二輪專題復(fù)習(xí)——PCR專題高三生物二輪專題分子水平——水分、無(wú)機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、激素等細(xì)胞水平——細(xì)胞呼吸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化個(gè)體水平——植物激素調(diào)節(jié)：赤霉素，脫落酸，生長(zhǎng)素生態(tài)水平——種群繁衍、群落演替、信息傳遞生物工程——人工種子的制備和應(yīng)用目錄1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸2.重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用（難點(diǎn)、常考）3.大引物PCR實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變4.反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列5.特異性更強(qiáng)的巢式PCR1．實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合)。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。TaqMan探針為一寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。1．實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸在PCR過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針被耐高溫的DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到。1．實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)某冠狀病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖乙，熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)越

，說(shuō)明病毒核酸濃度越高。思考：平臺(tái)期出現(xiàn)的原因？可能是試劑盒中的原料、引物、探針被消耗完了小例1.熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中某種DNA的含量，其原理是在PCR體系中每加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針，當(dāng)耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．引物與探針均具有特異性，與模板結(jié)合時(shí)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則B．反應(yīng)最終的熒光強(qiáng)度與起始狀態(tài)模板DNA含量呈負(fù)相關(guān)C．耐高溫的DNA聚合酶催化DNA合成的方向總是從子鏈的5′端到3′端D．若用上述技術(shù)檢測(cè)某基因的轉(zhuǎn)錄水平，則需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶B例2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR可用于對(duì)樣品中特定DNA序列進(jìn)行定量分析。將熒光標(biāo)記的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合,當(dāng)探針完整時(shí),不產(chǎn)生熒光。在PCR過(guò)程中,與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解,R與Q分離后,在特定光的激發(fā)下R發(fā)出熒光,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,熒光信號(hào)強(qiáng)度增加,通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度,可得Ct值(達(dá)到熒光閾值所歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述正確的是()A.熒光基因R連接在探針的3’端B.該反應(yīng)體系中并未加入ATP,所以新鏈的合成不需要消耗能量C.TaqDNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是合成磷酸二酯鍵D.Ct值越小,說(shuō)明樣品中特定DNA序列的含量越多D例3.臨床上常采用RT-PCR技術(shù)(以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增)對(duì)受試者的咽拭子取樣后進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)。以下是某醫(yī)院發(fā)熱門診醫(yī)生采用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)受試者進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)的相關(guān)操作步驟：①?gòu)氖茉囌呓M織樣本中提取mRNA；②分析PCR擴(kuò)增結(jié)果；③利用PCR擴(kuò)增cDNA片段；④采集受試者組織樣本；⑤用mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(

)A．RT-PCR技術(shù)的正確操作順序應(yīng)是④①⑤③②B．RT-PCR操作過(guò)程中，所需的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶C．RT-PCR的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)BamHⅠ、EcoRⅠ雙限制酶處理以后，再與經(jīng)過(guò)同樣雙酶處理的小雙節(jié)病毒(PBV)載體連接，該操作屬于基因工程操作步驟中的構(gòu)建基因表達(dá)載體D．利用RT-PCR技術(shù)獲取的目的基因不能在物種間進(jìn)行交流D順便回顧：探針用特殊示蹤劑（如同位素或有色基團(tuán)）進(jìn)行標(biāo)記以目的基因?yàn)槟０搴铣梢话銥殚L(zhǎng)度在幾十到幾百甚至上千堿基對(duì)的單鏈核酸特殊示蹤劑（如同位素或有色基團(tuán)）進(jìn)行標(biāo)記。將未配對(duì)結(jié)合的探針洗去后，可用放射自顯影或其他顯色反應(yīng)等檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果。2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用基礎(chǔ)知識(shí)儲(chǔ)備1.PCR引物的

無(wú)嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列，dNTP(四種脫氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。2.畫出上圖第一輪擴(kuò)增、第二輪擴(kuò)增的結(jié)果、第n輪擴(kuò)增的結(jié)果5′端基礎(chǔ)知識(shí)儲(chǔ)備直接畫出擴(kuò)增n輪的結(jié)果2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用1：定點(diǎn)突變2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用1：定點(diǎn)突變2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用1：定點(diǎn)突變2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用1：定點(diǎn)突變2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用D應(yīng)用2：連接基因2．重疊延伸PCR技術(shù)及其應(yīng)用成都二診C練習(xí)：(2024·江蘇百校聯(lián)考）重疊延伸PCR是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過(guò)多次PCR擴(kuò)增，獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長(zhǎng)片段的DNA、不同來(lái)源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過(guò)程。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制后，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子D．在引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過(guò)2次復(fù)制C3．大引物PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。√例1.大引物PCR定點(diǎn)突變常用來(lái)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，如圖表示利用大引物PCR對(duì)基因M進(jìn)行定點(diǎn)誘變。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是(

)A．第一輪PCR中，至少需要2個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物B．第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈C．?dāng)U增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯D．為了使兩輪PCR在同一支試管中進(jìn)行，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮不同的復(fù)性溫度4．反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。原理是用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)相反方向的特異性引物，該引物對(duì)已知序列反向，但對(duì)未知序列卻是相向的，從而得以擴(kuò)增出未知序列。4．反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列C5．特異性更強(qiáng)的巢式PCR首先將目標(biāo)的DNA模板與第一套引物(外引物)結(jié)合。第一套引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片段(圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物)。然后使用第二套引物(內(nèi)引物)對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片段包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片段。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒(méi)有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。√例．為減少引物與模板之間的非特異性配對(duì)，人們對(duì)普通PCR進(jìn)行了改良，發(fā)明了巢式PCR，其原理是利用兩套引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。首先利用第一對(duì)引物(外引物)對(duì)目的基因所在的DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增(經(jīng)過(guò)15～30次循環(huán))，第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用第二對(duì)引物(內(nèi)引物或巢式引物)結(jié)合在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，經(jīng)過(guò)15～30次循環(huán)，獲得第二輪擴(kuò)增片段(即目的基因)，最終第二輪擴(kuò)增片段短于第一輪，基本過(guò)程如下圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段B．使用外引物至少經(jīng)過(guò)3次循環(huán)，才能得到圖示的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物C．若第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生錯(cuò)誤片段，則其進(jìn)入第二輪擴(kuò)增的概率極低D．與巢式PCR相比，普通PCR特異性更強(qiáng)，錯(cuò)誤率更高練習(xí)．在利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通常在引物一端添加限制酶識(shí)別序列，以便將目的基因連接到載體上。如圖所示，TA克隆法可以將PCR產(chǎn)物直接連接到具有3′—T突出末端的載體上，這是因?yàn)槠胀═aqDNA聚合酶具有末端連接酶的活性，可在每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端自動(dòng)添加一個(gè)堿基，通常為A，這樣擴(kuò)增產(chǎn)物就可以與有3′—T突出末端的載體連接。高保真TaqDNA聚合酶可切掉PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)配堿基，保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。(1)PCR依據(jù)的原理是________________，該技術(shù)通常需要2種引物，引物的具體作用是_________________________________________________。DNA半保留復(fù)制使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸(2)一般情況下，利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通常在引物的________端添加特定限制酶識(shí)別序列。基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有________、________________________等。題述構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法________(填“需要”或“不需要”)限制酶，________(填“需要”或“不需要”)DNA連接酶，原因是__________________________________________________________________________________________________。5′

噬菌體動(dòng)植物病毒(順序可顛倒)

不需要需要PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端有一個(gè)堿基A，T載體有3′—T突出末端，二者可以在DNA連接酶的作用下直接連接(3)高保真TaqDNA