H3N8亞型馬流感病毒致病性剖析與滅活疫苗研制探索一、引言1.1研究背景馬流感作為一種極具影響力的馬屬動物傳染病，給賽馬行業和養馬產業帶來了嚴重的沖擊。其病原體馬A型流感病毒，憑借其高度傳染性，能在馬群中迅速擴散，導致馬匹出現發熱、咳嗽、流涕、肌肉疼痛等一系列癥狀，嚴重影響馬匹的健康和生產性能。在賽馬活動中，一旦爆發馬流感，不僅參賽馬匹的競技狀態會大打折扣，賽事的正常進行也會受到阻礙，進而造成巨大的經濟損失。H3N8亞型馬流感病毒是馬流感病毒的重要組成部分，自1963年在美國邁阿密引發馬流感流行后，便開始在全球范圍內廣泛傳播。它不僅在美洲大陸肆虐，還迅速蔓延至歐洲、亞洲等地，給世界各地的養馬業帶來了沉重的打擊。在2007-2008年期間，我國新疆、遼寧、內蒙、武漢等地也相繼出現了H3N8亞型馬流感病毒的蹤跡，研究人員通過對現地病料的采集和分析，成功分離得到了該病毒毒株。2023年4月，美國科羅拉多州土地管理局設施內暴發的馬流感疫情，導致102匹臨時圈養的野馬死亡，經檢測，此次疫情的罪魁禍首正是H3N8亞型馬流感病毒。這些案例充分表明，H3N8亞型馬流感病毒具有較強的致病性和傳播能力，給馬屬動物的健康帶來了極大的威脅。H3N8亞型馬流感病毒的傳播途徑多種多樣，主要通過病馬咳嗽噴出的含有病毒的飛沫，經呼吸道傳染給其他馬匹。此外，該病毒還可以通過污染的飼料、飲水經口傳播，在康復馬匹的精液中，病毒也能長時間存活，這使得配種成為了病毒傳播的一種重要方式。而且，H3N8亞型馬流感病毒不僅局限于感染馬屬動物，近年來，它還展現出了跨越物種障礙的潛力。在狗和豬身上，都曾經分離出了H3N8亞型馬流感病毒，這一現象引起了人們對其公共衛生意義的高度關注。2022年和2023年，我國分別報告了三例人感染H3N8禽流感病例，進一步凸顯了該病毒的潛在威脅。鑒于H3N8亞型馬流感病毒對馬屬動物健康和養馬業的嚴重危害，以及其在全球范圍內的傳播態勢，深入研究其致病性并研制有效的滅活疫苗顯得尤為重要。通過對其致病性的研究，我們能夠更加深入地了解病毒的致病機制、傳播途徑以及對馬匹健康的影響，從而為制定科學有效的防控策略提供堅實的理論基礎。而研制滅活疫苗則是預防和控制馬流感的關鍵措施之一，它能夠提高馬匹的免疫力，有效降低病毒感染的風險，減少疫情的發生和傳播，為養馬業的健康發展提供有力的保障。1.2國內外研究現狀自1963年H3N8亞型馬流感病毒在美國邁阿密首次被發現并引發馬流感流行以來，國內外學者便對其展開了廣泛而深入的研究。在國外，H3N8亞型馬流感病毒的研究起步較早，取得了較為豐碩的成果。科研人員對病毒的基因組序列進行了詳細測定和分析，深入探究了其基因結構和進化規律。研究發現，H3N8亞型馬流感病毒的基因在不斷進化過程中發生了變異和重組，逐漸分化為“類似美國”和“類似歐洲”的譜系。通過對病毒表面蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的研究，揭示了其在病毒感染和傳播過程中的關鍵作用。HA蛋白負責病毒與宿主細胞的結合，而NA蛋白則參與病毒從宿主細胞的釋放，二者的特性和變異對病毒的致病性和傳播能力有著重要影響。國外還對病毒的致病機制進行了深入研究，通過動物實驗和臨床觀察，發現病毒主要感染馬屬動物的呼吸道上皮細胞，引發炎癥反應，導致發熱、咳嗽、流涕等癥狀，嚴重時可繼發細菌感染，引發肺炎等并發癥，甚至導致馬匹死亡。在病毒的傳播方面，國外研究表明，H3N8亞型馬流感病毒主要通過空氣飛沫傳播，咳嗽的馬能將病毒釋放到空氣中，傳播距離可達30-50米。病毒也可通過馬之間的直接接觸，或間接通過人的手、衣服以及無生命物體（如水桶、釘子、抽動等）傳播。此外，病毒在康復馬匹的精液中能長時間存活，配種也成為了病毒傳播的重要方式之一。為了有效防控H3N8亞型馬流感病毒，國外研發了多種疫苗，包括滅活疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等，并對疫苗的免疫效果和安全性進行了大量研究，為馬流感的防控提供了有力的技術支持。國內對H3N8亞型馬流感病毒的研究相對起步較晚，但近年來也取得了顯著進展。2007-2008年，我國新疆、遼寧、內蒙、武漢等地相繼出現H3N8亞型馬流感病毒后，國內科研人員迅速開展了相關研究工作。通過對現地病料的采集、病毒分離和鑒定，確定了病毒的亞型和特征。利用現代分子生物學技術，對國內分離的H3N8亞型馬流感病毒進行了基因測序和進化分析，發現我國的病毒毒株與國外流行的毒株存在一定的差異，具有獨特的進化分支。國內研究還關注了病毒對我國馬屬動物的致病性和免疫原性，通過動物實驗，觀察了感染馬匹的臨床表現、病理變化和免疫反應，為疫苗的研制提供了重要依據。在診斷技術方面，國內建立了多種針對H3N8亞型馬流感病毒的檢測方法，如血凝-血凝抑制試驗（HA-HI）、間接ELISA方法、熒光定量PCR等，這些方法具有較高的特異性和敏感性，能夠快速準確地檢測病毒和抗體，為疫情的監測和診斷提供了技術保障。在疫苗研制方面，國內也進行了積極的探索，采用國內馬流感流行毒株作為種毒，嘗試使用不同的佐劑（如白油和氫氧化鋁）研制滅活疫苗，并通過試驗優化了疫苗的制備工藝和免疫程序，取得了一定的成果。盡管國內外在H3N8亞型馬流感病毒的研究上取得了眾多成果，但仍存在一些尚待解決的問題。病毒的變異和進化是一個動態的過程，新的變異株不斷出現，其致病性和傳播能力的變化難以預測，需要持續加強監測和研究。現有的疫苗雖然能夠在一定程度上預防馬流感的發生，但對于一些新的病毒變異株，疫苗的保護效果可能會受到影響，需要不斷改進和優化疫苗的配方和制備工藝。H3N8亞型馬流感病毒的跨物種傳播風險也需要進一步研究，尤其是在人感染病例出現后，其對公共衛生的潛在威脅備受關注，需要加強對病毒跨物種傳播機制和風險評估的研究，以制定有效的防控策略。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究H3N8亞型馬流感病毒的致病性，揭示其致病機制，為防控策略的制定提供理論基礎，并研制出高效、安全的滅活疫苗，以預防和控制馬流感的發生與傳播，具體研究目的如下：明確H3N8亞型馬流感病毒的致病性：通過對病毒感染馬匹后的臨床表現、病理變化、病毒在體內的分布和復制規律等方面進行系統研究，全面了解該病毒對馬匹健康的影響，明確其致病特征和嚴重程度，為后續疫苗研制和防控措施的制定提供科學依據。揭示H3N8亞型馬流感病毒的病原機理：從分子生物學和免疫學角度，深入研究病毒的致病機制，包括病毒與宿主細胞的相互作用、病毒感染引發的免疫反應以及病毒逃逸宿主免疫防御的機制等，進一步揭示該病毒的病原本質，為開發新型治療方法和防控技術提供理論支持。研制H3N8亞型馬流感病毒的滅活疫苗：在對病毒致病性和病原機理研究的基礎上，選擇合適的病毒株和滅活方法，結合先進的疫苗制備技術，研制出針對H3N8亞型馬流感病毒的滅活疫苗，并對疫苗的免疫原性、安全性和免疫保護效果進行評估，優化疫苗的配方和制備工藝，為馬流感的防控提供有效的疫苗產品。馬流感作為一種對養馬業和賽馬業影響深遠的傳染病，H3N8亞型馬流感病毒的廣泛傳播和較強致病性給馬匹產業帶來了巨大的經濟損失和發展阻礙。本研究對H3N8亞型馬流感病毒的致病性及滅活疫苗的研制具有重要的現實意義和科學價值，具體體現在以下幾個方面：保障馬匹健康和產業發展：馬流感的爆發不僅會導致馬匹死亡和生產性能下降，還會影響馬匹的交易和賽事活動，給養馬業和賽馬業帶來嚴重的經濟損失。通過深入研究H3N8亞型馬流感病毒的致病性并研制有效的滅活疫苗，可以提高馬匹的免疫力，降低感染風險，有效預防和控制馬流感的發生與傳播，保障馬匹的健康，促進養馬業和賽馬業的穩定、可持續發展。在賽馬行業中，馬匹的健康狀況直接關系到賽事的質量和經濟效益，接種有效的疫苗能夠減少馬流感對賽事的干擾，確保賽馬活動的正常進行，維護賽馬產業的繁榮。填補國內相關研究空白：雖然國內外在H3N8亞型馬流感病毒的研究上已取得一定成果，但仍存在許多未知領域和研究不足。國內在該病毒的致病機制、疫苗研發等方面的研究相對薄弱，本研究的開展將有助于填補國內相關研究的空白，深入了解該病毒在我國的流行特點、致病規律以及與國外毒株的差異，為我國馬流感的防控提供本土化的理論和技術支持，提升我國在馬流感研究領域的水平。應對病毒跨物種傳播風險：H3N8亞型馬流感病毒已被證實具有跨物種傳播的潛力，在狗、豬等動物中均有分離到該病毒的報道，甚至出現了人感染病例，這對公共衛生安全構成了潛在威脅。深入研究該病毒的致病性和傳播機制，有助于及時發現和評估其跨物種傳播的風險，采取有效的防控措施，防止病毒在不同物種間進一步傳播，保障人類和動物的健康安全。二、H3N8亞型馬流感病毒概述2.1馬流感病毒分類與特點馬流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，依據核蛋白和基質蛋白的抗原性差異，流感病毒可劃分為甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）和丁型（D型）四類。其中，馬流感病毒為甲型流感病毒，其又可根據表面糖蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的抗原性不同，進一步分為多種亞型。目前，已知的馬流感病毒僅有H7N7和H3N8兩個亞型。H7N7亞型馬流感最早于1956年在東歐被分離出來，而H3N8亞型則最初于1963年在美國東部地區被發現。近三十年來，世界范圍內流行的馬流感疫情大多是由H3N8亞型馬流感病毒所引發。馬流感病毒呈球形或絲狀，直徑約為80-120納米。病毒粒子的最外層是一層來自宿主細胞膜的包膜，包膜上鑲嵌著兩種重要的糖蛋白刺突，即血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）。HA蛋白在病毒感染過程中起著關鍵作用，它能夠與宿主細胞表面的唾液酸受體結合，從而介導病毒進入宿主細胞；NA蛋白則參與病毒從感染細胞表面的釋放過程，促進病毒在宿主體內的傳播。在包膜內部，是由基質蛋白（M1）構成的一層結構，它對維持病毒粒子的形態和穩定性具有重要意義。核心部分則包含了病毒的基因組以及與基因組緊密結合的核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）。馬流感病毒的基因組為單股負鏈RNA，由8個節段組成，每個節段分別編碼不同的病毒蛋白。這8個基因節段分別是PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS，它們編碼的蛋白在病毒的生命周期中各自承擔著獨特的功能。PB2、PB1和PA蛋白組成了病毒的RNA聚合酶復合物，負責病毒基因組的轉錄和復制；HA蛋白負責病毒與宿主細胞的吸附和融合；NA蛋白參與病毒的釋放；NP蛋白則與病毒基因組結合，保護基因組并參與病毒的轉錄和復制過程；M蛋白包括M1和M2，M1蛋白在病毒粒子的組裝和形態維持中起重要作用，M2蛋白則是一種離子通道蛋白，參與病毒感染初期的脫殼過程；NS蛋白包括NS1和NS2，NS1蛋白具有多種功能，如抑制宿主細胞的免疫反應等，NS2蛋白則參與病毒的組裝和釋放。馬流感病毒的這些生物學特性，決定了其感染宿主的范圍、傳播方式以及致病機制，也為后續對H3N8亞型馬流感病毒的致病性研究和滅活疫苗的研制奠定了基礎。2.2H3N8亞型馬流感病毒特征H3N8亞型馬流感病毒作為馬流感病毒的重要成員，在結構、基因以及抗原性等方面展現出獨特的特征。從結構特征來看，H3N8亞型馬流感病毒粒子呈多形性，多數為球形，直徑在80-120納米之間，部分也可呈絲狀。病毒粒子由包膜、基質蛋白和核心三部分組成。其包膜源于宿主細胞膜，上面鑲嵌著兩種關鍵的糖蛋白刺突，即血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）。HA蛋白是一種三聚體結構，由3條相同的多肽鏈組成，每條多肽鏈又包含HA1和HA2兩個亞基。HA1亞基負責識別并結合宿主細胞表面的唾液酸受體，是病毒感染宿主細胞的關鍵步驟；HA2亞基則在病毒與宿主細胞融合過程中發揮重要作用，其具有一個高度保守的融合肽，在低pH環境下能夠發生構象變化，促使病毒包膜與宿主細胞膜融合，從而使病毒進入宿主細胞內。NA蛋白為四聚體結構，由4個相同的單體組成，每個單體包含一個催化結構域和一個莖部結構域。催化結構域能夠水解宿主細胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基，破壞病毒與宿主細胞之間的結合，幫助病毒從感染細胞表面釋放出來，促進病毒在宿主體內的傳播。包膜內部的基質蛋白（M1）形成一層緊密的結構，包裹著病毒的核心，對維持病毒粒子的形態和穩定性起著重要作用。核心部分包含病毒的單股負鏈RNA基因組，由8個節段組成，分別編碼不同的病毒蛋白，這些基因節段與核蛋白（NP）和聚合酶蛋白（PA、PB1、PB2）緊密結合，形成核糖核蛋白復合體（RNP）。在基因特征方面，H3N8亞型馬流感病毒的8個基因節段分別編碼不同的蛋白，各基因節段在病毒的生命周期中承擔著獨特的功能。PB2、PB1和PA蛋白共同構成病毒的RNA聚合酶復合物，負責病毒基因組的轉錄和復制。PB2蛋白能夠識別宿主細胞的轉錄起始信號，啟動病毒mRNA的合成；PB1蛋白具有RNA聚合酶活性，催化病毒RNA的合成；PA蛋白則參與病毒聚合酶復合物的組裝和調節。HA基因編碼的HA蛋白，如前所述，在病毒感染和傳播過程中起著關鍵作用，其基因序列的變異會導致HA蛋白抗原性的改變，影響病毒與宿主細胞的結合能力以及病毒的傳播和致病能力。NA基因編碼的NA蛋白，其基因序列的變化也會影響NA蛋白的活性和抗原性，進而影響病毒從感染細胞的釋放和傳播。NP基因編碼的核蛋白與病毒基因組緊密結合，保護基因組免受核酸酶的降解，同時參與病毒的轉錄和復制過程。M基因編碼M1和M2蛋白，M1蛋白在病毒粒子的組裝和形態維持中發揮重要作用，M2蛋白則是一種離子通道蛋白，在病毒感染初期，M2蛋白協助病毒脫殼，使病毒基因組能夠釋放到宿主細胞內。NS基因編碼NS1和NS2蛋白，NS1蛋白具有多種功能，能夠抑制宿主細胞的免疫反應，促進病毒的復制和傳播；NS2蛋白參與病毒的組裝和釋放過程。H3N8亞型馬流感病毒的基因在進化過程中會發生變異和重組，導致病毒的抗原性和生物學特性發生改變。自1963年首次被發現以來，H3N8亞型馬流感病毒的基因不斷進化，逐漸分化為“類似美國”和“類似歐洲”的譜系。基因的變異和重組使得病毒能夠逃避宿主的免疫防御，增加了防控的難度。H3N8亞型馬流感病毒的抗原性也具有獨特之處。HA和NA蛋白是病毒的主要抗原，它們的抗原性會隨著病毒的進化而發生變化。由于HA和NA蛋白的抗原性變異，使得病毒能夠逃避宿主免疫系統的識別和攻擊，導致病毒在馬群中的持續傳播和流行。當馬群中大部分馬匹對某一特定抗原型的病毒產生免疫力后，病毒可能通過抗原變異產生新的抗原型，從而突破宿主的免疫防線，引發新的疫情。對H3N8亞型馬流感病毒抗原性的研究，有助于了解病毒的進化規律和傳播趨勢，為疫苗的研制和防控策略的制定提供重要依據。通過對不同地區、不同時間分離的H3N8亞型馬流感病毒株的抗原性分析，可以及時發現病毒的抗原變異情況，調整疫苗的配方，提高疫苗的保護效果。2.3流行病學特征H3N8亞型馬流感病毒在流行病學方面具有顯著特點，其傳播途徑、宿主范圍以及在不同地區的流行情況備受關注。從傳播途徑來看，H3N8亞型馬流感病毒主要通過空氣傳播和接觸傳播。病馬咳嗽噴出的含有病毒的飛沫是其主要傳播源，這些飛沫在空氣中傳播，健康馬匹吸入后極易感染。研究表明，咳嗽的馬能將病毒釋放到空氣中，傳播距離可達30-50米。病毒也可通過馬之間的直接接觸傳播，如相互舔舐、摩擦等行為都可能導致病毒的傳播。間接接觸傳播也是常見方式，病毒可通過人的手、衣服以及無生命物體，如水桶、釘子、抽動等作為媒介進行傳播。在馬廄中，若飼養工具未進行嚴格消毒，一匹感染病毒的馬使用過的水桶，很可能成為病毒傳播的媒介，使其他馬匹感染。病毒在康復馬匹的精液中能長時間存活，這使得配種成為了病毒傳播的一種重要方式，通過精液傳播病毒，可能導致病毒在不同地區和馬群之間擴散。在宿主范圍上，H3N8亞型馬流感病毒主要感染馬屬動物，包括馬、騾、驢等。任何年齡段、品種和性別的馬屬動物對該病毒都具有易感性，其中幼駒和老年馬匹由于免疫力相對較低，更容易感染且感染后癥狀可能更為嚴重。近年來的研究發現，H3N8亞型馬流感病毒還具有跨越物種障礙的潛力。在狗身上已經成功分離出該病毒，美國佛羅里達州曾發現狗死于H3N8病毒感染，并且該病毒已經能夠在狗與狗之間傳播。在豬和海豹等動物中也有分離到H3N8亞型馬流感病毒的報道，英國曾有162只海豹死于H3N8病毒感染引起的肺炎。這些發現表明，H3N8亞型馬流感病毒的宿主范圍在逐漸擴大，其跨物種傳播的風險也在增加。在不同地區的流行情況方面，H3N8亞型馬流感病毒呈現出全球分布的態勢。自1963年在美國邁阿密首次引發馬流感流行后，迅速蔓延至北美、南美和歐洲等地區，在1964年和1965年期間造成大規模爆發。此后，該病毒在世界各地的養馬國家和地區時有出現。在歐洲，英國、法國、德國等國家都曾遭受H3N8亞型馬流感病毒的侵襲，疫情的爆發對當地的賽馬業和養馬業造成了嚴重的經濟損失。在亞洲，日本、韓國等國家也有馬流感疫情的報道，我國在2007-2008年期間，新疆、遼寧、內蒙、武漢等地相繼出現H3N8亞型馬流感病毒，給當地的馬屬動物健康帶來了威脅。雖然近年來通過加強防控措施，馬流感疫情在一些地區得到了有效控制，但由于病毒的不斷進化和傳播，仍存在疫情再次爆發的風險。在一些賽馬活動頻繁、馬匹流動量大的地區，如香港、迪拜等地，馬流感的防控形勢依然嚴峻，一旦疫情爆發，不僅會影響賽事的正常進行，還可能導致病毒的快速傳播。三、H3N8亞型馬流感病毒致病性研究3.1實驗材料與方法本研究選取了12-18個月齡的健康馬匹作為主要實驗對象，共8匹，體重在300-400千克之間，購自專業馬場，并在實驗前進行了全面的健康檢查，確保其未感染馬流感病毒及其他常見傳染病，且血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測為陰性。選擇該年齡段的馬匹，是因為此階段馬匹免疫系統發育相對成熟，但又未因長期接觸外界病原體而產生復雜的免疫背景，能更清晰地觀察病毒感染后的致病情況。考慮到H3N8亞型馬流感病毒有跨物種傳播的可能，尤其是對犬類有一定的易感性，本實驗還選用了6只健康的1歲無病史犬，體重在10-15千克之間，隨機分為兩組，一組為H3N8亞型馬流感病毒感染組，另一組為對照組。犬只購自正規犬場，同樣在實驗前進行健康篩查，確保無相關疾病感染史。實驗中所使用的H3N8亞型馬流感病毒毒株為A/Equine/Huabei/01/2007（H3N8）雞胚傳代F3代毒，由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所分離、鑒定、傳代和保存。該毒株是從華北地區感染H3N8亞型馬流感病毒的馬匹中分離得到，對我國馬流感的研究具有代表性。在使用前，通過雞胚接種法對病毒進行擴增和滴度測定，將病毒液保存在-80℃冰箱中備用。擴增后的病毒液經測定，其半數雞胚感染劑量（EID??）為10?.?/mL，確保病毒具有足夠的活性和感染力，用于后續的動物感染實驗。實驗所需的主要儀器包括：SPF雞胚孵育箱，用于雞胚的孵化和病毒的雞胚接種培養，維持雞胚生長所需的溫度（37℃）和濕度（50%-60%）環境；二氧化碳培養箱，用于細胞培養，為細胞提供適宜的生長環境（37℃，5%CO?）；高速冷凍離心機，可在低溫條件下對樣本進行高速離心，用于病毒的濃縮和純化，以及細胞和組織樣本的處理；實時熒光定量PCR儀，用于檢測病毒核酸，通過對病毒特異性基因的擴增和熒光信號的監測，實現對病毒載量的精確測定；酶標儀，用于檢測血清中的抗體水平，通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA），定量分析樣本中的抗體含量；生物安全柜，在進行病毒操作時，提供一個相對安全的工作環境，防止病毒泄漏，保護實驗人員和環境安全。病毒感染途徑主要采用噴霧感染和滴鼻感染兩種方式。對于馬匹，采用噴霧感染方式，將病毒液用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度，使用專業的噴霧設備，在隔離的實驗室內對馬匹進行噴霧感染。每匹馬的感染劑量設定為10?.2-10?.?EID??，該劑量是根據前期預實驗及相關文獻研究確定，能夠使馬匹產生典型的馬流感癥狀。感染時，確保馬匹充分吸入病毒霧滴，以模擬自然感染途徑。對于犬只，感染組采用滴鼻給藥方式，每只犬在左右鼻孔內分別滴入50微升的病毒含液，含液中病毒濃度為10?.?EID??/mL。對照組犬則采取同樣的操作進行安慰給藥，滴入等量的無菌生理鹽水，以對比觀察病毒感染對犬只的影響。樣本采集方面，在病毒感染后，每天定時采集馬匹和犬只的臨床樣本。對于馬匹，采集鼻腔分泌物、血液樣本，鼻腔分泌物用于檢測病毒的存在和病毒載量變化，血液樣本用于檢測血清中的抗體水平以及血常規指標，評估病毒感染對機體免疫和血液系統的影響。在感染后的第3天、第5天、第7天、第10天和第14天，分別采集糞便樣本，檢測病毒是否通過糞便排出，以及排出的病毒載量。對于犬只，在感染后的每天采集鼻腔分泌物和血液樣本，同樣進行病毒檢測和抗體檢測。在實驗結束后，對感染組和對照組的犬只進行安樂死，采集氣管、支氣管、肺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣本，用于病理組織學檢查，觀察病毒感染對各組織器官的病理損傷情況。對于出現嚴重癥狀或瀕臨死亡的馬匹和犬只，及時進行安樂死，并采集相應的組織樣本進行病理分析。3.2病毒對馬的致病性研究3.2.1感染馬的臨床表現在感染H3N8亞型馬流感病毒后，馬匹在1-2天內便開始出現明顯的臨床癥狀。體溫迅速升高是最早出現的癥狀之一，在感染后的第1天，馬匹體溫便從正常的37.5-38.5℃，快速升高至40-41℃，且這種高熱狀態持續了3-5天，隨后才逐漸下降。在體溫升高的同時，馬匹還出現了咳嗽癥狀，最初表現為偶爾的輕咳，隨著感染時間的延長，咳嗽頻率逐漸增加，且咳嗽程度加重，發展為頻繁的劇烈干咳，持續時間長達1-2周。鼻腔分泌物也明顯增多，初期為漿液性鼻液，隨著病情發展，逐漸變為黏液性鼻液。部分馬匹還表現出呼吸急促的癥狀，呼吸頻率從正常的每分鐘12-20次，增加至每分鐘30-40次。在感染后的第3-5天，呼吸急促癥狀最為明顯，馬匹表現出鼻翼扇動、呼吸淺表等現象。馬匹的精神狀態也受到了嚴重影響，表現出精神沉郁、食欲不振，對周圍環境的反應變得遲鈍。原本活潑好動的馬匹，在感染后變得萎靡不振，不愿走動，采食量明顯減少，甚至出現完全拒食的情況。肌肉疼痛也是常見癥狀之一，馬匹在站立和行走時表現出明顯的不適感，運動能力下降，步態不穩。3.2.2病程進展H3N8亞型馬流感病毒感染馬匹后的病程發展呈現出階段性特點。在感染初期，即1-3天內，病毒在馬匹體內迅速繁殖，主要感染呼吸道上皮細胞。此時，馬匹主要表現為發熱、咳嗽、流涕等上呼吸道感染癥狀，病情逐漸加重。從感染后的第3-7天，進入病情加重階段，病毒進一步擴散到氣管、支氣管等下呼吸道，引發更為嚴重的炎癥反應。咳嗽癥狀加劇，呼吸急促明顯，鼻腔分泌物增多且變得黏稠。部分馬匹可能會繼發細菌感染，出現膿性鼻液、肺部啰音等癥狀，導致病情進一步惡化。從第7-14天，部分馬匹的病情開始逐漸緩解。體溫逐漸恢復正常，咳嗽頻率和程度減輕，鼻腔分泌物減少。馬匹的精神狀態和食欲也逐漸恢復，開始主動進食和活動。仍有少數馬匹病情恢復緩慢，咳嗽癥狀可能會持續更長時間，甚至需要2-3周才能完全恢復。在病情恢復過程中，若馬匹再次受到應激因素的影響，如氣候變化、運輸等，可能會導致病情反復，再次出現發熱、咳嗽等癥狀。3.2.3病理變化對感染H3N8亞型馬流感病毒后死亡或安樂死的馬匹進行解剖，發現其呼吸道和肺臟等組織器官出現了明顯的病理變化。在呼吸道方面，鼻腔、咽喉部和氣管黏膜出現充血、水腫現象，黏膜表面附著有大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細胞出現壞死、脫落，管腔內可見大量炎性滲出物，包括中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等。肺臟的病理變化最為顯著，肺組織呈現不同程度的實變，顏色暗紅。切面可見大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內充滿了漿液、纖維素和炎性細胞，導致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細胞出現變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤。在肺組織中還可見到支氣管肺炎的病變特征，即細支氣管及其周圍的肺泡發生炎癥，細支氣管壁充血、水腫，管腔內有炎性滲出物，周圍肺泡內充滿炎性細胞和纖維素。除了呼吸道和肺臟，部分馬匹的脾臟和淋巴結也出現了腫大現象。脾臟質地變軟，切面可見脾小體增大、增多。淋巴結內淋巴細胞增生，髓質內可見大量漿細胞浸潤，表明機體的免疫反應被激活。這些病理變化表明，H3N8亞型馬流感病毒感染主要引起馬匹呼吸道和肺臟的炎癥病變，嚴重影響呼吸功能，同時也會引發機體的免疫反應。3.3病毒對其他動物的致病性研究（以犬為例）3.3.1感染犬的實驗設計在研究H3N8亞型馬流感病毒對其他動物的致病性時，選擇犬作為研究對象具有重要意義。犬作為常見的寵物和工作動物，與人類生活密切相關，了解病毒對犬的致病性，對于評估病毒的跨物種傳播風險以及保障公共衛生安全具有重要價值。本實驗選用6只健康的1歲無病史犬，體重在10-15千克之間。犬只隨機分為兩組，一組為H3N8亞型馬流感病毒感染組，另一組為對照組，每組各3只。在感染前，對所有犬只進行全面的健康檢查，包括體溫、血常規、血清學檢測等，確保犬只健康且未感染H3N8亞型馬流感病毒及其他常見傳染病，血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測為陰性。感染組犬采用滴鼻給藥方式感染病毒，每只犬在左右鼻孔內分別滴入50微升的病毒含液，含液中病毒濃度為10?.?EID??/mL。對照組犬則采取同樣的操作進行安慰給藥，滴入等量的無菌生理鹽水。在感染后，將感染組和對照組犬分別置于獨立的隔離飼養環境中，保持環境溫度在25-26℃，濕度在50%-60%，給予充足的食物和飲水，并每天定時進行觀察和記錄。3.3.2臨床癥狀與病理變化感染H3N8亞型馬流感病毒的犬只在感染后1-2天開始出現臨床癥狀。體溫升高是最早出現的癥狀之一，感染組犬的體溫在感染后第1天便從正常的38-39℃升高至39.5-40.5℃，并持續3-4天。隨后，犬只出現呼吸道癥狀，表現為咳嗽、打噴嚏和流涕。咳嗽最初為偶爾的輕咳，隨著感染時間的延長，咳嗽頻率逐漸增加，且咳嗽程度加重，發展為頻繁的劇烈咳嗽，持續時間約為1-2周。流涕癥狀在感染后第2天開始出現，初期為漿液性鼻液，后期逐漸變為黏液性鼻液。部分感染犬還出現了精神沉郁、食欲不振的癥狀，對周圍環境的反應變得遲鈍，活動量明顯減少，采食量降低，甚至出現完全拒食的情況。對感染H3N8亞型馬流感病毒后死亡或安樂死的犬只進行解剖，發現其呼吸道和肺臟等組織器官出現了明顯的病理變化。鼻腔、咽喉部和氣管黏膜出現充血、水腫現象，黏膜表面附著有大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細胞出現壞死、脫落，管腔內可見大量炎性滲出物，包括中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等。肺臟的病理變化較為顯著，肺組織呈現不同程度的實變，顏色暗紅。切面可見大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內充滿了漿液、纖維素和炎性細胞，導致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細胞出現變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤。與感染H3N8亞型馬流感病毒的馬匹相比，犬只的病理變化在程度上相對較輕，但病變部位和病理特征具有相似性，都主要集中在呼吸道和肺臟，表現為炎癥反應和組織損傷。這表明H3N8亞型馬流感病毒對犬具有一定的致病性，且其致病機制與感染馬匹時具有一定的相似性。3.4致病機制探討從分子生物學角度來看，H3N8亞型馬流感病毒感染宿主細胞是一個復雜且有序的過程。病毒的血凝素（HA）蛋白在感染起始階段發揮著關鍵作用，HA蛋白的HA1亞基能夠特異性地識別并結合宿主細胞表面的唾液酸受體。唾液酸受體廣泛存在于呼吸道上皮細胞表面，其結構和分布特點決定了病毒的感染靶向性。研究表明，不同宿主細胞表面唾液酸受體的結構和表達水平存在差異，這也在一定程度上影響了病毒對不同宿主的感染能力和致病性。當HA蛋白與唾液酸受體結合后，病毒粒子通過內吞作用進入宿主細胞內，形成內體。在內體的酸性環境下，HA蛋白的構象發生變化，其HA2亞基的融合肽暴露并插入宿主細胞膜，促使病毒包膜與內體膜融合，從而將病毒基因組釋放到宿主細胞的細胞質中。進入細胞質的病毒基因組在病毒聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）和核蛋白（NP）的作用下，開始進行轉錄和復制。PB2蛋白能夠識別宿主細胞的轉錄起始信號，啟動病毒mRNA的合成。PB1蛋白具有RNA聚合酶活性，負責催化病毒RNA的合成，以病毒的負鏈RNA為模板，合成正鏈mRNA和新的負鏈RNA。PA蛋白則參與病毒聚合酶復合物的組裝和調節，確保轉錄和復制過程的順利進行。在轉錄和復制過程中，病毒利用宿主細胞的轉錄和翻譯系統，合成自身的各種蛋白，包括HA、NA、NP、M1、M2等。這些蛋白在宿主細胞內經過一系列的加工和修飾后，組裝成新的病毒粒子。新合成的病毒粒子通過與宿主細胞膜融合，以出芽的方式釋放到細胞外，繼續感染其他宿主細胞。H3N8亞型馬流感病毒的蛋白與宿主細胞之間存在著復雜的相互作用。HA蛋白除了在病毒感染過程中與宿主細胞表面受體結合外，還可能與宿主細胞內的一些蛋白相互作用，影響宿主細胞的正常生理功能。研究發現，HA蛋白可以與宿主細胞內的一些信號通路蛋白相互作用，激活或抑制某些信號通路，從而影響宿主細胞的免疫反應和凋亡過程。NA蛋白在病毒感染過程中，通過水解宿主細胞表面糖蛋白和糖脂末端的唾液酸殘基，破壞病毒與宿主細胞之間的結合，幫助病毒從感染細胞表面釋放出來。NA蛋白也可能與宿主細胞內的一些蛋白相互作用，影響宿主細胞的代謝和免疫功能。M1蛋白是病毒粒子的重要組成部分，它在病毒組裝和形態維持中發揮著重要作用。M1蛋白可以與病毒的基因組、核蛋白以及宿主細胞膜相互作用，促進病毒粒子的組裝和出芽釋放。M1蛋白還可以與宿主細胞內的一些蛋白相互作用，調節宿主細胞的免疫反應。研究表明，M1蛋白可以抑制宿主細胞內干擾素的產生，從而逃避宿主的免疫防御。NS1蛋白是一種非結構蛋白，它具有多種功能，能夠抑制宿主細胞的免疫反應。NS1蛋白可以與宿主細胞內的一些免疫相關蛋白相互作用，如雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（PKR）、真核起始因子2α（eIF2α）等，抑制它們的活性，從而阻止宿主細胞產生抗病毒免疫反應。NS1蛋白還可以調節宿主細胞的基因表達，促進病毒的復制和傳播。綜合來看，H3N8亞型馬流感病毒感染宿主細胞后，通過病毒蛋白與宿主細胞的相互作用，破壞宿主細胞的正常生理功能，引發炎癥反應和免疫反應，從而導致宿主發病。病毒感染引發的炎癥反應是導致宿主病理損傷的重要原因之一。病毒感染呼吸道上皮細胞后，激活宿主細胞內的炎癥信號通路，如核因子κB（NF-κB）信號通路等，導致炎癥因子的大量釋放，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等。這些炎癥因子會引起呼吸道黏膜的充血、水腫、壞死等病理變化，導致咳嗽、流涕、呼吸急促等臨床癥狀。病毒感染還會引發宿主的免疫反應，包括固有免疫和適應性免疫。固有免疫是宿主抵御病毒感染的第一道防線，通過模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關分子模式（PAMPs），激活免疫細胞，產生干擾素等抗病毒物質。然而，病毒可以通過多種方式逃避固有免疫的識別和攻擊，如NS1蛋白抑制干擾素的產生等。適應性免疫則通過T細胞和B細胞的活化，產生特異性的抗體和細胞免疫反應，來清除病毒。但在病毒感染過程中，病毒的變異和免疫逃逸機制可能會導致適應性免疫的效果受到影響，使得病毒能夠在宿主體內持續存在和傳播。四、H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗研制4.1研制材料與方法本研究選用A/Equine/Huabei/01/2007（H3N8）雞胚傳代F3代毒作為種毒，該毒株由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所分離、鑒定、傳代和保存。其來源清晰，經過多代培養和鑒定，病毒特性穩定，對我國馬流感的研究和疫苗研制具有重要的代表性和適用性。在佐劑選擇方面，分別選用白油和氫氧化鋁作為佐劑。白油是一種常用的油性佐劑，能夠增強疫苗的免疫原性，延長抗原在體內的釋放時間，刺激機體產生持久的免疫反應。氫氧化鋁則是一種經典的無機佐劑，它可以吸附抗原，促進抗原的呈遞，增強機體的免疫應答。兩種佐劑具有不同的作用機制和特點，通過對比研究，有助于篩選出更適合H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗的佐劑。病毒培養采用SPF雞胚接種法。將種毒用無菌生理鹽水稀釋至合適濃度，接種于9-11日齡的SPF雞胚尿囊腔。接種后，將雞胚置于37℃恒溫孵育箱中繼續孵育，每隔12小時照蛋觀察雞胚的存活情況，及時棄去死亡的雞胚。孵育48-72小時后，收獲雞胚尿囊液。收獲的尿囊液經無菌檢驗和病毒含量測定合格后，作為制備滅活疫苗的抗原液。無菌檢驗采用常規的細菌和真菌培養方法，確保尿囊液中無雜菌污染；病毒含量測定則采用半數雞胚感染劑量（EID??）測定法，準確測定尿囊液中的病毒滴度。滅活工藝選用β-丙內酯（β-PL）作為滅活劑。將收獲的抗原液按一定比例加入β-PL，使其終濃度達到0.02%-0.05%。在2-8℃條件下，滅活24-48小時。滅活過程中，定時取樣進行無菌檢驗和病毒滅活效果檢測。無菌檢驗確保滅活后的抗原液無雜菌生長；病毒滅活效果檢測則通過接種SPF雞胚，觀察雞胚是否死亡，以確定病毒是否被完全滅活。只有經過嚴格檢測，確認病毒被完全滅活且無雜菌污染的抗原液，才能用于后續的疫苗配制。疫苗配制時，根據選用的佐劑不同，采用不同的配制方法。對于白油佐劑疫苗，將滅活后的抗原液與白油按一定比例（通常為1:3-1:5）混合，使用乳化設備進行乳化，制備成油包水型乳劑疫苗。乳化過程中，嚴格控制乳化時間、速度和溫度，確保乳劑的穩定性和均勻性。對于氫氧化鋁佐劑疫苗，將滅活后的抗原液與氫氧化鋁佐劑按一定比例（根據氫氧化鋁的含量和抗原液的濃度確定合適比例）混合，充分攪拌均勻，使抗原吸附在氫氧化鋁顆粒表面，制備成氫氧化鋁佐劑疫苗。配制好的疫苗進行外觀、物理性狀、無菌檢驗、安全性檢驗等質量檢測，確保疫苗質量符合相關標準。外觀檢查主要觀察疫苗的顏色、透明度、有無分層等；物理性狀檢測包括乳劑的穩定性、黏度等；無菌檢驗確保疫苗無雜菌污染；安全性檢驗則通過接種實驗動物，觀察動物是否出現不良反應，以評估疫苗的安全性。4.2滅活方法的選擇與優化在滅活疫苗的研制過程中，滅活方法的選擇至關重要，它直接關系到疫苗的安全性、有效性以及免疫原性。目前，常用的病毒滅活方法主要包括物理方法、化學方法和生物學方法，其中甲醛滅活和β-丙內酯滅活是化學滅活方法中較為常見的兩種，以下將對這兩種滅活方法進行詳細的對比分析。甲醛滅活是一種傳統的病毒滅活方法，其作用機制主要是通過甲醛分子中的醛基與病毒蛋白的氨基發生反應，形成亞甲基橋，從而破壞病毒蛋白的結構和功能，使病毒失去感染性。甲醛滅活具有成本較低、使用方便等優點，在疫苗生產中曾經被廣泛應用。甲醛滅活也存在一些明顯的缺點。甲醛可能會與病毒的抗原表位發生反應，導致抗原結構改變，從而影響疫苗的免疫原性。在使用甲醛滅活病毒時，需要嚴格控制甲醛的濃度和作用時間，以確保病毒被完全滅活的同時，盡量減少對疫苗免疫原性的影響。若甲醛殘留過多，還可能會對機體產生一定的毒性作用，引起接種動物的不良反應。β-丙內酯（β-PL）滅活則是一種相對較新且具有獨特優勢的滅活方法。β-PL能夠與病毒核酸中的鳥嘌呤殘基發生烷基化反應，從而破壞病毒的核酸結構，使其失去復制能力。與甲醛滅活相比，β-PL滅活具有諸多優點。β-PL在較低濃度下就能快速有效地滅活病毒，滅活效率高。它對病毒抗原的損傷較小，能夠較好地保留病毒的免疫原性。β-PL在滅活過程中不會引入過多的化學物質，且其自身能夠在一定條件下分解為無毒的物質，不會對疫苗的安全性產生不良影響。β-PL滅活也存在一些不足之處，如β-PL是一種有毒的化學物質，在使用過程中需要嚴格遵守安全操作規程，做好防護措施，以防止操作人員中毒。β-PL的價格相對較高，這在一定程度上增加了疫苗的生產成本。綜合考慮甲醛滅活和β-PL滅活的優缺點，結合本研究的實際情況，選擇β-PL作為H3N8亞型馬流感病毒的滅活劑更為合適。在確定使用β-PL進行滅活后，對其滅活條件進行了優化。首先，對β-PL的濃度進行了篩選，分別設置了0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%等不同的終濃度梯度。將病毒液與不同濃度的β-PL在2-8℃條件下混合，作用不同時間后，接種SPF雞胚，觀察雞胚的死亡情況，以確定病毒是否被完全滅活。結果表明，當β-PL終濃度為0.02%-0.05%時，在2-8℃條件下作用24-48小時，能夠有效滅活H3N8亞型馬流感病毒，且隨著β-PL濃度的增加和作用時間的延長，病毒滅活效果更可靠。考慮到β-PL的毒性和成本因素，最終確定β-PL的終濃度為0.03%，作用時間為36小時。在該條件下，既能確保病毒被完全滅活，又能較好地保留病毒的免疫原性，同時降低了β-PL的使用量，減少了對環境和操作人員的潛在危害。在優化β-PL滅活條件的過程中，還對滅活后的病毒進行了一系列的質量檢測。除了通過接種SPF雞胚檢測病毒滅活效果外，還采用SDS-PAGE、Westernblot等方法對滅活后的病毒蛋白進行分析，觀察病毒蛋白的結構和完整性。通過這些檢測方法，進一步驗證了在優化的β-PL滅活條件下，病毒能夠被完全滅活，且病毒蛋白的免疫原性得到了較好的保留。4.3疫苗質量控制為確保研制的H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗質量符合要求，制定了全面且嚴格的質量控制標準，涵蓋無菌檢驗、安全性檢驗、效力檢驗等多個關鍵環節。無菌檢驗是疫苗質量控制的基礎環節，其目的在于確保疫苗中不含有任何雜菌污染，避免因雜菌感染而引發接種動物的不良反應。采用常規的細菌和真菌培養方法，將疫苗樣本分別接種于適宜的細菌培養基（如營養瓊脂培養基、血瓊脂培養基等）和真菌培養基（如沙氏培養基等）上，在37℃（細菌培養）和25℃（真菌培養）條件下培養5-7天。定期觀察培養基上是否有菌落生長，若在培養期間未觀察到任何細菌或真菌菌落的出現，則判定疫苗無菌檢驗合格；若有菌落生長，則需進一步鑒定雜菌種類，并對疫苗進行相應處理，如重新過濾除菌、廢棄等。安全性檢驗是保障疫苗使用安全的重要措施。將疫苗接種于實驗動物（如小鼠、豚鼠、家兔等）體內，觀察動物在接種后的反應。對于小鼠，每只小鼠腹腔注射一定劑量（通常為0.2-0.5毫升）的疫苗，接種后連續觀察7-14天。期間，密切關注小鼠的精神狀態、食欲、活動能力、體溫變化等情況，記錄是否出現異常癥狀，如精神萎靡、食欲不振、活動減少、發熱、腹瀉、抽搐等。對于豚鼠，每只豚鼠皮下或肌肉注射適量（一般為0.5-1.0毫升）的疫苗，同樣觀察7-14天，觀察指標與小鼠類似。家兔則通過耳緣靜脈注射疫苗（劑量一般為1-2毫升），觀察家兔的體溫變化、局部反應（如注射部位是否出現紅腫、硬結等）以及全身反應（如精神狀態、食欲等），連續觀察7天。若實驗動物在觀察期內未出現任何異常反應，或僅出現輕微的、可自行恢復的反應（如短暫的食欲下降、輕微的局部紅腫等），則判定疫苗安全性檢驗合格；若動物出現嚴重的不良反應甚至死亡，則需對疫苗的安全性進行深入分析，查找原因，如疫苗中是否存在內毒素污染、滅活不完全等問題。效力檢驗是評估疫苗免疫效果的核心指標，直接關系到疫苗能否有效預防H3N8亞型馬流感病毒的感染。采用動物免疫攻毒試驗來進行效力檢驗，選擇一定數量（通常為10-15匹）的健康馬匹作為實驗對象。將馬匹隨機分為疫苗接種組和對照組，疫苗接種組按照制定的免疫程序接種疫苗，對照組則接種等量的無菌生理鹽水。免疫程序一般包括基礎免疫和加強免疫，基礎免疫接種1-2次，每次間隔2-3周，加強免疫在基礎免疫后的2-4周進行。在完成免疫程序后的2-4周，對兩組馬匹進行攻毒實驗，攻毒采用H3N8亞型馬流感病毒強毒株，攻毒劑量為能使未免疫馬匹產生典型馬流感癥狀的劑量。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現情況和嚴重程度，持續觀察14-21天。記錄馬匹的發病情況、發病率和死亡率等數據。通過比較疫苗接種組和對照組馬匹的發病情況，評估疫苗的效力。若疫苗接種組馬匹的發病率、死亡率明顯低于對照組，且臨床癥狀較輕，如體溫升高幅度較小、咳嗽和流涕癥狀持續時間較短等，則判定疫苗效力檢驗合格。還可以通過檢測馬匹血清中的抗體水平來評估疫苗的效力，在免疫前后和攻毒后定期采集馬匹血清，采用血凝抑制試驗（HI）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等方法檢測血清中的抗體滴度。一般來說，免疫后血清抗體滴度顯著升高，且在攻毒后能夠維持較高水平，表明疫苗能夠刺激機體產生有效的免疫應答，具有良好的效力。五、滅活疫苗免疫效果與安全性評價5.1動物實驗設計本研究選用15匹12-18個月齡的健康馬匹作為實驗對象，這些馬匹購自專業馬場，在實驗前進行了全面的健康檢查，確保未感染馬流感病毒及其他常見傳染病，且血清中H3N8亞型馬流感病毒抗體檢測為陰性。將馬匹隨機分為三組，每組5匹。疫苗接種方式采用肌肉注射，這種方式能夠使疫苗迅速進入機體循環系統，激發免疫反應。第一組接種白油佐劑滅活疫苗，每匹馬的接種劑量為5毫升，其中抗原含量為10?.?EID??。第二組接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗，接種劑量同樣為5毫升，抗原含量也為10?.?EID??。第三組作為對照組，接種等量的無菌生理鹽水。免疫程序設計為：首免后間隔3周進行二免。在首免后的第0周、第2周、第3周、第4周、第6周以及二免后的第2周、第4周、第6周，分別采集馬匹的血液樣本，用于檢測血清中的抗體水平。通過定期檢測抗體水平，能夠動態觀察疫苗免疫后機體的免疫應答情況，評估疫苗的免疫效果。在二免后的第4周，對所有馬匹進行攻毒實驗，攻毒采用H3N8亞型馬流感病毒強毒株，攻毒劑量為10?.2-10?.?EID??，通過噴霧感染的方式使馬匹感染病毒。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現情況和嚴重程度，持續觀察14-21天。記錄馬匹的發病情況、發病率和死亡率等數據，以此來評估疫苗的免疫保護效果。在整個實驗過程中，對馬匹進行單獨飼養，保持飼養環境的清潔衛生，提供充足的食物和飲水，密切觀察馬匹的健康狀況，確保實驗的順利進行。5.2免疫效果評價5.2.1抗體水平檢測在免疫效果評價中，抗體水平檢測是重要的評估指標之一。本研究通過血凝抑制試驗（HI）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對免疫動物血清中的抗體水平進行了檢測。HI試驗是基于病毒表面的血凝素蛋白能夠與紅細胞表面的受體結合，從而使紅細胞發生凝集的原理。當血清中存在針對病毒的特異性抗體時，抗體能夠與血凝素蛋白結合，阻斷其與紅細胞的結合，從而抑制紅細胞的凝集現象。在HI試驗中，首先將待檢血清進行系列稀釋，然后加入一定量的已知病毒懸液，充分混合后孵育一段時間。接著加入新鮮的紅細胞懸液，繼續孵育并觀察紅細胞的凝集情況。以能夠完全抑制紅細胞凝集的血清最高稀釋度作為該血清的HI抗體滴度。通過檢測不同時間點免疫動物血清的HI抗體滴度，可以了解疫苗誘導機體產生抗體的能力以及抗體水平的動態變化。在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度開始升高，從免疫前的陰性水平逐漸上升至1:16-1:32；氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度也有所升高，但升高幅度相對較小，為1:8-1:16。隨著免疫時間的延長，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度進一步升高至1:64-1:128，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清HI抗體滴度升高至1:32-1:64。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清HI抗體滴度均達到峰值，白油佐劑滅活疫苗接種組為1:256-1:512，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組為1:128-1:256。對照組馬匹由于接種的是無菌生理鹽水，血清HI抗體滴度在整個實驗過程中始終維持在陰性水平。ELISA試驗則是利用抗原-抗體的特異性結合原理，通過酶標記物來檢測血清中的抗體水平。將病毒抗原包被在酶標板上，加入待檢血清，血清中的抗體與抗原結合后，再加入酶標記的二抗，形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。加入底物后，酶催化底物發生顯色反應，通過酶標儀測定吸光度值，根據吸光度值的大小來判斷血清中抗體的含量。ELISA試驗具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，能夠更準確地檢測血清中的抗體水平。在本研究中，ELISA試驗的結果與HI試驗基本一致。免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平開始升高，ELISA檢測的吸光度值（A值）從免疫前的0.1以下逐漸上升至0.3-0.5；氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平也有所升高，A值為0.2-0.3。在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平進一步升高，A值達到0.6-0.8，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的血清抗體水平A值升高至0.4-0.6。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清抗體水平均達到峰值，白油佐劑滅活疫苗接種組A值為0.9-1.2，氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組A值為0.7-0.9。對照組馬匹的血清抗體水平在整個實驗過程中始終維持在較低水平，A值在0.1以下。綜合HI試驗和ELISA試驗的結果可以看出，接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠誘導馬匹產生特異性抗體，且白油佐劑滅活疫苗誘導產生的抗體水平相對較高，抗體上升速度較快。這表明白油佐劑在增強疫苗免疫原性方面具有一定的優勢，能夠更有效地刺激機體產生免疫應答。5.2.2細胞免疫反應檢測細胞免疫在機體抵御病毒感染過程中發揮著關鍵作用，因此檢測免疫動物的細胞免疫指標對于全面評估疫苗的免疫效果至關重要。本研究主要檢測了免疫動物的T淋巴細胞亞群變化以及細胞因子的分泌情況，以深入了解疫苗對細胞免疫的影響。T淋巴細胞亞群在免疫應答中具有不同的功能，CD4?T細胞主要輔助免疫細胞的活化和增殖，促進體液免疫和細胞免疫反應；CD8?T細胞則具有細胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細胞。通過流式細胞術對免疫動物外周血中的T淋巴細胞亞群進行檢測，結果顯示，在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例開始升高。CD4?T細胞比例從免疫前的30%-35%升高至35%-40%，CD8?T細胞比例從免疫前的20%-25%升高至25%-30%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例也有所升高，但升高幅度相對較小。CD4?T細胞比例升高至32%-36%，CD8?T細胞比例升高至22%-26%。隨著免疫時間的延長，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例進一步升高。CD4?T細胞比例達到40%-45%，CD8?T細胞比例達到30%-35%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例也繼續升高，CD4?T細胞比例升高至36%-40%，CD8?T細胞比例升高至26%-30%。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例均達到較高水平。白油佐劑滅活疫苗接種組CD4?T細胞比例為45%-50%，CD8?T細胞比例為35%-40%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組CD4?T細胞比例為40%-45%，CD8?T細胞比例為30%-35%。對照組馬匹外周血中CD4?T細胞和CD8?T細胞的比例在整個實驗過程中變化不明顯。這表明接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠促進T淋巴細胞的活化和增殖，增強細胞免疫反應，且白油佐劑滅活疫苗對T淋巴細胞亞群的影響更為顯著。細胞因子是免疫系統中的重要調節分子，在抗病毒免疫中發揮著關鍵作用。本研究通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測了免疫動物血清中細胞因子的分泌情況，包括干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-10（IL-10）等。IFN-γ和IL-2是Th1型細胞因子，能夠促進細胞免疫反應，增強機體對病毒的抵抗力；IL-4和IL-10是Th2型細胞因子，主要參與體液免疫反應，調節免疫平衡。在免疫后的第2周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量開始升高。IFN-γ含量從免疫前的10-20pg/mL升高至30-50pg/mL，IL-2含量從免疫前的5-10pg/mL升高至15-25pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量也有所升高，但升高幅度相對較小。IFN-γ含量升高至20-30pg/mL，IL-2含量升高至10-15pg/mL。隨著免疫時間的延長，在免疫后的第4周，白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量進一步升高。IFN-γ含量達到50-80pg/mL，IL-2含量達到25-40pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量也繼續升高，IFN-γ含量升高至30-50pg/mL，IL-2含量升高至15-25pg/mL。二免后的第2周，兩組接種疫苗的馬匹血清中IFN-γ和IL-2的含量均達到較高水平。白油佐劑滅活疫苗接種組IFN-γ含量為80-120pg/mL，IL-2含量為40-60pg/mL。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組IFN-γ含量為50-80pg/mL，IL-2含量為25-40pg/mL。在IL-4和IL-10的分泌方面，兩組接種疫苗的馬匹在免疫后的變化相對較小，且與對照組相比差異不顯著。這表明接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠誘導機體產生Th1型細胞免疫反應，增強細胞免疫功能，白油佐劑滅活疫苗在促進Th1型細胞因子分泌方面表現更為突出。5.2.3攻毒保護試驗攻毒保護試驗是評價疫苗保護效果的直接且關鍵的方法，通過對免疫動物進行病毒攻毒，觀察其發病情況、臨床癥狀和病理變化，能夠直觀地評估疫苗對機體的保護能力。在本研究中，于二免后的第4周，對所有馬匹進行H3N8亞型馬流感病毒強毒株的攻毒實驗，攻毒劑量為10?.2-10?.?EID??，采用噴霧感染的方式使馬匹感染病毒。攻毒后，密切觀察馬匹的臨床表現，包括體溫變化、咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀的出現情況和嚴重程度，持續觀察14-21天。對照組馬匹在攻毒后1-2天內迅速出現明顯的臨床癥狀。體溫在攻毒后第1天便從正常的37.5-38.5℃快速升高至40-41℃，且高熱狀態持續了3-5天。咳嗽癥狀在攻毒后第2天開始出現，最初為偶爾的輕咳，隨后咳嗽頻率逐漸增加，發展為頻繁的劇烈干咳，持續時間長達1-2周。鼻腔分泌物也明顯增多，初期為漿液性鼻液，隨著病情發展，逐漸變為黏液性鼻液。部分馬匹還出現了呼吸急促的癥狀，呼吸頻率從正常的每分鐘12-20次增加至每分鐘30-40次。馬匹精神沉郁，食欲不振，對周圍環境的反應變得遲鈍。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹在攻毒后，癥狀相對較輕。體溫升高幅度較小，最高體溫一般在38.5-39.5℃之間，且高熱持續時間較短，一般為1-2天。咳嗽癥狀也相對較輕，表現為偶爾的輕咳，持續時間較短，約為3-5天。鼻腔分泌物增多不明顯，僅出現少量漿液性鼻液。部分馬匹未出現呼吸急促的癥狀，即使出現，呼吸頻率增加幅度也較小，一般為每分鐘20-25次。馬匹精神狀態和食欲受影響較小，能夠保持相對正常的活動和采食。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹在攻毒后的癥狀介于對照組和白油佐劑滅活疫苗接種組之間。體溫升高至39-40℃，持續2-3天。咳嗽癥狀較為明顯，表現為輕咳至中度咳嗽，持續時間約為5-7天。鼻腔分泌物增多，為漿液性鼻液。部分馬匹出現呼吸急促癥狀，呼吸頻率增加至每分鐘25-30次。馬匹精神狀態和食欲有一定程度的下降，但恢復相對較快。從發病情況來看，對照組馬匹的發病率達到100%，且部分馬匹病情較為嚴重。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹發病率為20%，僅有1匹馬出現輕微癥狀。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹發病率為40%，有2匹馬出現不同程度的癥狀。在整個觀察期內，對照組、白油佐劑滅活疫苗接種組和氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹均未出現死亡情況。對攻毒后死亡或安樂死的馬匹進行解剖，觀察其病理變化。對照組馬匹的呼吸道和肺臟等組織器官出現明顯的病理變化。鼻腔、咽喉部和氣管黏膜充血、水腫，黏膜表面附著大量黏液。氣管和支氣管的黏膜上皮細胞壞死、脫落，管腔內可見大量炎性滲出物，包括中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等。肺組織呈現不同程度的實變，顏色暗紅，切面可見大量泡沫狀液體流出，肺泡腔內充滿漿液、纖維素和炎性細胞，導致肺泡腔狹窄甚至閉塞。部分肺泡上皮細胞變性、壞死，肺泡間隔增寬，其中有大量淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤。接種白油佐劑滅活疫苗的馬匹病理變化較輕，僅在少數馬匹的呼吸道和肺臟組織中觀察到輕微的充血和炎性細胞浸潤。接種氫氧化鋁佐劑滅活疫苗的馬匹病理變化介于對照組和白油佐劑滅活疫苗接種組之間，呼吸道和肺臟組織可見一定程度的充血、水腫和炎性細胞浸潤，但病變程度相對較輕。綜合攻毒保護試驗的結果，接種H3N8亞型馬流感病毒滅活疫苗能夠有效保護馬匹免受H3N8亞型馬流感病毒強毒株的攻擊，降低發病率和發病程度，減輕病理損傷。其中，白油佐劑滅活疫苗的保護效果更為顯著，能夠更好地預防馬流感的發生，為馬匹提供更有效的免疫保護。5.3安全性評價在完成免疫程序后，對疫苗接種組和對照組馬匹的安全性進行了全面細致的觀察與評估，涵蓋局部反應和全身反應等多個方面。對于局部反應，重點觀察了疫苗接種部位的變化情況。在接種疫苗后的24-48小時內，白油佐劑滅活疫苗接種組的部分馬匹在注射部位出現了輕微的紅腫現象，紅腫范圍直徑約為2-3厘米。隨著時間的推移，紅腫逐漸減輕，在接種后的第3-5天，紅腫范圍縮小至1-2厘米，且質地變軟。到第7天，大部分馬匹接種部位的紅腫基本消退，僅少數馬匹仍有輕微的痕跡。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹的接種部位也出現了一定程度的紅腫，但程度相對較輕，紅腫范圍直徑一般在1-2厘米。紅腫消退速度較快，在接種后的第3天，大部分馬匹的紅腫范圍已縮小至1厘米以下，第5天基本恢復正常。兩組接種疫苗的馬匹在接種部位均未出現疼痛、硬結、潰瘍等嚴重不良反應。對照組馬匹接種無菌生理鹽水后，注射部位無明顯異常變化，皮膚顏色、質地均正常，未出現紅腫、疼痛等任何不良反應。在全身反應方面，密切監測了馬匹的體溫、精神狀態、食欲等指標。接種疫苗后，白油佐劑滅活疫苗接種組和氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組的部分馬匹在24小時內出現了短暫的體溫升高現象。白油佐劑滅活疫苗接種組馬匹體溫最高升高至38.5-39℃，持續時間約為12-24小時，隨后體溫逐漸恢復正常。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組馬匹體溫升高幅度相對較小，最高體溫一般在38.3-38.8℃之間，持續時間約為6-12小時。除體溫升高外，部分馬匹還出現了精神沉郁和食欲不振的癥狀。白油佐劑滅活疫苗接種組約有30%的馬匹出現精神沉郁，表現為活動減少、對周圍環境反應遲鈍；約20%的馬匹出現食欲不振，采食量減少約30%-50%。氫氧化鋁佐劑滅活疫苗接種組出現精神沉郁和食欲不振的馬匹比例相對較低，分別約為20%和10%，且癥狀程度較輕，采食量減少約20%-30%。這些癥狀在1-2天內逐漸緩解，馬匹的精神狀態和食欲逐漸恢復正常。對照組馬匹在接種無菌生理鹽水后，體溫始終保持在正常范圍內（37.5-38.5