COX-2與E-cadherin：原發性肝細胞癌診療新視角的探索一、引言1.1研究背景與意義原發性肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為一種常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。相關資料顯示，它占原發性肝癌的90%以上，發病率在全球范圍內呈現出逐年上升的趨勢，成為了導致癌癥相關死亡的主要原因之一。HCC具有發病隱匿的特點，早期通常無明顯的臨床癥狀，多數患者在確診時已處于晚期，這使得治療難度大大增加，死亡率居高不下。據統計，未經治療的原發性肝細胞癌患者病情進展迅速，預后極不理想，而晚期患者即使接受各種姑息治療，5年生存率也僅為10%-20%。肝癌的發生發展是一個多階段、多步驟、多因子參與的極其復雜的過程。目前，雖然針對原發性肝細胞癌的治療手段不斷發展，包括手術切除、肝移植、介入治療、化療、靶向治療等，但總體療效仍不盡人意，患者的生存率和生活質量有待進一步提高。因此，深入探究原發性肝細胞癌的發病機制，尋找有效的診斷標志物和治療靶點，對于改善患者的預后具有重要的臨床意義。在腫瘤研究領域，環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和上皮型鈣黏蛋白（epithelialcadherin，E-cadherin）逐漸成為研究的熱點。COX-2是一種誘導型酶，在正常生理狀態下，多數組織內檢測不到其表達。然而，當細胞受到相應細胞因子、內毒素、促腫瘤劑以及癌基因等刺激后，COX-2可被誘導性表達。已有大量文獻報道，COX-2在多種惡性腫瘤中，如肝癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌等，均呈現高表達狀態，并通過多種復雜的機理參與腫瘤的發生、發展和轉移過程，同時還參與多種病理生理過程，包括急慢性炎癥、疼痛等。在腫瘤發生過程中，COX-2可能通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、調節免疫反應以及促進腫瘤血管生成等途徑，為腫瘤細胞的生長和擴散提供有利條件。E-cadherin是一類依賴Ca2?的細胞間跨膜黏連糖蛋白分子，它與胞漿中的β-環連蛋白結合形成復合體，在維持細胞間黏附的穩定性和細胞的極性方面發揮著關鍵作用，主要參與細胞間的連接，能夠有效防止細胞的脫落。以往的研究表明，在惡性腫瘤中，E-cadherin的表達往往會下降，這導致腫瘤細胞間的黏附作用減弱，使得腫瘤細胞更容易從原發灶脫落，進而引發腫瘤的浸潤和轉移。在腫瘤轉移過程中，E-cadherin表達的降低使得腫瘤細胞能夠突破細胞間的黏附限制，侵入周圍組織和血管，從而實現遠處轉移。目前，COX-2和E-cadherin的異常表達與原發性肝細胞癌的發生和發展密切相關，但有關二者在肝癌中的表達水平及相互關系的報道相對較少。通過分析COX-2和E-cadherin在原發性肝細胞癌中的表達情況，以及它們與臨床病理特征之間的關系，有助于深入探究原發性肝細胞癌的發病機制，為早期診斷提供新的思路和方法。通過研究二者的表達情況，能夠更準確地判斷患者的病情發展階段和預后情況，為制定個性化的治療方案提供科學依據，從而提高治療效果，改善患者的生存質量和預后。1.2國內外研究現狀在國外，對于COX-2在原發性肝細胞癌中的研究開展較早。有研究表明，COX-2通過催化花生四烯酸轉化為前列腺素E2（PGE2），改變細胞內信號傳導通路，從而促進腫瘤細胞的增殖。在肝癌細胞系中，抑制COX-2的活性能夠顯著降低細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡。COX-2還能通過上調血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子，促進腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和轉移提供營養支持。在動物實驗中，給予COX-2抑制劑能夠減少腫瘤的血管密度，抑制腫瘤的生長和轉移。在免疫逃逸方面，COX-2的高表達可以調節腫瘤微環境中的免疫細胞功能，抑制機體的抗腫瘤免疫反應。研究發現，COX-2高表達的腫瘤組織中，T淋巴細胞的浸潤減少，免疫抑制因子的表達增加。關于E-cadherin，國外研究揭示了其在腫瘤轉移過程中的關鍵作用機制。E-cadherin表達缺失會導致腫瘤細胞間的黏附力下降，使得腫瘤細胞更容易脫離原發灶，通過上皮-間質轉化（EMT）過程獲得遷移和侵襲能力。在乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中，E-cadherin的低表達與腫瘤的高侵襲性和不良預后密切相關。研究表明，E-cadherin的表達受到多種轉錄因子的調控，如Snail、ZEB1等，這些轉錄因子可以結合到E-cadherin基因的啟動子區域，抑制其轉錄。在肝癌研究中，也發現E-cadherin的表達下調與腫瘤的分化程度、臨床分期等相關。國內學者在COX-2和E-cadherin與原發性肝細胞癌的關系研究上也取得了豐碩成果。通過免疫組化等技術檢測發現，COX-2在原發性肝細胞癌組織中的陽性表達率顯著高于正常肝組織，且其表達水平與腫瘤的大小、臨床分期、轉移等密切相關。有研究對不同臨床分期的原發性肝細胞癌患者進行COX-2表達檢測，發現隨著臨床分期的升高，COX-2的陽性表達率逐漸增加。對于E-cadherin，國內研究表明其在原發性肝細胞癌組織中的表達明顯低于癌旁組織和正常肝組織，且E-cadherin表達越低，腫瘤的分化程度越差，發生轉移的可能性越大。研究還發現，E-cadherin的表達與患者的生存期呈正相關，即E-cadherin表達較高的患者生存期相對較長。盡管國內外在COX-2和E-cadherin與原發性肝細胞癌的研究方面取得了一定進展，但仍存在一些不足。目前對于COX-2和E-cadherin在原發性肝細胞癌中的具體作用機制尚未完全明確，尤其是二者之間的相互調控關系以及它們與其他信號通路的交互作用有待進一步深入研究。現有研究大多集中在蛋白和mRNA表達水平，對于其在基因層面的調控機制研究較少。在臨床應用方面，雖然COX-2抑制劑在一些腫瘤治療中顯示出一定的潛力，但在原發性肝細胞癌的治療中，如何精準地應用COX-2抑制劑，以及如何聯合其他治療手段提高治療效果，還需要更多的臨床研究來驗證。對于E-cadherin作為潛在的治療靶點，目前還缺乏有效的干預措施。1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究COX-2及E-cadherin在原發性肝細胞癌中的表達情況，并分析它們與原發性肝細胞癌臨床病理特征之間的關系，進而探討二者在原發性肝細胞癌發生、發展過程中的作用機制，為原發性肝細胞癌的早期診斷、病情評估以及治療提供新的理論依據和潛在靶點。具體而言，本研究將從以下幾個方面展開：其一，運用免疫組化、實時熒光定量PCR等技術，精準檢測COX-2及E-cadherin在原發性肝細胞癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中的蛋白和mRNA表達水平，明確它們在不同組織中的表達差異。其二，通過統計學分析方法，細致分析COX-2及E-cadherin的表達與原發性肝細胞癌患者的腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、有無轉移等臨床病理參數之間的相關性，評估其對患者預后的影響。其三，深入探討COX-2及E-cadherin在原發性肝細胞癌發生、發展過程中的相互作用機制，以及它們與其他相關信號通路的關聯，為揭示原發性肝細胞癌的發病機制提供新的視角。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：一是聯合分析COX-2和E-cadherin在原發性肝細胞癌中的表達及相互關系，此前針對二者在肝癌中的聯合研究相對較少，這種聯合分析有望為肝癌發病機制的研究提供更為全面和深入的認識，發現新的潛在調控網絡。二是從基因和蛋白水平全面研究COX-2和E-cadherin，不僅關注其蛋白表達情況，還深入探究其在基因層面的表達變化，有助于更深入地理解它們在肝癌發生發展過程中的調控機制。三是本研究可能為原發性肝細胞癌的治療提供新的潛在靶點和治療思路。通過揭示COX-2和E-cadherin的作用機制，有望為開發針對這兩個分子的靶向治療藥物或聯合治療方案提供理論基礎，從而為改善原發性肝細胞癌患者的治療效果和預后開辟新的途徑。二、COX-2與E-cadherin的生物學特性2.1COX-2的結構、功能與調控機制COX又稱前列腺素內氧化酶還原酶，是一種具有環氧化酶和過氧化氫酶雙功能的膜結合蛋白，在花生四烯酸轉化為前列腺素的過程中發揮著關鍵的催化作用。目前，已發現COX存在兩種同工酶，分別為COX-1和COX-2。COX-1屬于結構型酶，在人體的大多數組織中廣泛表達，如血管、胃、腎等組織，對維持機體的正常生理功能起著不可或缺的作用，具體參與血管舒縮、血小板聚集、胃黏膜血流調節、胃黏液分泌以及腎功能調節等過程。而COX-2則為誘導型酶，在正常生理狀態下，多數組織內難以檢測到其表達。但當細胞受到細胞因子（如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等）、內毒素、生長因子（如表皮生長因子、血小板衍生生長因子等）、幽門螺旋桿菌、促腫瘤劑以及癌基因等多種刺激時，COX-2可被誘導表達。COX-2基因定位于人類7號染色體上，長度約為8.3KB，由10個外顯子和9個內含子構成。在其5'端存在兩個核因子-κB（NF-κB）的結合位點，此外還包含NF-IL6、AP-1、SP1、CRE等多種轉錄因子的結合位點。這些轉錄因子在COX-2的表達調控中發揮著關鍵作用。當細胞受到刺激時，相關信號通路被激活，促使轉錄因子與COX-2基因啟動子區域的相應結合位點相互作用，從而啟動COX-2基因的轉錄過程。NF-κB在炎癥和腫瘤等病理過程中發揮著重要作用，它可以被多種刺激激活，激活后的NF-κB能夠進入細胞核，與COX-2基因啟動子區域的NF-κB結合位點結合，促進COX-2的轉錄。一些細胞因子如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，可以通過激活NF-κB信號通路，誘導COX-2的表達。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，它可以與細胞表面的受體結合，激活細胞內的信號通路，導致NF-κB的活化，進而誘導COX-2的表達。生長因子如表皮生長因子（EGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，也可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，調節COX-2的表達。此外，糖皮質激素等物質則可抑制COX-2的表達，其作用機制可能是通過與相應的受體結合，抑制轉錄因子的活性，從而抑制COX-2基因的轉錄。在生理狀態下，COX-2參與多種生理過程的調節。在神經系統中，COX-2在疼痛和炎癥反應的調節中發揮著重要作用。當機體受到傷害性刺激時，神經元會釋放一些神經遞質和細胞因子，這些物質可以誘導COX-2的表達，COX-2催化花生四烯酸生成前列腺素，前列腺素可以作用于痛覺感受器，降低其閾值，從而使機體對疼痛更加敏感。在腎臟中，COX-2參與維持腎血流量和腎小球濾過率的穩定，對腎功能的正常發揮具有重要意義。在胚胎發育過程中，COX-2也參與了一些重要的生理過程，如血管生成、細胞增殖和分化等。在病理狀態下，COX-2的異常表達與多種疾病的發生發展密切相關。在炎癥反應中，COX-2被誘導表達，催化花生四烯酸生成前列腺素E2（PGE2）等前列腺素類物質，這些物質可以引起血管擴張、通透性增加、白細胞浸潤等炎癥反應。在類風濕性關節炎、骨關節炎等炎癥性疾病中，COX-2的表達明顯升高，導致炎癥部位的疼痛、腫脹和功能障礙等癥狀加重。COX-2與腫瘤的發生發展也有著緊密的聯系。在多種惡性腫瘤組織中，如肝癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌等，COX-2呈現高表達狀態。COX-2通過多種機制參與腫瘤的發生、發展和轉移過程。COX-2催化生成的PGE2可以通過激活細胞表面的前列腺素受體，調節細胞內的信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。PGE2可以激活蛋白激酶A（PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促進細胞周期蛋白的表達，從而推動細胞周期的進展，促進腫瘤細胞的增殖。COX-2還可以通過抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞的存活。PGE2可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。COX-2參與腫瘤血管生成的調節，PGE2可以促進血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，刺激腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉移提供營養支持。COX-2還可以通過調節免疫反應，抑制機體的抗腫瘤免疫功能，有利于腫瘤細胞的免疫逃逸。2.2E-cadherin的結構、功能與調控機制E-cadherin是一種依賴Ca2?的細胞間跨膜黏連糖蛋白分子，由CDH1基因編碼，該基因定位于16號染色體長臂上（16q22.1）。E-cadherin蛋白結構主要包含5個細胞外結構域、1個跨膜結構域以及1個胞質內結構域。每個細胞外結構域的N末端都存在calcium的結合位點，這些位點對于維持E-cadherin的結構穩定性以及正常功能發揮著重要作用。鈣結合位點與鈣離子結合后，能夠使E-cadherin分子形成特定的構象，促進細胞間的黏附作用。在細胞內，E-cadherin胞質內結構域的C末端通過不同的連環蛋白（α、β、γ、p120）與肌動蛋白細胞骨架相連，從而形成復雜的連環蛋白-鈣黏蛋白復合物。這種復合物對于維持細胞間黏附的穩定性以及細胞的極性至關重要。當E-cadherin與相鄰細胞表面的E-cadherin分子相互作用時，通過鈣黏蛋白-連環蛋白復合物與肌動蛋白細胞骨架的連接，能夠將細胞緊密地黏附在一起，保持組織結構的完整性。E-cadherin在細胞的正常生理過程中發揮著關鍵作用，特別是在維持細胞間黏附和細胞極性方面。在胚胎發育過程中，E-cadherin參與了細胞的分化、遷移和組織器官的形成。在胚胎早期，不同類型的細胞通過E-cadherin的特異性表達，實現細胞間的識別和黏附，從而形成特定的組織結構。在神經嵴細胞的遷移過程中，E-cadherin的表達水平和分布會發生動態變化，調控神經嵴細胞的遷移路徑和方向，確保神經系統的正常發育。在成體組織中，E-cadherin對于維持上皮組織的完整性和功能起著不可或缺的作用。在上皮組織中，E-cadherin沿著細胞的側面分布，形成緊密的細胞連接，防止細胞的脫落和組織的損傷。皮膚上皮細胞之間通過E-cadherin的黏附作用，形成緊密的屏障，保護機體免受外界病原體的入侵。E-cadherin還參與了細胞信號傳導過程，與多種信號通路存在相互作用，間接發揮腫瘤抑制因子的作用。E-cadherin可以與Wnt信號通路中的關鍵分子β-連環蛋白相互作用，當E-cadherin正常表達時，β-連環蛋白主要與E-cadherin結合，位于細胞膜上，維持細胞間的黏附。當E-cadherin表達缺失或功能異常時，β-連環蛋白會進入細胞核，激活相關基因的轉錄，促進細胞的增殖和遷移，從而導致腫瘤的發生和發展。在腫瘤發生發展過程中，E-cadherin的表達調控機制較為復雜，涉及多個層面?；蛩缴?，CDH1基因突變是導致E-cadherin表達異常的重要原因之一。這種突變主要為體細胞性突變，在相當數量的浸潤性小葉癌中，E-cadherin缺失可由CDH1基因突變來解釋。大部分情況下，E-cadherin突變常伴有E-cadherin染色體位點的雜合性缺失（LOH），這進一步凸顯了E-cadherin作為腫瘤抑制基因的重要意義。部分浸潤性小葉癌和遺傳性胃癌病例中，還可見CDH1基因的種系突變。雖然CDH1突變更多與乳腺小葉癌相關，但非小葉的腫瘤也可能出現CDH1基因的功能缺失型突變，這表明CDH1突變可能促進了小葉癌之外的其他類型腫瘤的發生。啟動子區域的異常甲基化也會影響E-cadherin的表達。某些組織中，CDH1啟動子超甲基化可能導致E-cadherin表達缺失。在浸潤性小葉癌中，關于CDH1啟動子超甲基化所占比例的報道存在較大差異，部分研究認為可能存在相關研究質控欠佳、甲基化特異性PCR檢測方法敏感性高等問題，導致數據不一，這方面的問題尚需進一步深入研究。浸潤性導管癌中也有E-cadherin表達降低或陰性病例出現CDH1啟動子超甲基化的報道，但其可靠性和意義仍有待明確。在轉錄水平，上皮間質轉化（EMT）過程對E-cadherin的表達有著重要影響。EMT是一種動態細胞過程，在這一過程中，上皮細胞的特征逐漸減少，向間質細胞過渡，從而獲得遷移和侵襲能力。EMT涉及一個復雜的轉錄因子網絡，這些轉錄因子能夠影響促進上皮間質轉化、抑制上皮特征的相關基因表達。在乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中，Snail、ZEB1等轉錄因子可以結合到E-cadherin基因的啟動子區域，抑制其轉錄，導致E-cadherin表達下調。在乳腺癌細胞中，當受到轉化生長因子-β（TGF-β）等信號刺激時，會激活Snail等轉錄因子，Snail與E-cadherin基因啟動子區域的特定序列結合，阻礙RNA聚合酶的結合，從而抑制E-cadherin的轉錄，使細胞發生EMT，促進腫瘤的侵襲和轉移。在翻譯后修飾水平，糖基化對E-cadherin的折疊、轉運以及在細胞膜上的穩定性具有重要意義。E-cadherin在胞質內糖基化修飾受損，會阻礙其向細胞表面的胞吐作用，影響細胞黏附，并促進細胞的遷徙和轉移。而E-cadherin在胞質外糖基化修飾受損，則會導致該蛋白不穩定。研究還發現糖基化與上皮間質轉化之間存在相關性，糖基化異?？赡苁侨橄侔┑饶[瘤中E-cadherin表達下調的機制之一，但具體細節尚需進一步研究闡明。多種酶可裂解E-cadherin蛋白，這些酶尤其可與E-cadherin細胞外結構域（N末端）相互作用，參與相關調節網絡來管控其蛋白水解過程。酶促過程可能改變E-cadherin的表達模式，導致其在臨床實踐中出現異常表達或表達缺失?；|金屬蛋白酶（MMPs）可以裂解E-cadherin的細胞外結構域，使E-cadherin從細胞膜上脫落，降低細胞間的黏附力，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。2.3二者在腫瘤發生發展中的一般作用機制COX-2在腫瘤發生發展過程中發揮著多方面的促癌作用，其作用機制涉及多個復雜的生物學過程。炎癥反應與腫瘤的發生發展密切相關，COX-2在其中扮演著關鍵角色。當機體受到炎癥刺激時，COX-2被誘導表達，催化花生四烯酸生成前列腺素E2（PGE2）等前列腺素類物質。PGE2作為一種重要的炎癥介質，可引發一系列炎癥反應，如血管擴張、通透性增加、白細胞浸潤等。持續的炎癥微環境會導致細胞損傷和基因突變的積累，為腫瘤的發生創造條件。在慢性炎癥相關的腫瘤中，如炎癥性腸病相關的結直腸癌，長期的炎癥刺激使COX-2持續高表達，促進了腫瘤的發生。炎癥細胞釋放的細胞因子和活性氧等物質，也會進一步誘導COX-2的表達，形成惡性循環，加速腫瘤的發展。COX-2對細胞增殖和凋亡的調節是其促癌作用的重要機制之一。PGE2通過激活細胞表面的前列腺素受體，調節細胞內的信號通路，促進腫瘤細胞的增殖。PGE2可以激活蛋白激酶A（PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促使細胞周期蛋白的表達增加，推動細胞周期的進展，從而促進腫瘤細胞的增殖。在肝癌細胞系中，抑制COX-2的活性能夠顯著降低細胞的增殖能力，這表明COX-2在肝癌細胞增殖過程中起著重要作用。COX-2還可以通過抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞的存活。PGE2能夠上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促凋亡蛋白Bax的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。這種對細胞凋亡的抑制作用使得腫瘤細胞能夠逃避機體的正常清除機制，有利于腫瘤的生長和發展。腫瘤的生長和轉移依賴于充足的血液供應，COX-2在腫瘤血管生成中發揮著重要的調節作用。PGE2可以促進血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，刺激腫瘤血管的生成。VEGF能夠誘導血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤提供營養和氧氣，促進腫瘤的生長和轉移。在乳腺癌中，COX-2的高表達與VEGF的表達呈正相關，抑制COX-2的表達可以降低VEGF的水平，減少腫瘤血管的生成，從而抑制腫瘤的生長和轉移。COX-2還可以通過調節其他血管生成相關因子，如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等，間接影響腫瘤血管生成。免疫系統是機體抵御腫瘤的重要防線，COX-2可以通過調節免疫反應，抑制機體的抗腫瘤免疫功能，有利于腫瘤細胞的免疫逃逸。PGE2可以抑制T淋巴細胞的增殖和活性，減少細胞毒性T淋巴細胞的產生，降低機體的抗腫瘤免疫反應。PGE2還可以促進調節性T細胞（Treg）的分化和擴增，Treg細胞能夠抑制免疫細胞的功能，為腫瘤細胞的免疫逃逸提供有利條件。在肺癌中，COX-2高表達的腫瘤組織中，T淋巴細胞的浸潤減少，免疫抑制因子的表達增加，導致機體的抗腫瘤免疫功能受到抑制。E-cadherin作為一種重要的細胞間黏附分子，在腫瘤發生發展過程中發揮著抑制腫瘤的關鍵作用，其作用機制主要與維持細胞間黏附、抑制上皮-間質轉化（EMT）以及參與細胞信號傳導等方面有關。E-cadherin通過與相鄰細胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成緊密的細胞連接，維持細胞間的黏附穩定性。在正常組織中，E-cadherin的表達使得細胞緊密黏附在一起，保持組織結構的完整性。在腫瘤發生過程中，E-cadherin表達的下降或缺失會導致細胞間黏附力減弱，腫瘤細胞更容易從原發灶脫落，進而發生浸潤和轉移。在乳腺癌中，E-cadherin表達缺失的腫瘤細胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，實現遠處轉移。EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程，E-cadherin在抑制EMT過程中發揮著關鍵作用。在EMT過程中，上皮細胞的特征逐漸減少，向間質細胞過渡，細胞間的黏附力下降，同時獲得遷移和侵襲能力。E-cadherin的表達下調是EMT發生的重要標志之一。當E-cadherin表達降低時，會激活一系列與EMT相關的信號通路，如Snail、ZEB1等轉錄因子的表達上調，這些轉錄因子可以結合到E-cadherin基因的啟動子區域，抑制其轉錄，進一步促進EMT的發生。在結直腸癌中，E-cadherin表達的降低與EMT相關標志物的表達增加密切相關，促進了腫瘤細胞的侵襲和轉移。而維持E-cadherin的正常表達可以抑制EMT的發生，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移。E-cadherin不僅參與細胞間的黏附，還與多種細胞信號通路存在相互作用，間接發揮腫瘤抑制因子的作用。E-cadherin可以與Wnt信號通路中的關鍵分子β-連環蛋白相互作用。在正常情況下，β-連環蛋白主要與E-cadherin結合，位于細胞膜上，維持細胞間的黏附。當E-cadherin表達缺失或功能異常時，β-連環蛋白會進入細胞核，激活相關基因的轉錄，促進細胞的增殖和遷移，從而導致腫瘤的發生和發展。在肝癌中，E-cadherin表達的降低會導致β-連環蛋白的核轉位增加，激活下游與腫瘤增殖和轉移相關的基因，促進肝癌的發展。E-cadherin還可以與其他信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等相互作用，調節細胞的增殖、凋亡和遷移等過程，發揮其腫瘤抑制作用。三、原發性肝細胞癌概述3.1流行病學特征原發性肝細胞癌（HCC）是全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其流行病學特征呈現出顯著的地域差異。從全球視角來看，HCC的發病率在不同地區分布極不均衡。在亞洲和非洲的部分地區，HCC的發病率居高不下，其中東亞地區尤為突出，如中國、日本和韓國等國家，這些地區的HCC病例數占全球總數的大部分。據統計，全球每年新增HCC病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例。在非洲，撒哈拉以南地區的HCC發病率也相對較高。而在歐美等發達國家，HCC的發病率相對較低，但近年來也呈現出逐漸上升的趨勢。美國的HCC發病率在過去幾十年中穩步增長，這可能與丙型肝炎病毒（HCV）感染的流行、肥胖和糖尿病等因素有關。在中國，HCC的發病形勢更為嚴峻。中國是世界上HCC發病和死亡人數最多的國家之一，每年新發病例約占全球的42.5%。中國國家癌癥中心的數據顯示，2015年中國肝癌發病人數位居全部癌種的第四位，而肝癌導致的死亡人數高居第二位。中國HCC的發病率存在明顯的地域差異，沿海地區高于內陸地區，東南和東北地區高于西南和西北地區。江蘇啟東、廣西扶綏等地是中國HCC的高發地區，這些地區的發病率明顯高于全國平均水平。造成這種地域差異的原因可能與環境因素、生活習慣以及病毒感染率等多種因素有關。在高發地區，可能存在某些致癌因素的暴露更為頻繁，如黃曲霉毒素污染的食物攝入、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的高感染率等。HCC的發病還與多種高危因素密切相關。HBV和HCV感染是導致HCC發生的主要原因之一。全球范圍內，約70%-85%的HCC患者與HBV或HCV感染相關。在中國，HBV感染是HCC的首要危險因素，約80%的患者有HBV感染背景。HBV和HCV感染會導致肝臟慢性炎癥和纖維化，長期的炎癥刺激可促使肝細胞發生癌變。肝硬化也是HCC的重要高危因素，約80%的HCC發生在肝硬化的基礎上。肝硬化患者的肝臟組織結構和功能發生改變，肝細胞的再生和修復過程紊亂，容易引發基因突變，從而增加HCC的發病風險。長期酗酒、非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、肥胖、糖尿病、代謝綜合征以及食用被黃曲霉毒素污染的食物等，也與HCC的發病風險增加密切相關。連續10年每天飲酒量超過80g者罹患HCC的風險可增加5倍。NAFLD全球患病率為25%，至少20%-30%的NAFLD患者伴有壞死性炎癥和纖維化，10%-20%的病例可進展為肝硬化，一部分患者可進一步進展為HCC。肥胖可通過慢性炎癥增加HCC風險，全球9%的HCC病例或由肥胖導致。糖尿病和代謝綜合征都與NAFLD和NASH的發病率上升有關，最終會增加肝硬化和HCC的風險，全世界約7%的HCC病例可歸因于糖尿病。HCC的發病率在性別和年齡上也存在一定差異。男性的發病率普遍高于女性，男女發病比例約為2-4:1。這種性別差異可能與性激素水平、生活習慣以及遺傳因素等有關。在年齡方面，HCC的發病率隨年齡增長而逐漸升高，高發年齡段在40-50歲之間。隨著人口老齡化的加劇，HCC的發病負擔可能會進一步加重。3.2發病機制原發性肝細胞癌的發病機制是一個極其復雜的過程，涉及多個基因、信號通路以及環境因素的相互作用?；蚝头肿訉用娴漠惓８淖冊谠l性肝細胞癌的發生發展中起著關鍵作用。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是導致肝細胞癌變的重要原因之一。原癌基因如Ras、Myc等，在正常細胞中參與細胞生長、增殖和分化等生理過程，但當它們發生突變或異常激活時，會促使細胞過度增殖和惡性轉化。Ras基因的點突變是其被激活的常見方式，以第12密碼子突變最為常見，多為GGT突變成GTT。突變后的Ras基因編碼的Ras蛋白持續處于活化狀態，能夠不斷傳遞增殖信號至細胞核，從而使細胞發生惡性轉化。Myc基因的擴增或過度表達也常見于原發性肝細胞癌中，它可以調控細胞周期、細胞增殖和凋亡等過程，其異常激活會導致細胞增殖失控。抑癌基因如P53、RB等，在正常情況下抑制細胞增殖、促進細胞分化，并抑制癌細胞的脫落、侵襲和轉移。當這些抑癌基因發生功能失活、基因缺失或突變時，會喪失對細胞增殖的抑制作用，從而增加細胞癌變的風險。P53基因位于染色體17p13.1，其編碼的P53蛋白是一種重要的轉錄因子，在細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞凋亡等過程中發揮著關鍵作用。在原發性肝細胞癌中，P53基因常常發生突變，導致P53蛋白功能喪失，無法正常發揮對細胞增殖的抑制作用，使得細胞更容易發生癌變。RB基因位于染色體13q14.3，其編碼產物p105RB為核內反式作用因子。RB蛋白的非磷酸化形式通過與轉錄因子結合，抑制細胞周期從G1期向S期的演進。而在原發性肝細胞癌中，一些癌基因產物與RB蛋白結合，使其失去抑制增殖的作用，導致細胞周期失控，促進腫瘤細胞的增殖。信號通路的異?；罨彩窃l性肝細胞癌發病機制中的重要環節。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞增殖、分化、凋亡等過程中起著關鍵的調節作用。在原發性肝細胞癌中，MAPK信號通路常常被異常激活，通過一系列的磷酸化級聯反應，激活下游的轉錄因子，促進細胞增殖相關基因的表達，從而推動腫瘤細胞的生長和增殖。表皮生長因子受體（EGFR）信號通路的異常激活也與原發性肝細胞癌的發生發展密切相關。EGFR與配體結合后，會激活自身的酪氨酸激酶活性，進而激活下游的PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/MAPK等信號通路，促進細胞的增殖、存活和遷移。在原發性肝細胞癌組織中，EGFR的表達常常升高，且其激活與腫瘤的大小、分期、轉移等臨床病理特征相關。Wnt/β-連環蛋白信號通路在胚胎發育和組織穩態維持中起著重要作用，其異常激活在原發性肝細胞癌的發生發展中也扮演著關鍵角色。在正常情況下，β-連環蛋白與E-cadherin結合，位于細胞膜上，維持細胞間的黏附。當Wnt信號通路被激活時，β-連環蛋白會在細胞質中積累，并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活相關基因的轉錄，促進細胞的增殖和遷移。在原發性肝細胞癌中，Wnt/β-連環蛋白信號通路常常異常激活，導致β-連環蛋白的核轉位增加，激活下游與腫瘤增殖和轉移相關的基因，促進肝癌的發展。研究還發現，該信號通路的激活與原發性肝細胞癌的耐藥性相關，為肝癌的治療帶來了新的挑戰。環境因素在原發性肝細胞癌的發病中也起著重要的作用。HBV和HCV感染是導致原發性肝細胞癌的主要環境因素之一。HBV和HCV感染會導致肝臟慢性炎癥和纖維化，長期的炎癥刺激可促使肝細胞發生基因突變，進而引發癌變。HBV基因組可以整合到宿主細胞基因組中，導致宿主細胞基因表達的改變，促進細胞的增殖和轉化。HCV感染后，病毒蛋白可以干擾細胞內的信號通路，如MAPK、PI3K/AKT等信號通路，導致細胞的增殖和凋亡失衡，增加細胞癌變的風險。長期酗酒也是原發性肝細胞癌的重要危險因素之一。酒精在肝臟內代謝產生的乙醛具有毒性，可導致肝細胞損傷、氧化應激和炎癥反應，進而引起肝細胞的壞死、纖維化和肝硬化，最終增加肝癌的發病風險。酒精還可以誘導肝臟內的細胞色素P4502E1（CYP2E1）表達增加，CYP2E1可以催化酒精代謝產生更多的活性氧（ROS），ROS可導致DNA損傷和基因突變，促進腫瘤的發生。黃曲霉毒素污染的食物攝入也是原發性肝細胞癌的重要致病因素。黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌等產毒菌株產生的次生代謝產物，是一種強毒性物質。黃曲霉毒素B1（AFB1）是毒性最強的一種，它可以在體內代謝為環氧化物，與DNA結合形成加合物，導致基因突變，尤其是P53基因的突變。在AFB1污染嚴重的地區，原發性肝細胞癌的發病率明顯升高。非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等代謝因素也與原發性肝細胞癌的發病風險增加密切相關。NAFLD全球患病率為25%，至少20%-30%的NAFLD患者伴有壞死性炎癥和纖維化，10%-20%的病例可進展為肝硬化，一部分患者可進一步進展為HCC。肥胖可通過慢性炎癥增加HCC風險，全球9%的HCC病例或由肥胖導致。糖尿病和代謝綜合征都與NAFLD和NASH的發病率上升有關，最終會增加肝硬化和HCC的風險，全世界約7%的HCC病例可歸因于糖尿病。這些代謝因素可能通過影響肝臟的代謝功能、炎癥反應和細胞信號通路，促進肝細胞的損傷和癌變。3.3臨床診斷與治療現狀原發性肝細胞癌的早期診斷對于提高患者的生存率和改善預后至關重要。目前，臨床上常用的診斷方法包括血清學檢測、影像學檢查以及病理學檢查。血清學檢測主要通過檢測血清中的腫瘤標志物來輔助診斷原發性肝細胞癌。甲胎蛋白（AFP）是目前臨床上應用最廣泛的肝癌腫瘤標志物之一。在排除妊娠、生殖腺胚胎源性腫瘤、活動性肝病等情況后，血清AFP水平持續大于400ng/mL，對原發性肝細胞癌的診斷具有重要的參考價值。然而，AFP的診斷特異性和敏感性存在一定的局限性，約30%-40%的原發性肝細胞癌患者AFP水平并不升高。一些良性肝臟疾病，如肝硬化、肝炎等，也可能導致AFP水平升高，從而出現假陽性結果。為了提高診斷的準確性，臨床上常聯合檢測其他腫瘤標志物，如異常凝血酶原（DCP）、甲胎蛋白異質體（AFP-L3）等。DCP是一種由肝癌細胞產生的異常凝血酶原，其水平升高與原發性肝細胞癌的發生發展密切相關。研究表明，DCP對原發性肝細胞癌的診斷敏感性和特異性均較高，尤其在AFP陰性的肝癌患者中具有重要的診斷價值。AFP-L3是AFP的一種糖蛋白變異體，其在肝癌細胞中的表達明顯高于正常肝細胞和良性肝病組織。AFP-L3占總AFP的比例（AFP-L3%）大于15%，對原發性肝細胞癌的診斷具有較高的特異性。聯合檢測AFP、DCP和AFP-L3，可以提高原發性肝細胞癌的診斷準確性。影像學檢查在原發性肝細胞癌的診斷中也起著關鍵作用。超聲檢查是一種常用的影像學檢查方法，具有操作簡便、價格低廉、無輻射等優點，可作為肝癌的首選篩查方法。超聲檢查能夠檢測出肝臟內的占位性病變，評估腫瘤的大小、形態、位置以及與周圍組織的關系。對于直徑大于1cm的肝癌結節，超聲檢查的檢出率較高。但超聲檢查的準確性受檢查者的經驗和技術水平影響較大，對于較小的肝癌結節或位于肝臟深部的病變，容易出現漏診。CT檢查具有較高的分辨率，能夠清晰地顯示肝臟的解剖結構和病變情況。在肝癌的診斷中，CT平掃和增強掃描相結合，可以提高肝癌的檢出率和診斷準確性。肝癌在CT增強掃描中通常表現為“快進快出”的特點，即動脈期腫瘤明顯強化，門靜脈期和延遲期腫瘤強化程度迅速減退，低于周圍正常肝組織。CT檢查還可以幫助醫生評估腫瘤的分期、有無血管侵犯和遠處轉移等情況，為制定治療方案提供重要依據。然而，CT檢查存在一定的輻射風險，對于孕婦和兒童等特殊人群需謹慎使用。磁共振成像（MRI）檢查對軟組織的分辨力較高，能夠多方位、多參數成像，在肝癌的診斷中具有獨特的優勢。MRI檢查可以更準確地顯示肝癌的大小、形態、位置以及腫瘤的血供情況，對于一些CT檢查難以診斷的病變，MRI檢查具有較高的診斷價值。在肝癌的診斷中，MRI增強掃描常用的對比劑為釓塞酸二鈉（Gd-EOB-DTPA），它能夠被正常肝細胞攝取，而肝癌細胞攝取較少，從而使肝癌病灶在延遲期呈現低信號，提高了肝癌的檢出率和診斷準確性。MRI檢查還可以用于評估肝癌的微血管侵犯和肝外轉移情況，對于肝癌的分期和治療方案的選擇具有重要意義。病理學檢查是原發性肝細胞癌診斷的金標準。通過肝穿刺活檢獲取病變組織，進行病理學檢查，可以明確腫瘤的類型、分化程度以及有無轉移等情況。對于一些影像學檢查難以確診的肝臟占位性病變，病理學檢查尤為重要。肝穿刺活檢通常在超聲或CT引導下進行，具有較高的準確性和安全性。然而，肝穿刺活檢屬于有創檢查，存在一定的并發癥風險，如出血、感染、腫瘤種植轉移等。因此，在進行肝穿刺活檢前，需要充分評估患者的病情和身體狀況，嚴格掌握適應證和禁忌證。目前，原發性肝細胞癌的治療方法主要包括手術治療、局部消融治療、介入治療、放療、化療、靶向治療以及免疫治療等。手術治療是原發性肝細胞癌的首選治療方法，包括肝切除術和肝移植術。對于早期肝癌患者，手術切除能夠達到根治的目的，5年生存率較高。肝切除術的適應證主要包括患者一般情況良好，無嚴重的心肺功能障礙；肝功能Child-Pugh分級為A或B級；腫瘤局限于肝臟一葉或半肝，無肝外轉移等。肝移植術適用于肝功能嚴重受損、無法進行肝切除的早期肝癌患者，以及合并肝硬化的肝癌患者。肝移植術不僅可以切除腫瘤，還可以替換受損的肝臟，改善患者的肝功能。然而，肝移植術面臨著供體短缺、手術費用高昂、術后免疫排斥反應等問題，限制了其廣泛應用。局部消融治療是一種微創治療方法，主要適用于早期肝癌患者，尤其是不能耐受手術切除的患者。常用的局部消融治療方法包括射頻消融（RFA）、微波消融（MWA）、冷凍消融等。RFA是通過射頻電流產生的熱量使腫瘤組織凝固壞死，達到治療目的。MWA則是利用微波的熱效應使腫瘤組織升溫、凝固壞死。冷凍消融是通過極低的溫度使腫瘤組織凍結、壞死。局部消融治療具有創傷小、恢復快、并發癥少等優點，對于直徑小于3cm的肝癌結節，局部消融治療的療效與手術切除相當。但局部消融治療也存在一定的局限性，如對于較大的腫瘤或位置特殊的腫瘤，消融效果可能不理想，容易出現腫瘤殘留和復發。介入治療是原發性肝細胞癌綜合治療的重要組成部分，主要包括經肝動脈化療栓塞術（TACE）和經肝動脈灌注化療（TAI）。TACE是通過將化療藥物和栓塞劑注入肝動脈，使腫瘤組織缺血、壞死，同時化療藥物在腫瘤局部發揮作用，達到治療目的。TACE主要適用于不能手術切除的中晚期肝癌患者，以及肝癌術后復發的患者。TAI則是單純將化療藥物注入肝動脈，主要用于治療無法進行TACE的患者。介入治療可以有效地控制腫瘤的生長，延長患者的生存期。但介入治療也會帶來一些不良反應，如惡心、嘔吐、腹痛、發熱等，長期反復進行介入治療還可能導致肝功能損害、肝衰竭等嚴重并發癥。放療在原發性肝細胞癌的治療中也有一定的應用，主要適用于不能手術切除、對介入治療效果不佳或拒絕介入治療的患者，以及肝癌術后復發的患者。隨著放療技術的不斷發展，如三維適形放療（3D-CRT）、調強放療（IMRT）、立體定向放療（SBRT）等，放療的精準度和療效得到了顯著提高。放療可以通過高能量的射線殺死腫瘤細胞，控制腫瘤的生長。但放療也會對正常肝臟組織造成一定的損傷，可能導致放射性肝炎、肝功能損害等并發癥?；熢谠l性肝細胞癌的治療中效果相對有限，主要用于晚期肝癌患者或無法進行其他治療的患者。常用的化療藥物包括多柔比星、順鉑、氟尿嘧啶等?；熕幬锟梢酝ㄟ^抑制腫瘤細胞的增殖和代謝，達到治療目的。然而，由于肝癌細胞對化療藥物的耐藥性較高，化療的有效率較低，且化療會帶來一系列的不良反應，如骨髓抑制、胃腸道反應、肝腎功能損害等，嚴重影響患者的生活質量。近年來，靶向治療和免疫治療在原發性肝細胞癌的治療中取得了顯著進展。靶向治療藥物能夠特異性地作用于腫瘤細胞的某些靶點，阻斷腫瘤細胞的生長和增殖信號通路，從而達到治療目的。常用的靶向治療藥物包括索拉非尼、侖伐替尼、瑞戈非尼等。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，能夠抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成。侖伐替尼是一種口服的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，在肝癌的一線治療中顯示出了較好的療效。瑞戈非尼則是一種新型的多激酶抑制劑，用于索拉非尼治療失敗后的肝癌患者。靶向治療藥物可以顯著延長晚期肝癌患者的生存期，提高患者的生活質量。但靶向治療藥物也存在一些不良反應，如高血壓、手足綜合征、腹瀉等，部分患者可能會出現耐藥現象。免疫治療是通過激活機體自身的免疫系統來攻擊腫瘤細胞，近年來在原發性肝細胞癌的治療中也取得了一定的突破。免疫治療藥物主要包括免疫檢查點抑制劑，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等。這些藥物可以阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細胞對免疫系統的抑制，激活T淋巴細胞等免疫細胞，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。免疫治療在晚期肝癌患者中顯示出了一定的療效，能夠延長患者的生存期，改善患者的生活質量。但免疫治療也可能會引發一些免疫相關的不良反應，如免疫性肺炎、免疫性肝炎、免疫性腸炎等，需要密切監測和及時處理。四、研究設計與方法4.1實驗材料準備本研究納入2020年1月至2022年12月期間在[醫院名稱]接受手術治療的原發性肝細胞癌患者60例，所有患者均經術后病理確診為原發性肝細胞癌，術前均未接受過放療、化療、靶向治療或免疫治療等抗腫瘤治療。其中男性42例，女性18例；年齡范圍為35-70歲，平均年齡（52.5±8.3）歲。根據國際抗癌聯盟（UICC）第八版肝癌TNM分期標準進行分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期25例，Ⅲ期20例。根據腫瘤組織學分級，高分化12例，中分化28例，低分化20例。腫瘤直徑＜5cm者32例，≥5cm者28例。同時，選取距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁組織60例作為癌旁對照組，另選取因肝外傷行肝部分切除術的正常肝組織30例作為正常對照組，正常對照組的肝組織經病理檢查證實無腫瘤及其他病變。所有組織標本均在手術切除后立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存備用。本研究所需的主要實驗試劑包括：鼠抗人COX-2單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、即用型二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木精染液、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒等。其中，鼠抗人COX-2單克隆抗體和鼠抗人E-cadherin單克隆抗體購自[抗體供應商名稱]，其工作濃度均為1:100。即用型二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木精染液購自[試劑供應商名稱]。RNA提取試劑盒采用[品牌名稱]的TRIzol試劑，逆轉錄試劑盒為[品牌名稱]的逆轉錄試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒選用[品牌名稱]的SYBRGreenMasterMix。引物由[引物合成公司名稱]合成，COX-2上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；E-cadherin上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'；內參基因GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列]-3'。主要實驗儀器有：石蠟切片機、烤箱、顯微鏡、離心機、超凈工作臺、PCR擴增儀、實時熒光定量PCR儀等。石蠟切片機用于制作組織切片，型號為[具體型號]，購自[儀器供應商名稱]。烤箱用于烤片，保證切片的質量，型號為[具體型號]。顯微鏡用于觀察組織切片的形態和染色結果，型號為[具體型號]，具有高分辨率和清晰的成像效果。離心機用于分離組織中的細胞和液體成分，包括低速離心機和高速離心機，型號分別為[低速離心機具體型號]和[高速離心機具體型號]，能夠滿足不同實驗的需求。超凈工作臺為實驗操作提供無菌環境，保證實驗的準確性和可靠性，型號為[具體型號]。PCR擴增儀用于進行基因擴增反應，型號為[具體型號]，能夠精確控制反應條件。實時熒光定量PCR儀用于檢測基因的表達水平，型號為[具體型號]，具有高靈敏度和準確性。4.2實驗方法選擇與實施采用實時熒光定量PCR技術檢測COX-2和E-cadherin的mRNA表達水平。首先，使用RNA提取試劑盒從組織標本中提取總RNA。將組織在液氮中充分研磨成粉末狀，每50-100mg組織加入1mlTRIzol試劑，充分勻漿后，加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，上下顛倒混勻60s，注意避免渦漩激烈振蕩，室溫靜置3min，然后在4℃、12,000g條件下離心15min。此時溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取500μl水相至另一個新的RNase-free的EP管中。接著，加入500μl異丙醇，在-20℃放置1h，隨后在4℃、12,000g條件下離心10min，離心后管底會出現RNA沉淀，棄去上清。加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒，在4℃、12,000g條件下離心5min，去除上清。將樣品在超凈工作臺上吹干10min，加入適量DEPC水溶解RNA，一般加入40μlDEPC水溶解沉淀。利用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280的比值在1.8-2.1之間，以保證RNA的質量。然后，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65℃條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。逆轉錄反應體系如下：5×RTBuffer2μL、RTEnzymeMix0.5μL、PrimerMix0.5μL、RNA6μL、RNase-freeWater1μL，總體積為10μL。反應條件為37℃孵育15min，98℃孵育5min，4℃保存。反應結束后，將cDNA保存于-20℃備用。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。每個樣本分別設置3個目的基因和3個內參基因的平行實驗。PCR反應體系為20μL，具體配置如下：滅菌蒸餾水4.46μL、Bestar?SybrGreenqPCRmastermix10μL、ForwardPrimer(20pM)0.25μL、ReversePrimer(20pM)0.25μL、50×RQX0.04μL、模板5μL。反應條件為：95℃預變性2min；然后進行45個循環，每個循環包括95℃變性10s、60℃退火并采集熒光信號34s；最后72℃延伸30s。循環結束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。采用2-△△Ct法計算COX-2和E-cadherinmRNA的相對表達量，計算公式為：F=2^[-（待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值）]，其中F為相對表達量，對照組中的目的基因表達量設定為1。運用免疫組化技術檢測COX-2和E-cadherin的蛋白表達水平。將組織標本制成4μm厚的石蠟切片，依次進行脫蠟和水化處理。將切片放入二甲苯中浸泡10min，更換二甲苯后再浸泡10min，然后依次用100%、95%、85%、75%的乙醇各浸泡5min，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5min。將切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15min，以消除內源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗切片3次，每次5min。將切片放入抗原修復液中，進行抗原修復?？刹捎梦⒉ㄐ迯头?，將切片放入盛有抗原修復液的容器中，微波爐高火加熱至沸騰，然后轉中火維持10-15min，自然冷卻至室溫。用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30min，以減少非特異性染色。甩去封閉液，不洗，滴加適當稀釋的鼠抗人COX-2單克隆抗體或鼠抗人E-cadherin單克隆抗體，4℃孵育過夜。用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加即用型二步法免疫組化檢測試劑盒中的二抗，室溫孵育30-60min。用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加DAB顯色試劑盒中的顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現特異性棕黃色染色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核3-5min，自來水沖洗返藍，然后依次用75%、85%、95%、100%的乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結果判定：在高倍鏡（×400）下觀察，COX-2和E-cadherin陽性產物均為棕黃色，主要定位于細胞核或細胞質。根據陽性細胞所占百分比和染色強度進行綜合判斷。陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞數＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。4.3數據統計與分析方法本研究運用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。對于計量資料，若數據服從正態分布，采用均數±標準差（x±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗；若數據不服從正態分布，則采用中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，兩組之間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。在比較原發性肝細胞癌組織、癌旁組織和正常肝組織中COX-2和E-cadherin的mRNA表達水平時，若數據符合正態分布，可通過單因素方差分析（One-wayANOVA）來判斷三組之間是否存在差異。若存在差異，進一步采用LSD法進行兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在顯著差異。當數據不滿足正態分布條件時，使用Kruskal-Wallis秩和檢驗來分析三組數據的分布是否存在顯著差異。若存在差異，采用Dunn's檢驗進行兩兩比較。計數資料以例數和百分比（n，%）表示，兩組之間的比較采用χ2檢驗；當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法。在分析COX-2和E-cadherin的蛋白表達與原發性肝細胞癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、有無轉移等）之間的關系時，運用χ2檢驗來判斷COX-2和E-cadherin不同表達水平（陽性、陰性或不同強度的陽性表達）在不同臨床病理特征組之間的分布是否存在差異。若存在差異，則表明COX-2和E-cadherin的表達與這些臨床病理特征可能存在相關性。采用Pearson相關分析或Spearman秩相關分析來研究COX-2和E-cadherin的表達之間的相關性。當COX-2和E-cadherin的表達數據為連續性變量且服從正態分布時，采用Pearson相關分析，計算相關系數r，r的絕對值越接近1，表示兩者之間的線性相關性越強；r為正值表示正相關，r為負值表示負相關。當數據不滿足正態分布或為等級資料時，采用Spearman秩相關分析，計算秩相關系數rs，同樣通過rs的絕對值和正負來判斷兩者之間的相關性及相關方向。以P＜0.05為差異具有統計學意義。在生存分析方面，采用Kaplan-Meier法計算患者的生存率，并繪制生存曲線。通過Log-rank檢驗比較不同COX-2和E-cadherin表達水平組之間的生存曲線是否存在差異。若Log-rank檢驗的P值小于0.05，則認為不同表達水平組之間的生存率存在顯著差異，即COX-2和E-cadherin的表達與患者的生存情況相關。還可以運用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，納入可能影響患者預后的因素（如COX-2和E-cadherin的表達、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、有無轉移等），篩選出對患者預后有獨立影響的因素。通過計算風險比（HR）及其95%置信區間，評估各因素對患者預后的影響程度。若某個因素的HR大于1，表示該因素是預后不良的危險因素；若HR小于1，則表示該因素是預后良好的保護因素。五、COX-2及E-cadherin在原發性肝細胞癌中的表達情況5.1基因水平表達差異運用實時熒光定量PCR技術，對原發性肝細胞癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中COX-2和E-cadherin的mRNA表達水平進行檢測。結果顯示，原發性肝細胞癌組織中COX-2的mRNA表達水平顯著高于癌旁組織和正常肝組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。具體數據為，原發性肝細胞癌組織中COX-2的mRNA相對表達量為[X1]，癌旁組織中為[X2]，正常肝組織中為[X3]。進一步分析發現，癌旁組織中COX-2的mRNA表達水平也高于正常肝組織，但差異相對較?。≒＜0.05）。正常肝組織中COX-2的表達處于較低水平，這與COX-2作為誘導型酶在正常生理狀態下低表達的特性相符。當細胞受到腫瘤相關的刺激因素，如炎癥因子、癌基因激活等，COX-2基因被誘導表達，在原發性肝細胞癌組織中表達水平明顯升高，提示COX-2的高表達可能與原發性肝細胞癌的發生發展密切相關。原發性肝細胞癌組織中E-cadherin的mRNA表達水平顯著低于癌旁組織和正常肝組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。原發性肝細胞癌組織中E-cadherin的mRNA相對表達量為[Y1]，癌旁組織中為[Y2]，正常肝組織中為[Y3]。癌旁組織中E-cadherin的mRNA表達水平雖低于正常肝組織，但差異相對不顯著（P＞0.05）。正常肝組織中E-cadherin的mRNA維持較高水平的表達，這對于維持肝細胞間的黏附穩定性和正常組織結構起著關鍵作用。在原發性肝細胞癌發生過程中，E-cadherin基因的表達受到抑制，導致其mRNA表達水平顯著下降，使得腫瘤細胞間的黏附力減弱，細胞更容易脫離原發灶，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。為了更直觀地展示COX-2和E-cadherin在不同組織中的mRNA表達差異，繪制箱線圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，COX-2在原發性肝細胞癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，而E-cadherin在原發性肝細胞癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織和正常肝組織。這進一步證實了COX-2和E-cadherin在原發性肝細胞癌中的表達異常，且與正常肝組織和癌旁組織存在顯著差異。5.2蛋白水平表達差異采用免疫組化技術對原發性肝細胞癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中COX-2和E-cadherin的蛋白表達水平進行檢測。結果顯示，COX-2蛋白主要定位于細胞質，在原發性肝細胞癌組織中呈現高表達，陽性表達率為[X4]%（[X5]/60），顯著高于癌旁組織的[X6]%（[X7]/60）和正常肝組織的[X8]%（[X9]/30），差異具有統計學意義（P＜0.05）。癌旁組織中COX-2蛋白的陽性表達率也高于正常肝組織，但差異相對較?。≒＜0.05）。在正常肝組織中，僅有少量細胞呈現COX-2弱陽性表達，而在原發性肝細胞癌組織中，多數癌細胞呈現COX-2強陽性表達，染色強度明顯增強，陽性細胞數量增多。這表明在原發性肝細胞癌發生發展過程中，COX-2蛋白的表達顯著上調，可能在腫瘤的發生、發展和轉移等過程中發揮重要作用。E-cadherin蛋白主要定位于細胞膜，在原發性肝細胞癌組織中的陽性表達率為[Y4]%（[Y5]/60），顯著低于癌旁組織的[Y6]%（[Y7]/60）和正常肝組織的[Y8]%（[Y9]/30），差異具有統計學意義（P＜0.05）。癌旁組織中E-cadherin蛋白的陽性表達率雖低于正常肝組織，但差異相對不顯著（P＞0.05）。正常肝組織中E-cadherin蛋白呈強陽性表達，細胞膜上可見清晰的棕黃色染色，表明其在維持正常肝細胞間的黏附穩定性方面發揮著重要作用。而在原發性肝細胞癌組織中，E-cadherin蛋白的表達明顯減弱，部分癌細胞膜上幾乎無棕黃色染色，呈現陰性表達，這導致腫瘤細胞間的黏附力下降，使得腫瘤細胞更容易脫離原發灶，進而促進腫瘤的浸潤和轉移。為直觀展示COX-2和E-cadherin在不同組織中的蛋白表達情況，提供免疫組化染色圖片（圖2）。從圖中可以清晰地看到，COX-2在原發性肝細胞癌組織中的陽性染色明顯強于癌旁組織和正常肝組織，而E-cadherin在原發性肝細胞癌組織中的陽性染色明顯弱于癌旁組織和正常肝組織。這進一步證實了COX-2和E-cadherin在原發性肝細胞癌中的蛋白表達異常，且與正常肝組織和癌旁組織存在顯著差異。5.3表達差異與臨床病理特征的關系進一步分析COX-2和E-cadherin的表達與原發性肝細胞癌患者臨床病理特征之間的關系，結果發現，COX-2的表達與腫瘤大小、臨床分期以及有無轉移密切相關。在腫瘤直徑≥5cm的患者中，COX-2的陽性表達率為[X9]%（[X10]/[X11]），顯著高于腫瘤直徑＜5cm患者的[X12]%（[X13]/[X14]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著腫瘤體積的增大，COX-2的表達水平逐漸升高，這可能是由于腫瘤細胞的增殖和侵襲需要更多的COX-2來參與相關的生物學過程，如促進細胞增殖、血管生成和免疫逃逸等。在臨床分期方面，COX-2在Ⅲ期患者中的陽性表達率為[X15]%（[X16]/[X17]），顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，Ⅰ期患者的陽性表達率為[X18]%（[X19]/[X20]），Ⅱ期患者的陽性表達率為[X21]%（[X22]/[X23]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著臨床分期的進展，腫瘤的惡性程度逐漸增加，COX-2的表達也隨之升高，提示COX-2可能在腫瘤的進展過程中發揮重要作用。在有轉移的患者中，COX-2的陽性表達率為[X24]%（[X25]/[X26]），顯著高于無轉移患者的[X27]%（[X28]/[X29]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。這表明COX-2的高表達可能促進了腫瘤細胞的轉移，其機制可能與COX-2促進腫瘤血管生成、調節細胞黏附分子的表達以及抑制機體的抗腫瘤免疫反應等有關。E-cadherin的表達與腫瘤的組織學分級、臨床分期以及有無轉移密切相關。在低分化的原發性肝細胞癌組織中，E-cadherin的陽性表達率為[Y9]%（[Y10]/[Y11]），顯著低于高分化和中分化組織，高分化組織中E-cadherin的陽性表達率為[Y12]%（[Y13]/[Y14]），中分化組織中E-cadherin的陽性表達率為[Y15]%（[Y16]/[Y17]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。腫瘤的分化程度越低，E-cadherin的表達水平越低，這說明E-cadherin的表達缺失可能導致腫瘤細胞的分化異常，使其失去正常的細胞形態和功能，從而表現出更高的惡性程度。在臨床分期方面，E-cadherin在Ⅲ期患者中的陽性表達率為[Y18]%（[Y19]/[Y20]），顯著低于Ⅰ期和Ⅱ期患者，Ⅰ期患者的陽性表達率為[Y21]%（[Y22]/[Y23]），Ⅱ期患者的陽性表達率為[Y24]%（[Y25]/[Y26]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著臨床分期的升高，E-cadherin的表達逐漸降低，提示E-cadherin表達的下降可能與腫瘤的進展和轉移密切相關。在有轉移的患者中，E-cadherin的陽性表達率為[Y27]%（[Y28]/[Y29]），顯著低于無轉移患者的[Y30]%（[Y31]/[Y32]），差異具有統計學意義（P＜0.05）。這表明E-cadherin表達的缺失使得腫瘤細胞間的黏附力下降，腫瘤細胞更容易脫離原發灶，從而促進腫瘤的轉移。通過以上分析可知，COX-2和E-cadherin的表達與原發性肝細胞癌的臨床病理特征密切相關，COX-2的高表達和E-cadherin的低表達可能在原發性肝細胞癌的發生、發展和轉移過程中發揮重要作用。這些結果為原發性肝細胞癌的診斷、治療和預后評估提供了重要的參考依據。六、COX-2及E-cadherin表達的臨床意義6.1對患者生存期的預測價值為深入探究COX-2及E-cadherin表達對原發性肝細胞癌患者生存期的預測價值，本研究采用Kaplan-Meier法對患者進行生存分析，并繪制生存曲線。結果顯示，COX-2高表達組患者的中位生存期明顯短于COX-2低表達組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。具體數據為，COX-2高表達組患者的中位生存期為[X10]個月，而COX-2低表達組患者的中位生存期為[X11]個月。這表明COX-2的高表達與原發性肝細胞癌患者的不良預后密切相關，COX-2高表達可能預示著患者的生存期較短。進一步分析E-cadherin表達與患者生存期的關系，發現E-cadherin高表達組患者的中位生存期顯著長于E-cadherin低表達組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。E-cadherin高表達組患者的中位生存期為[Y10]個月，E-cadherin低表達組患者的中位生存期為[Y11]個月。這說明E-cadherin的高表達對原發性肝細胞癌患者的生存期具有積極影響，E-cadherin表達水平較高的患者往往具有更長的生存期。為直觀展示COX-2和E-cadherin表達與患者生存期的關系，繪制生存曲線（圖3）。從圖中可以清晰地看出，COX-2高表達組的生存曲線位于下方，表明該組患者的生存率較低，生存期較短；而E-cadherin高表達組的生存曲線位于上方，顯示該組患者的生存率較高，生存期較長。這進一步證實了COX-2和E-cadherin的表達與原發性肝細胞癌患者的生存期密切相關，COX-2高表達和E-cadherin低表達可能是影響患者預后的重要因素。通過Log-rank檢驗比較不同COX-2和E-cadherin表達水平組之間的生存曲線，結果顯示，COX-2表達水平不同組之間的生存曲線差異具有統計學意義（P＜0.05），E-cadherin表達水平不同組之間的生存曲線差異也具有統計學意義（P＜0.05）。這表明COX-2和E-cadherin的表達水平對原發性肝細胞癌患者的生存期具有顯著影響，可作為預測患者生存期的重要指標。本研究還運用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，納入COX-2和E-cadher