水質(zhì)水和廢水雌激素活性的測(cè)定體外人源細(xì)胞報(bào)告基因試驗(yàn)法水質(zhì)水和廢水雌激素活性的測(cè)定體外人源細(xì)胞報(bào)告基因試驗(yàn)法適用范圍本方法適用于地表水、生活污水及工業(yè)廢水等水體中雌激素活性的測(cè)定。該方法可檢測(cè)樣品中類雌激素物質(zhì)的總雌激素活性，能對(duì)水體的內(nèi)分泌干擾特性進(jìn)行初步評(píng)估。方法原理人源細(xì)胞報(bào)告基因試驗(yàn)法基于基因工程技術(shù)構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。將報(bào)告基因（如熒光素酶基因）與雌激素響應(yīng)元件（ERE）相連，轉(zhuǎn)入人源細(xì)胞（如MCF-7細(xì)胞等雌激素受體陽(yáng)性細(xì)胞）中，形成穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。當(dāng)樣品中存在具有雌激素活性的物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，復(fù)合物結(jié)合到ERE上，啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物（如熒光素酶催化底物產(chǎn)生的熒光信號(hào)），可以間接反映樣品中雌激素活性物質(zhì)的含量。熒光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中雌激素活性呈正相關(guān)，根據(jù)已知濃度的雌激素標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣品的雌激素活性。試劑和材料1.細(xì)胞系：選用穩(wěn)定表達(dá)帶有雌激素響應(yīng)元件和報(bào)告基因的人源細(xì)胞系，如MCF-7/Luc細(xì)胞。細(xì)胞保存在液氮罐中或-80℃冰箱。2.細(xì)胞培養(yǎng)基：如DMEM培養(yǎng)基，含有適量的胎牛血清（FBS，要求經(jīng)過(guò)活性炭處理以去除內(nèi)源性雌激素）、青霉素-鏈霉素雙抗等。3.雌激素標(biāo)準(zhǔn)品：β-雌二醇（E2），純度≥98%，用無(wú)水乙醇配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，-20℃保存。4.底物溶液：針對(duì)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的底物，如熒光素酶底物，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.磷酸鹽緩沖液（PBS）：用于細(xì)胞洗滌等操作，高壓滅菌后備用。6.胰蛋白酶消化液：用于細(xì)胞消化傳代，0.25%（w/v）。7.二甲基亞砜（DMSO）：用于溶解難溶性物質(zhì)，分析純。儀器設(shè)備1.細(xì)胞培養(yǎng)箱：溫度控制在37℃，含5%CO?。2.酶標(biāo)儀：具備檢測(cè)熒光信號(hào)的功能。3.超凈工作臺(tái)：用于細(xì)胞操作，保證無(wú)菌環(huán)境。4.離心機(jī)：可用于細(xì)胞離心收集等操作，轉(zhuǎn)速范圍0-5000r/min。5.倒置顯微鏡：用于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。6.移液器：不同量程，用于準(zhǔn)確移取液體。7.96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)檢測(cè)。樣品采集與保存1.樣品采集：使用干凈的聚乙烯塑料瓶或玻璃器皿采集水樣。對(duì)于地表水，在不同代表點(diǎn)位采集；對(duì)于廢水，在排放口等關(guān)鍵位置采集。采集時(shí)應(yīng)避免樣品被污染，充分混勻后取適量樣品。2.樣品保存：水樣采集后應(yīng)立即冷藏保存，若不能及時(shí)分析，應(yīng)在-20℃冷凍保存，但保存時(shí)間不宜超過(guò)1個(gè)月。分析前需將水樣解凍至室溫，充分混勻。試驗(yàn)步驟1.細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)（1）從液氮罐或-80℃冰箱中取出冷凍的細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中解凍。（2）將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，棄上清。（3）加入適量新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（4）每隔1-2天換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代。2.細(xì)胞接種（1）用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。（2）用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至適當(dāng)濃度（如5×10?-1×10?cells/mL）。（3）將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。3.樣品處理與加樣（1）取出冷凍保存的水樣，解凍后用0.45μm濾膜過(guò)濾，去除大顆粒雜質(zhì)。（2）若樣品中含有難溶性物質(zhì)，可加入適量DMSO助溶，但DMSO終濃度不超過(guò)0.1%（v/v）。（3）設(shè)置不同稀釋倍數(shù)的樣品組，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液）、陰性對(duì)照（僅含培養(yǎng)基）和空白對(duì)照（含培養(yǎng)基和DMSO但無(wú)樣品）。（4）吸去96孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入100μL相應(yīng)處理的樣品溶液或?qū)φ杖芤海糠N處理設(shè)置3-4個(gè)平行孔。4.培養(yǎng)與檢測(cè)（1）將加樣后的96孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。（2）取出培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。（3）每孔加入100μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)10-20min。（4）用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的熒光信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果計(jì)算與表示1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用線性回歸或非線性擬合的方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。2.樣品雌激素活性計(jì)算：根據(jù)樣品孔的熒光信號(hào)強(qiáng)度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品中相當(dāng)于E2的等效濃度（EEQ，μg/L），以此表示樣品的雌激素活性。3.結(jié)果表示：每個(gè)樣品的測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。報(bào)告中應(yīng)注明檢測(cè)限、定量限等參數(shù)。質(zhì)量控制1.陽(yáng)性對(duì)照：每次試驗(yàn)均需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照的劑量-反應(yīng)曲線應(yīng)符合預(yù)期，相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)≥0.95，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。2.陰性對(duì)照：陰性對(duì)照的熒光信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)處于較低水平且波動(dòng)范圍在規(guī)定限度內(nèi)（如熒光信號(hào)強(qiáng)度變異系數(shù)≤15%）。3.平行樣：每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置3-4個(gè)平行孔，平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)≤20%。4.加標(biāo)回收試驗(yàn)：定期進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，向已知雌激素活性的水樣中加入一定量的E2標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)回收率應(yīng)在80%-120%之間。注意事項(xiàng)1.細(xì)胞培養(yǎng)操作：整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，防止細(xì)胞污染。2.試劑質(zhì)量：使用的試劑應(yīng)符合質(zhì)量要求，特別是FBS要經(jīng)過(guò)去激素處理，避免內(nèi)源性雌激素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。3.樣品處理：樣品處理過(guò)程中應(yīng)避免劇烈振蕩等操作，防止雌激素活性物質(zhì)的損失或變性。4.儀器校準(zhǔn)：酶標(biāo)儀等儀器應(yīng)定期校準(zhǔn)，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。試題1.本方法適用于以下哪種水體中雌激素活性的測(cè)定？A.海水B.地表水、生活污水及工業(yè)廢水C.蒸餾水D.雨水答案：B分析：方法明確適用于地表水、生活污水及工業(yè)廢水等水體中雌激素活性的測(cè)定。2.人源細(xì)胞報(bào)告基因試驗(yàn)法中，與雌激素響應(yīng)元件相連的是？A.熒光蛋白基因B.報(bào)告基因C.抗生素基因D.轉(zhuǎn)錄因子基因答案：B分析：將報(bào)告基因與雌激素響應(yīng)元件相連，轉(zhuǎn)入人源細(xì)胞中。3.細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的胎牛血清需要？A.未處理過(guò)B.經(jīng)過(guò)活性炭處理以去除內(nèi)源性雌激素C.加熱滅活處理D.紫外線照射處理答案：B分析：為避免內(nèi)源性雌激素對(duì)試驗(yàn)干擾，胎牛血清需經(jīng)過(guò)活性炭處理。4.雌激素標(biāo)準(zhǔn)品β-雌二醇儲(chǔ)備液應(yīng)保存在？A.4℃冰箱B.-20℃冰箱C.室溫D.液氮罐答案：B分析：雌激素標(biāo)準(zhǔn)品β-雌二醇儲(chǔ)備液用無(wú)水乙醇配制后，-20℃保存。5.用于檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物熒光信號(hào)的儀器是？A.離心機(jī)B.酶標(biāo)儀C.超凈工作臺(tái)D.倒置顯微鏡答案：B分析：酶標(biāo)儀具備檢測(cè)熒光信號(hào)的功能。6.細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)控制在？A.30℃B.37℃C.40℃D.25℃答案：B分析：細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制在37℃，含5%CO?。7.樣品采集地表水時(shí)，應(yīng)在？A.任意位置B.水域中心位置C.不同代表點(diǎn)位D.靠近岸邊位置答案：C分析：地表水應(yīng)在不同代表點(diǎn)位采集。8.水樣采集后若不能及時(shí)分析，應(yīng)在？A.-4℃冷凍保存B.-20℃冷凍保存C.室溫保存D.4℃冷藏保存答案：B分析：水樣若不能及時(shí)分析，應(yīng)在-20℃冷凍保存，保存時(shí)間不超1個(gè)月。9.細(xì)胞復(fù)蘇后，將細(xì)胞懸液離心的轉(zhuǎn)速是？A.800r/minB.1000r/minC.1200r/minD.1500r/min答案：B分析：細(xì)胞復(fù)蘇后，1000r/min離心5min。10.細(xì)胞接種時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度至？A.1×103-5×103cells/mLB.5×10?-1×10?cells/mLC.1×10?-5×10?cells/mLD.5×10?-1×10?cells/mL答案：B分析：細(xì)胞接種時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?-1×10?cells/mL。11.處理樣品時(shí)，若樣品中含難溶性物質(zhì)，可加入適量DMSO助溶，但終濃度不超過(guò)？A.0.01%（v/v）B.0.1%（v/v）C.1%（v/v）D.10%（v/v）答案：B分析：處理樣品時(shí)，DMSO終濃度不超過(guò)0.1%（v/v）。12.加樣后培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時(shí)間是？A.6-12hB.18-24hC.24-36hD.36-48h答案：B分析：加樣后培養(yǎng)板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。13.用底物溶液檢測(cè)細(xì)胞熒光信號(hào)時(shí)，室溫避光反應(yīng)時(shí)間為？A.5-10minB.10-20minC.20-30minD.30-40min答案：B分析：加入底物溶液后，室溫避光反應(yīng)10-20min。14.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制是以E2標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的什么為縱坐標(biāo)？A.吸光度值B.熒光信號(hào)強(qiáng)度C.光密度值D.細(xì)胞數(shù)量答案：B分析：以不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。15.樣品雌激素活性用什么表示？A.實(shí)際雌激素物質(zhì)濃度B.相當(dāng)于E2的等效濃度（EEQ，μg/L）C.雌激素活性單位D.熒光信號(hào)強(qiáng)度答案：B分析：樣品雌激素活性以相當(dāng)于E2的等效濃度（EEQ，μg/L）表示。16.陽(yáng)性對(duì)照劑量-反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)滿足？A.R2≥0.90B.R2≥0.95C.R2≥0.98D.R2≥0.99答案：B分析：陽(yáng)性對(duì)照的劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)≥0.95，否則試驗(yàn)無(wú)效。17.陰性對(duì)照熒光信號(hào)強(qiáng)度波動(dòng)范圍（變異系數(shù)）要求是？A.≤10%B.≤15%C.≤20%D.≤25%答案：B分析：陰性對(duì)照的熒光信號(hào)強(qiáng)度變異系數(shù)≤15%。18.每個(gè)樣品平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)滿足？A.≤10%B.≤15%C.≤20%D.≤25%答案：C分析：每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置3-4個(gè)平行孔，平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)≤20%。19.加標(biāo)回收試驗(yàn)中，加標(biāo)回收率應(yīng)在？A.70%-110%B.80%-120%C.90%-130%D.60%-100%答案：B分析：加標(biāo)回收試驗(yàn)加標(biāo)回收率應(yīng)在80%-120%之間。20.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，最關(guān)鍵的是？A.控制溫度B.無(wú)菌操作C.控制CO?濃度D.控制培養(yǎng)基成分答案：B分析：整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，防止細(xì)胞污染。21.細(xì)胞培養(yǎng)基中青霉素-鏈霉素雙抗的作用是？A.促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)B.調(diào)節(jié)pH值C.抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)D.提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)答案：C分析：青霉素-鏈霉素雙抗可抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)。22.用于細(xì)胞消化傳代的胰蛋白酶消化液濃度是？A.0.1%（w/v）B.0.25%（w/v）C.0.5%（w/v）D.1%（w/v）答案：B分析：用于細(xì)胞消化傳代的胰蛋白酶消化液濃度為0.25%（w/v）。23.細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)至多少匯合度時(shí)進(jìn)行傳代？A.50%-60%B.60%-70%C.80%-90%D.90%-100%答案：C分析：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代。24.采集水樣的器皿可以是？A.鐵制容器B.聚乙烯塑料瓶或玻璃器皿C.陶瓷容器D.橡膠容器答案：B分析：使用干凈的聚乙烯塑料瓶或玻璃器皿采集水樣。25.樣品分析前解凍至室溫后需要？A.直接檢測(cè)B.高速離心C.充分混勻D.過(guò)濾兩次答案：C分析：分析前將水樣解凍至室溫，充分混勻。26.96孔板加樣時(shí)，每種處理應(yīng)設(shè)置幾個(gè)平行孔？A.1-2個(gè)B.3-4個(gè)C.5-6個(gè)D.7-8個(gè)答案：B分析：每種處理設(shè)置3-4個(gè)平行孔。27.細(xì)胞計(jì)數(shù)使用的工具是？A.分光光度計(jì)B.細(xì)胞計(jì)數(shù)板C.流式細(xì)胞儀D.電子天平答案：B分析：用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。28.酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光信號(hào)前，細(xì)胞需要用什么洗滌？A.蒸餾水B.生理鹽水C.磷酸鹽緩沖液（PBS）D.培養(yǎng)基答案：C分析：檢測(cè)熒光信號(hào)前，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。29.以下哪種物質(zhì)不能用于溶解樣品中難溶性物質(zhì)？A.DMSOB.乙醇C.丙酮D.水答案：C分析：常用DMSO或乙醇溶解難溶性物質(zhì)，丙酮可能對(duì)細(xì)胞有毒性，不用于本試驗(yàn)。30.細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)，CO?的作用是？A.殺菌B.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值C.促進(jìn)細(xì)胞呼吸D.提供能量答案：B分析：細(xì)胞培養(yǎng)箱中5%CO?的作用是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。31.標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的擬合方法可以是？A.線性回歸B.非線性擬合C.線性回歸或非線性擬合D.多項(xiàng)式擬合答案：C分析：采用線性回歸或非線性擬合的方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。32.本試驗(yàn)中，底物溶液要？A.提前配制好保存B.現(xiàn)用現(xiàn)配C.加熱處理后使用D.與培養(yǎng)基混合使用答案：B分析：底物溶液如熒光素酶底物，現(xiàn)用現(xiàn)配。33.若陽(yáng)性對(duì)照劑量-反應(yīng)曲線不符合預(yù)期，相關(guān)系數(shù)不滿足要求，應(yīng)該？A.繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)B.調(diào)整樣品濃度重新試驗(yàn)C.查找原因重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)D.忽略陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果分析樣品答案：C分析：陽(yáng)性對(duì)照不符合要求，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查找原因重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。34.細(xì)胞從液氮罐或-80℃冰箱取出后，應(yīng)？A.緩慢解凍B.迅速放入37℃水浴鍋中解凍C.室溫解凍D.放在4℃冰箱解凍答案：B分析：細(xì)胞從冷凍狀態(tài)取出后，迅速放入37℃水浴鍋中解凍。35.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，換液的時(shí)間間隔是？A.每天B.每隔1-2天C.每隔3-4天D.每隔5-6天答案：B分析：每隔1-2天換液。36.以下關(guān)于樣品保存時(shí)間的說(shuō)法正確的是？A.常溫下可保存1個(gè)月B.-20℃冷凍保存不超過(guò)1個(gè)月C.4℃冷藏可保存3個(gè)月D.-80℃冷凍可永久保存答案：B分析：水樣在-20℃冷凍保存時(shí)間不宜超過(guò)1個(gè)月。37.加樣后培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱前需要？A.劇烈振蕩B.輕搖使液體均勻分布C.高速離心D.直接放入答案：B分析：加樣后輕搖使液體均勻分布在培養(yǎng)板孔內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱。38.計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇處于什么時(shí)期的細(xì)胞？A.潛伏期B.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C.穩(wěn)定期D.衰亡期答案：B分析：用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)也是針對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。39.試驗(yàn)中使用的超凈工作臺(tái)的作用是？A.控制溫度B.保證無(wú)菌環(huán)境C.調(diào)節(jié)濕度D.檢測(cè)氣體成分答案：B分析：超凈工作臺(tái)用于細(xì)胞操作，保證無(wú)菌環(huán)境。40.細(xì)胞復(fù)蘇后離心棄上清是為了？A.去除細(xì)胞碎片B.去除冷凍保護(hù)劑C.濃縮細(xì)胞D.改變細(xì)胞滲透壓答案：B分析：細(xì)胞復(fù)蘇后離心棄上清是為了去除冷凍保護(hù)劑等雜質(zhì)。41.底物溶液反應(yīng)時(shí)要求避光的原因是？A.防止溶液揮發(fā)B.避免底物分解C.防止細(xì)胞受損D.保證熒光信號(hào)穩(wěn)定答案：B分析：底物溶液反應(yīng)時(shí)避光可避免底物分解，保證檢測(cè)準(zhǔn)確性。42.標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用是？A.確定細(xì)胞生長(zhǎng)情況B.根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算樣品雌激素活性C