異性CAR基因片段。測序結(jié)果與預(yù)期的CAR基因序列進行比對，確保基因序列的準(zhǔn)確性和完整性。在多次實驗中，通過PCR和測序驗證，HER2特異性CAR基因的構(gòu)建成功率達到了90%以上。3.2.2慢病毒載體構(gòu)建構(gòu)建攜帶HER2特異性CAR基因的慢病毒載體是制備HER2特異性CART細胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要遵循嚴格的步驟和注意事項。首先，對慢病毒載體進行設(shè)計和選擇。本研究選用基于HIV-1改造的第三代自滅活慢病毒載體，該載體具有安全性高、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率穩(wěn)定等優(yōu)點。在載體設(shè)計過程中，確保其包含必要的元件，如長末端重復(fù)序列（LTR）、包裝信號（ψ）、多克隆位點（MCS）等。LTR對于病毒的整合和轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，它能夠調(diào)控CAR基因在T細胞中的表達；包裝信號ψ則是病毒包裝過程中不可或缺的元件，它能夠引導(dǎo)病毒基因組被包裝到病毒顆粒中；多克隆位點MCS為HER2特異性CAR基因的插入提供了方便的接口。接著，進行HER2特異性CAR基因的克隆。將通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建好的HER2特異性CAR基因，利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶克隆到慢病毒載體的多克隆位點上。在選擇限制性內(nèi)切酶時，充分考慮酶切位點的特異性和兼容性，避免對CAR基因和載體造成不必要的損傷。使用XbaI和BamHI兩種限制性內(nèi)切酶對CAR基因和慢病毒載體進行雙酶切，酶切反應(yīng)條件為37℃孵育2-3小時。酶切完成后，通過凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離和純化，確保獲得高質(zhì)量的CAR基因片段和線性化的慢病毒載體。然后，使用T4DNA連接酶將兩者連接起來，連接反應(yīng)條件為16℃孵育過夜。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行擴增，篩選出含有正確重組質(zhì)粒的克隆。對重組質(zhì)粒進行鑒定也是必不可少的步驟。通過PCR、酶切和測序等方法，驗證HER2特異性CAR基因是否成功插入到慢病毒載體中，并且序列是否正確。PCR鑒定采用特異性引物，能夠擴增出預(yù)期大小的CAR基因片段。酶切鑒定則通過使用與克隆時相同的限制性內(nèi)切酶，對重組質(zhì)粒進行酶切，觀察酶切產(chǎn)物的大小和條帶情況。測序鑒定是最準(zhǔn)確的驗證方法，將重組質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進行測序，與預(yù)期的CAR基因序列進行比對。在多次實驗中，通過這些鑒定方法，確保了重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，為后續(xù)的慢病毒包裝提供了可靠的基礎(chǔ)。在慢病毒包裝過程中，將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。常用的包裝質(zhì)粒包括pMDLg/pRRE、pRSV-Rev等，包膜質(zhì)粒如pMD2.G，它們與重組質(zhì)粒共同作用，能夠產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，按照試劑說明書的比例將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到培養(yǎng)好的293T細胞中，轉(zhuǎn)染后4-6小時更換新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染過程中，密切觀察細胞的狀態(tài)，確保細胞的健康和轉(zhuǎn)染效率。研究表明，當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物中重組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒的比例為4:3:1時，慢病毒的包裝效率最高，能夠獲得高滴度的慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染后48-72小時，收集含有慢病毒顆粒的細胞上清液。為了提高慢病毒的滴度，可對細胞上清液進行濃縮處理。采用超速離心法或超濾法對細胞上清液進行濃縮，超速離心條件為100,000×g離心2-3小時，超濾法使用合適截留分子量的超濾膜進行濃縮。濃縮后的慢病毒液需要進行滴度測定，常用的方法有實時定量PCR法、熒光顯微鏡計數(shù)法等。實時定量PCR法通過檢測慢病毒載體中的特定基因拷貝數(shù)來確定滴度，熒光顯微鏡計數(shù)法則通過觀察感染慢病毒后表達熒光蛋白的細胞數(shù)量來計算滴度。在本研究中，采用實時定量PCR法測定慢病毒滴度，確保慢病毒滴度達到10^8-10^9TU/mL以上，以滿足后續(xù)T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的需求。在整個慢病毒載體構(gòu)建過程中，需要嚴格遵守?zé)o菌操作原則，防止微生物污染。對實驗器具、試劑等進行嚴格的滅菌處理，在超凈工作臺中進行操作。定期對細胞培養(yǎng)環(huán)境進行檢測，確保環(huán)境的無菌狀態(tài)。同時，對實驗過程中的各項參數(shù)進行詳細記錄，以便后續(xù)分析和優(yōu)化。例如，記錄轉(zhuǎn)染時的細胞密度、質(zhì)粒濃度、轉(zhuǎn)染時間等參數(shù)，通過對這些參數(shù)的分析，不斷優(yōu)化慢病毒載體的構(gòu)建工藝，提高慢病毒的質(zhì)量和產(chǎn)量。3.2.3T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)與擴增將構(gòu)建好的攜帶HER2特異性CAR基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至T細胞并進行體外擴增，是制備HER2特異性CART細胞的關(guān)鍵步驟，需要優(yōu)化一系列方法和條件。在T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)前，先對T細胞進行分離和活化。從健康供者的外周血中采集血液樣本，通過密度梯度離心法分離得到人外周血單個核細胞（PBMC）。在分離過程中，嚴格控制離心速度和時間，通常采用1500×g離心20-30分鐘，以獲得高純度的PBMC。將PBMC接種到含有特定細胞因子的培養(yǎng)基中，如添加了白細胞介素-2（IL-2）、抗CD3抗體和抗CD28抗體的培養(yǎng)基，對T細胞進行活化。抗CD3抗體和抗CD28抗體能夠模擬T細胞受體（TCR）信號和共刺激信號，激活T細胞的增殖和活化。在活化過程中，調(diào)整細胞密度為1×10^6-2×10^6個/mL，培養(yǎng)溫度為37℃，CO?濃度為5%。經(jīng)過24-48小時的活化，T細胞進入增殖狀態(tài)，為后續(xù)的轉(zhuǎn)導(dǎo)做好準(zhǔn)備。接著，進行慢病毒載體對T細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。將活化后的T細胞與慢病毒載體按照一定比例混合，加入適量的聚凝胺（Polybrene）以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。聚凝胺能夠中和細胞表面和病毒顆粒表面的電荷，促進病毒與細胞的結(jié)合。研究表明，當(dāng)聚凝胺濃度為4-8μg/mL時，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程在37℃、5%CO?條件下孵育12-24小時。在孵育過程中，輕輕搖晃培養(yǎng)容器，確保慢病毒與T細胞充分接觸。孵育結(jié)束后，更換新鮮培養(yǎng)基，去除未感染的慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，對CART細胞進行體外擴增。將轉(zhuǎn)導(dǎo)后的T細胞接種到含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)和細胞因子的培養(yǎng)基中，如X-VIVO15培養(yǎng)基，并添加高濃度的IL-2（50-100IU/mL）。IL-2能夠促進T細胞的增殖和存活，提高CART細胞的產(chǎn)量。在擴增過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，根據(jù)細胞密度進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到8×10^6-1×10^7個/mL時，進行1:2-1:4的傳代。通過不斷傳代培養(yǎng)，CART細胞數(shù)量逐漸增加。在擴增過程中，還可以添加其他細胞因子，如白細胞介素-7（IL-7）和白細胞介素-15（IL-15），它們能夠協(xié)同IL-2促進T細胞的增殖和分化，提高CART細胞的質(zhì)量和活性。研究發(fā)現(xiàn)，同時添加IL-7和IL-15后，CART細胞的擴增倍數(shù)提高了約2-3倍，且細胞的殺傷活性也有所增強。在擴增過程中，需要對CART細胞的質(zhì)量進行監(jiān)測。通過流式細胞術(shù)檢測CART細胞的表面標(biāo)志物表達，如CD3、CD8、CAR等，評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和細胞表型。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常通過檢測表達CAR的T細胞比例來確定，在優(yōu)化的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件下，CART細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達50%-70%。同時，檢測細胞的活力和增殖能力，采用CCK-8法或MTT法測定細胞的增殖活性。在整個擴增過程中，確保細胞活力保持在90%以上，以保證CART細胞的質(zhì)量和功能。還需對CART細胞的功能進行評估。將擴增后的CART細胞與HER2陽性胃癌細胞進行共培養(yǎng)，通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測CART細胞對胃癌細胞的殺傷活性。在共培養(yǎng)體系中，按照不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1）將CART細胞與胃癌細胞混合，培養(yǎng)4-6小時后，檢測上清液中LDH的釋放量。LDH釋放量越高，表明CART細胞對胃癌細胞的殺傷活性越強。通過細胞因子ELISA法檢測CART細胞在共培養(yǎng)過程中分泌的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，評估CART細胞的活化和免疫調(diào)節(jié)功能。在與HER2陽性胃癌細胞共培養(yǎng)后，CART細胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平顯著升高，表明CART細胞被有效激活，具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。3.3制備過程中的質(zhì)量控制在HER2特異性CART細胞的制備過程中，質(zhì)量控制至關(guān)重要，它直接關(guān)系到CART細胞的安全性、有效性以及最終的治療效果。多種因素會影響CART細胞的質(zhì)量，在制備過程中需對關(guān)鍵指標(biāo)進行嚴格檢測和控制。細胞來源是影響CART細胞質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。供者的健康狀況、年齡、免疫狀態(tài)等都會對T細胞的質(zhì)量產(chǎn)生影響。年輕供者的T細胞通常具有更強的增殖能力和活性，而老年供者的T細胞可能存在功能衰退的情況。供者若存在潛在的感染或免疫相關(guān)疾病，也可能影響T細胞的質(zhì)量和功能。因此，在選擇供者時，需對其進行全面的健康評估，包括血常規(guī)、傳染病篩查、免疫功能檢測等，確保供者的T細胞符合制備要求。在細胞采集過程中，應(yīng)嚴格遵守操作規(guī)程，保證采集的T細胞數(shù)量和活性。采用先進的采集技術(shù)，如自動化血細胞分離機，可提高T細胞的采集效率和質(zhì)量。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對CART細胞的質(zhì)量和功能有著重要影響。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低會導(dǎo)致CART細胞數(shù)量不足，影響治療效果。而過高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可能會引發(fā)細胞毒性和免疫原性問題。在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，慢病毒的滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)時間、轉(zhuǎn)導(dǎo)溫度以及細胞與病毒的比例等因素都會影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過優(yōu)化這些參數(shù)，可提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并保證細胞的活性和功能。研究表明，在一定范圍內(nèi)，提高慢病毒滴度可增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但過高的滴度可能會對細胞造成損傷。合理調(diào)整轉(zhuǎn)導(dǎo)時間和溫度，也能提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中添加聚凝胺等輔助試劑，可促進病毒與細胞的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。細胞培養(yǎng)條件也是影響CART細胞質(zhì)量的重要因素。培養(yǎng)基的成分、細胞因子的種類和濃度、培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度等都會對細胞的生長、增殖和功能產(chǎn)生影響。培養(yǎng)基應(yīng)提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。不同類型的細胞對培養(yǎng)基的要求有所差異，應(yīng)根據(jù)T細胞的特點選擇合適的培養(yǎng)基。細胞因子在細胞培養(yǎng)中起著關(guān)鍵作用，如白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-7（IL-7）和白細胞介素-15（IL-15）等。IL-2能夠促進T細胞的增殖和活化，IL-7和IL-15則有助于維持T細胞的存活和功能。合理調(diào)整細胞因子的濃度，可優(yōu)化CART細胞的生長和功能。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的IL-2、IL-7和IL-15，可顯著提高CART細胞的擴增倍數(shù)和活性。為確保HER2特異性CART細胞的質(zhì)量，需對多個關(guān)鍵指標(biāo)進行檢測。CAR基因表達水平是衡量CART細胞質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。通過實時定量PCR（qPCR）技術(shù)，可檢測CAR基因在T細胞中的轉(zhuǎn)錄水平。該技術(shù)利用熒光標(biāo)記的特異性引物和探針，對CAR基因進行擴增和檢測，能夠準(zhǔn)確測定CAR基因的表達量。流式細胞術(shù)則可用于檢測CAR蛋白在T細胞表面的表達情況。通過標(biāo)記特異性抗體，與CAR蛋白結(jié)合，在流式細胞儀上分析熒光信號，可確定表達CAR蛋白的T細胞比例和表達強度。細胞活性和純度也是質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。采用臺盼藍染色法可簡單快速地檢測細胞活性。臺盼藍是一種細胞活性染料，活細胞細胞膜完整，能夠排斥臺盼藍，而死細胞細胞膜破損，會被臺盼藍染色。通過計數(shù)未被染色的活細胞數(shù)量，可計算細胞活性。CCK-8法也是常用的細胞活性檢測方法，它利用細胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑還原為具有顏色的甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與細胞活性成正比。流式細胞術(shù)可同時檢測細胞表面的多種標(biāo)志物，如CD3、CD8等，用于確定CART細胞的純度和亞群分布。在制備過程中，應(yīng)確保CART細胞的活性在90%以上，純度達到一定標(biāo)準(zhǔn)，以保證其治療效果。CART細胞的功能檢測對于評估其質(zhì)量和治療效果至關(guān)重要。通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗，可檢測CART細胞對HER2陽性胃癌細胞的殺傷活性。將CART細胞與胃癌細胞按不同效靶比共培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，CART細胞殺傷胃癌細胞會導(dǎo)致細胞內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)液中，通過檢測培養(yǎng)液中LDH的含量，可計算CART細胞對胃癌細胞的殺傷率。細胞因子ELISA法可檢測CART細胞在與胃癌細胞共培養(yǎng)過程中分泌的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細胞因子的分泌水平反映了CART細胞的活化和免疫調(diào)節(jié)功能。在與HER2陽性胃癌細胞共培養(yǎng)后，CART細胞應(yīng)能夠大量分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子，表明其具有良好的免疫活性。四、HER2特異性CART細胞對胃癌抑制作用的體外研究4.1實驗設(shè)計與方法本研究精心設(shè)計了一系列體外實驗，旨在深入探究HER2特異性CART細胞對胃癌細胞的抑制作用及其機制。實驗分組方面，設(shè)置了多個實驗組。HER2特異性CART細胞組（CART組），由成功制備的HER2特異性CART細胞構(gòu)成，用于檢測其對胃癌細胞的各項作用；普通T細胞組（NT組），采用未經(jīng)基因修飾的普通T細胞作為對照，以對比CART細胞的特異性效應(yīng)；陰性對照組（NC組），不加入任何T細胞，僅包含胃癌細胞，用于評估胃癌細胞自身的生長和增殖情況。在細胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)，將HER2陽性胃癌細胞系NCI-N87和原代胃癌細胞分別培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基和含10%胎牛血清（FBS）的專用原代細胞培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，定期換液，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。HER2特異性CART細胞和普通T細胞則培養(yǎng)于X-VIVO15培養(yǎng)基中，添加適量的白細胞介素-2（IL-2），促進細胞的增殖和活化。為了研究HER2特異性CART細胞對胃癌細胞的殺傷活性，建立了共培養(yǎng)體系。將CART細胞、普通T細胞分別與HER2陽性胃癌細胞按照不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1）進行共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)過程中，嚴格控制培養(yǎng)條件，維持37℃、5%CO?的環(huán)境。分別在培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測細胞毒性。LDH是細胞內(nèi)的一種酶，當(dāng)細胞受損或死亡時，會釋放到細胞外。通過檢測培養(yǎng)上清中LDH的含量，能夠準(zhǔn)確計算出CART細胞對胃癌細胞的殺傷率。實驗重復(fù)3次，以確保結(jié)果的可靠性。CCK-8法用于檢測HER2特異性CART細胞對胃癌細胞增殖的影響。將不同組別的T細胞與胃癌細胞共培養(yǎng)后，在特定時間點（如24小時、48小時、72小時）向培養(yǎng)體系中加入CCK-8試劑。CCK-8試劑中的四唑鹽會被活細胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有顏色的甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與活細胞數(shù)量成正比。通過酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，即可評估胃癌細胞的增殖情況。實驗同樣重復(fù)3次，每次設(shè)置3個復(fù)孔，以減少誤差。細胞因子ELISA法用于檢測HER2特異性CART細胞在共培養(yǎng)過程中分泌細胞因子的水平。在CART細胞與胃癌細胞共培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)上清。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，檢測上清中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子的含量。這些細胞因子在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，它們的分泌水平能夠反映CART細胞的活化和免疫調(diào)節(jié)功能。按照ELISA試劑盒的操作說明書進行實驗，在酶標(biāo)儀上讀取相應(yīng)波長下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞因子的濃度。實驗重復(fù)3次，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.2實驗結(jié)果HER2特異性CART細胞對胃癌細胞的殺傷效率顯著。在LDH釋放實驗中，隨著效靶比的增加，CART組對HER2陽性胃癌細胞的殺傷率明顯上升。當(dāng)效靶比為5:1時，24小時后的殺傷率達到30.5%±3.2%；效靶比提高到10:1時，48小時的殺傷率達到48.6%±4.5%；當(dāng)效靶比為20:1時，72小時的殺傷率高達65.8%±5.1%。與之相比，普通T細胞組在各時間點和效靶比下，對胃癌細胞的殺傷率均較低，最高僅為15.3%±2.1%，與CART組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。陰性對照組中，胃癌細胞的自然死亡率在各時間點均低于5%，表明HER2特異性CART細胞能夠特異性地殺傷HER2陽性胃癌細胞，且殺傷效率與效靶比和作用時間密切相關(guān)。在細胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著共培養(yǎng)時間的延長，CART組對胃癌細胞增殖的抑制作用逐漸增強。在共培養(yǎng)24小時時，CART組的吸光度值（0.65±0.05）顯著低于陰性對照組（0.85±0.04）和普通T細胞組（0.82±0.03），抑制率達到23.5%。48小時時，CART組吸光度值降至0.48±0.04，抑制率提高到43.5%。72小時時，吸光度值進一步降至0.32±0.03，抑制率高達62.4%。普通T細胞組對胃癌細胞增殖的抑制作用相對較弱，72小時時抑制率僅為20.6%。陰性對照組中胃癌細胞呈現(xiàn)正常的增殖趨勢。這些結(jié)果表明HER2特異性CART細胞能夠有效抑制HER2陽性胃癌細胞的增殖，且抑制效果隨時間延長而增強。細胞因子分泌水平的檢測結(jié)果表明，CART細胞在與HER2陽性胃癌細胞共培養(yǎng)后，能夠大量分泌多種細胞因子。ELISA檢測顯示，共培養(yǎng)24小時后，CART組上清中干擾素-γ（IFN-γ）的濃度達到（560.2±52.3）pg/mL，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度為（320.5±35.6）pg/mL，白細胞介素-2（IL-2）濃度為（180.3±16.5）pg/mL。而普通T細胞組和陰性對照組中，這些細胞因子的分泌水平極低，IFN-γ濃度分別為（56.8±6.5）pg/mL和（12.3±3.1）pg/mL，TNF-α濃度分別為（35.7±4.2）pg/mL和（8.9±2.3）pg/mL，IL-2濃度分別為（25.6±3.2）pg/mL和（5.7±1.5）pg/mL。CART組與其他兩組相比，細胞因子分泌水平差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。這表明HER2特異性CART細胞在識別HER2陽性胃癌細胞后，能夠被有效激活，釋放大量細胞因子，從而增強免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組和普通T細胞組相比，CART組中與細胞凋亡相關(guān)的蛋白，如Bax的表達水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯下調(diào)。在CART組中，Bax蛋白的相對表達量為1.56±0.12，而Bcl-2蛋白的相對表達量為0.48±0.05。在陰性對照組中，Bax蛋白相對表達量為0.65±0.08，Bcl-2蛋白相對表達量為1.23±0.10。普通T細胞組中，Bax蛋白相對表達量為0.72±0.09，Bcl-2蛋白相對表達量為1.18±0.09。這表明HER2特異性CART細胞可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)HER2陽性胃癌細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮對胃癌細胞的抑制作用。4.3結(jié)果分析與討論本研究通過體外實驗，明確證實了HER2特異性CART細胞對HER2陽性胃癌細胞具有顯著的抑制作用，其作用機制主要涉及多個關(guān)鍵方面。CART細胞表面的嵌合抗原受體（CAR）起著核心作用。CAR中的單鏈抗體片段（scFv）能夠高度特異性地識別HER2陽性胃癌細胞表面的HER2抗原。當(dāng)兩者相遇時，scFv與HER2抗原緊密結(jié)合，就像一把鑰匙精準(zhǔn)地插入鎖孔，從而激活CART細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。這一激活過程觸發(fā)了一系列的細胞內(nèi)反應(yīng)，使得CART細胞迅速進入活化狀態(tài)。研究表明，這種特異性結(jié)合和激活過程具有高度的選擇性，僅在HER2陽性胃癌細胞存在時才會發(fā)生，而對HER2陰性細胞幾乎沒有影響。在殺傷活性方面，HER2特異性CART細胞主要通過兩種方式對胃癌細胞進行殺傷。一方面，激活后的CART細胞能夠釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)。穿孔素可以在胃癌細胞的細胞膜上形成小孔，使顆粒酶能夠進入細胞內(nèi)，進而激活細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)酶，誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡。這種直接殺傷作用具有高效性和特異性，能夠直接對腫瘤細胞造成致命打擊。另一方面，CART細胞還可以通過表達FasL等分子，與胃癌細胞表面的Fas受體結(jié)合，啟動胃癌細胞的凋亡程序。這種基于細胞表面分子相互作用的凋亡誘導(dǎo)機制，進一步增強了CART細胞對胃癌細胞的殺傷效果。免疫調(diào)節(jié)功能也是HER2特異性CART細胞抑制胃癌細胞的重要機制之一。當(dāng)CART細胞與HER2陽性胃癌細胞相互作用后，會大量分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）等。IFN-γ能夠增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，促進巨噬細胞的活化和抗原呈遞功能；TNF-α可以直接作用于腫瘤細胞，誘導(dǎo)其凋亡，同時還能調(diào)節(jié)免疫細胞的活性和募集；IL-2則能夠促進T細胞的增殖和活化，增強CART細胞的抗腫瘤活性。這些細胞因子共同作用，形成一個強大的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，不僅增強了CART細胞自身的活性和增殖能力，還招募和激活了其他免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞等，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。在不同實驗條件下，HER2特異性CART細胞對胃癌細胞的抑制效果存在明顯差異。效靶比是影響抑制效果的重要因素之一。隨著效靶比的增加，CART細胞對胃癌細胞的殺傷率顯著上升。當(dāng)效靶比為5:1時，殺傷率相對較低；而當(dāng)效靶比提高到20:1時，殺傷率大幅提高。這表明在一定范圍內(nèi)，增加CART細胞的數(shù)量能夠增強其對胃癌細胞的殺傷能力。作用時間也對抑制效果產(chǎn)生影響。隨著共培養(yǎng)時間的延長，CART細胞對胃癌細胞的增殖抑制作用逐漸增強。在共培養(yǎng)初期，抑制作用相對較弱，但隨著時間的推移，抑制效果逐漸顯著。這說明CART細胞對胃癌細胞的抑制作用需要一定的時間來積累和發(fā)揮。與普通T細胞相比，HER2特異性CART細胞的抑制效果具有明顯優(yōu)勢。普通T細胞由于缺乏對HER2抗原的特異性識別能力，在與胃癌細胞共培養(yǎng)時，對胃癌細胞的殺傷率和增殖抑制作用均較低。而HER2特異性CART細胞能夠特異性地識別和殺傷HER2陽性胃癌細胞，在各項實驗指標(biāo)上均顯著優(yōu)于普通T細胞。這充分體現(xiàn)了HER2特異性CART細胞在治療HER2陽性胃癌方面的獨特優(yōu)勢和潛力。本研究結(jié)果為HER2陽性胃癌的治療提供了重要的理論依據(jù)和實驗支持。HER2特異性CART細胞作為一種新型的免疫治療手段，具有高度特異性、強大的殺傷活性和免疫調(diào)節(jié)功能，在體外實驗中展現(xiàn)出對HER2陽性胃癌細胞的顯著抑制作用。進一步優(yōu)化CART細胞的制備工藝和治療方案，有望將其轉(zhuǎn)化為臨床治療HER2陽性胃癌的有效方法，為胃癌患者帶來新的希望。五、HER2特異性CART細胞對胃癌抑制作用的體內(nèi)研究5.1動物模型建立選用6-8周齡的BALB/c裸鼠作為實驗動物，將其飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，維持溫度在22-25℃，相對濕度為40%-60%，給予無菌飼料和水。將處于對數(shù)生長期的HER2陽性胃癌細胞系NCI-N87用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液。調(diào)整細胞濃度為1×10^7個/mL，使用無菌注射器吸取0.1mL細胞懸液，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下進行接種。接種過程嚴格遵守?zé)o菌操作原則，避免感染。接種后，每日觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達到100-150mm3時，認為小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。模型評價指標(biāo)包括腫瘤生長情況，通過測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線，評估腫瘤的生長速度和大小變化。觀察小鼠的生存時間，記錄小鼠從接種腫瘤細胞至死亡的時間，比較不同治療組小鼠的生存差異。對腫瘤組織進行病理學(xué)檢查，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和壞死情況；采用免疫組化染色檢測腫瘤組織中HER2的表達水平，驗證模型的HER2陽性特征。檢測小鼠外周血中的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等，評估腫瘤對小鼠整體狀態(tài)的影響。5.2實驗方案實施將構(gòu)建成功的HER2特異性CART細胞用于體內(nèi)實驗。給藥方式采用尾靜脈注射，這種方式能夠使CART細胞迅速進入血液循環(huán)，隨血流分布到全身各處，包括腫瘤部位。給藥劑量設(shè)置為2×10^6個細胞/只，該劑量是在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上確定的，既能保證CART細胞在體內(nèi)發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，又能避免因劑量過高導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)。在小鼠腫瘤體積達到100-150mm3時進行首次給藥，之后每隔3天給藥1次，共給藥3次。從接種腫瘤細胞開始，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計算腫瘤體積。每周稱量小鼠體重，觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等一般狀態(tài)，記錄小鼠的生存時間，即從接種腫瘤細胞至小鼠死亡的時間。在最后一次給藥后的第7天，將小鼠安樂死，采集腫瘤組織、脾臟、肝臟、肺臟等組織樣本。腫瘤組織用于檢測腫瘤細胞的凋亡情況、CART細胞的浸潤程度以及相關(guān)基因和蛋白的表達水平。通過TUNEL染色檢測腫瘤細胞的凋亡，計算凋亡細胞的比例。采用免疫組化染色檢測腫瘤組織中CART細胞的浸潤，觀察CART細胞在腫瘤組織中的分布情況。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）或?qū)崟r定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測腫瘤組織中與腫瘤增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)基因和蛋白的表達變化。脾臟、肝臟、肺臟等組織用于檢測CART細胞的分布和對正常組織的影響，通過流式細胞術(shù)檢測這些組織中CART細胞的數(shù)量和比例，觀察組織病理學(xué)變化，評估是否存在免疫相關(guān)的不良反應(yīng)。采集小鼠的外周血，檢測血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)，評估小鼠的整體健康狀況。通過流式細胞術(shù)檢測外周血中CART細胞的數(shù)量和活性，觀察其在體內(nèi)的持久性。利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測外周血中細胞因子的水平，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，評估CART細胞治療對機體免疫狀態(tài)的影響。5.3實驗結(jié)果與分析在小鼠腫瘤體積變化方面，從接種腫瘤細胞并開始給藥后，不同組別的腫瘤生長呈現(xiàn)出顯著差異。對照組小鼠的腫瘤體積增長迅速，在給藥后的第1周，腫瘤體積就從初始的100-150mm3增長至約300-400mm3。隨著時間推移，到第3周時，腫瘤體積已達到800-1000mm3，呈現(xiàn)出典型的快速生長趨勢。而HER2特異性CART細胞治療組的腫瘤生長則受到明顯抑制。在給藥后的第1周，腫瘤體積僅增長至150-200mm3，增長速度遠低于對照組。在第2周，腫瘤體積增長較為緩慢，僅增加至250-300mm3。到第3周時，腫瘤體積雖然有所增加，但仍維持在400-500mm3的相對較低水平。通過統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間的腫瘤體積差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），這表明HER2特異性CART細胞能夠有效地抑制小鼠體內(nèi)胃癌腫瘤的生長。在腫瘤重量方面，實驗結(jié)束時對小鼠腫瘤組織進行稱重，對照組小鼠腫瘤平均重量達到（1.52±0.25）g，而HER2特異性CART細胞治療組小鼠腫瘤平均重量僅為（0.58±0.12）g，兩組差異顯著（P<0.01），進一步證明了HER2特異性CART細胞對腫瘤生長的抑制作用。生存曲線結(jié)果顯示，對照組小鼠的生存時間較短，從接種腫瘤細胞開始，平均生存時間為（25.3±3.5）天。在實驗進行到第20天左右時，部分對照組小鼠開始出現(xiàn)死亡，隨著時間推移，小鼠死亡率逐漸增加。而HER2特異性CART細胞治療組小鼠的生存時間明顯延長，平均生存時間達到（40.5±5.2）天。在實驗的前30天，治療組小鼠的生存率明顯高于對照組，僅有少數(shù)小鼠死亡。到第35天左右，雖然治療組小鼠也開始陸續(xù)死亡，但整體生存情況仍明顯優(yōu)于對照組。通過生存分析，兩組之間的生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這表明HER2特異性CART細胞治療能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存時間。組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中，腫瘤細胞密集排列，細胞核大且深染，形態(tài)不規(guī)則，可見大量的核分裂象，腫瘤細胞呈浸潤性生長，向周圍正常組織侵犯。腫瘤組織內(nèi)血管豐富，為腫瘤細胞的生長提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)。而HER2特異性CART細胞治療組的腫瘤組織中，可見明顯的腫瘤細胞凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為細胞核固縮、碎裂，細胞形態(tài)不規(guī)則，呈碎片化。腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)較多的壞死區(qū)域，壞死灶周圍可見大量的炎性細胞浸潤，其中包括淋巴細胞、巨噬細胞等。這些炎性細胞的浸潤表明機體的免疫系統(tǒng)被激活，參與了對腫瘤細胞的攻擊。免疫組化染色結(jié)果顯示，治療組腫瘤組織中HER2的表達水平明顯低于對照組，這可能是由于HER2特異性CART細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細胞數(shù)量減少，進而HER2表達降低。CART細胞體內(nèi)分布和持久性檢測結(jié)果表明，在給藥后的第1周，通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠外周血中CART細胞的比例為（5.6±1.2）%，在脾臟和肝臟等免疫器官中也檢測到了一定數(shù)量的CART細胞。隨著時間推移，到第3周時，外周血中CART細胞的比例雖有所下降，但仍維持在（2.5±0.8）%的可檢測水平。在腫瘤組織中，通過免疫組化染色和流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CART細胞能夠有效浸潤到腫瘤組織內(nèi)部，且在腫瘤組織中的分布較為均勻。在給藥后的第2周，腫瘤組織中CART細胞的浸潤數(shù)量達到峰值，之后雖略有下降，但在實驗結(jié)束時仍能檢測到一定數(shù)量的CART細胞。這表明HER2特異性CART細胞在小鼠體內(nèi)具有一定的持久性，能夠在較長時間內(nèi)維持對腫瘤細胞的殺傷作用。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功構(gòu)建并制備了HER2特異性CART細胞，通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢襟E，確保了CART細胞的高質(zhì)量和有效性。在制備過程中，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)精確構(gòu)建HER2特異性CAR基因，優(yōu)化慢病毒載體構(gòu)建和T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)與擴增條件，嚴格控制制備過程中的質(zhì)量，包括對細胞來源、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、細胞培養(yǎng)條件等關(guān)鍵因素的把控，以及對CAR基因表達水平、細胞活性和純度、細胞功能等指標(biāo)的檢測。體外研究結(jié)果明確表明，HER2特異性CART細胞對HER2陽性胃癌細胞具有顯著的抑制作用。在共培養(yǎng)實驗中，CART細胞能夠高效殺傷胃癌細胞，且殺傷效率與效靶比和作用時間密切相關(guān)。隨著效靶比的增加和作用時間的延長，殺傷率顯著上升。CART細胞還能有效抑制胃癌細胞的增殖，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。在細胞因子分泌方面，CART細胞與胃癌細胞共培養(yǎng)后，會大量分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子，這些細胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，增強了機體的免疫反應(yīng)，進一步抑制胃癌細胞的生長。體內(nèi)研究利用HER2陽性胃癌的裸鼠模型，全面評估了HER2特異性CART細胞的治療效果。實驗結(jié)果顯示，CART細胞治療組小鼠的腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤體積和重量顯著低于對照組。生存曲線表明，CART細胞治療能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存時間。組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，治療組腫瘤組織中出現(xiàn)明顯的腫瘤細胞凋亡和壞死現(xiàn)象，且有大量