一、引言1.1L-組氨酸概述L-組氨酸（L-Histidine）化學(xué)名為L(zhǎng)-α-氨基-β-咪唑丙酸，是一種分子中含有咪唑核的堿性氨基酸，呈無色片狀或針狀結(jié)晶，無臭，稍有苦味，其軟化點(diǎn)為227℃，分解點(diǎn)為277℃，可溶于水，旋光度為-39.4°(c=1.13，水中)。在營(yíng)養(yǎng)學(xué)范疇，L-組氨酸對(duì)于嬰幼兒及動(dòng)物的成長(zhǎng)尤其重要，是一種半必需氨基酸。在人體內(nèi)，組氨酸可由普通的中間代謝產(chǎn)物合成，但幼齡動(dòng)物和嬰兒體內(nèi)的合成量不能滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要，成年動(dòng)物若不從食物中補(bǔ)充，體內(nèi)合成的也難以滿足需求。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-組氨酸用途廣泛。它的咪唑基能與Fe2?或其他金屬離子形成配位化合物，促進(jìn)鐵的吸收，可用于防治貧血；能夠降低胃液酸度，緩和胃腸手術(shù)的疼痛，減輕妊娠期嘔吐及胃部灼熱感，抑制由植物神經(jīng)緊張而引起的消化道潰爛；還可擴(kuò)張血管，降低血壓，用于心絞痛、心功能不全等疾病的治療，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者也有一定療效，使用后可使患者握力、走路與血沉等指標(biāo)得到好轉(zhuǎn)。此外，L-組氨酸也是氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑的極重要成分。基于鑭系納米熒光傳感器用于白酒中酒精度檢測(cè)在食品行業(yè)，L-組氨酸可作為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，用于強(qiáng)化嬰幼兒食品和術(shù)后病人的食品等，組氨酸占食品中總蛋白質(zhì)的2.4％，它還可用于制造面包時(shí)的化學(xué)膨松劑，添加后能改善面包的香味。在飼料行業(yè)，L-組氨酸參與動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等重要生理過程，對(duì)動(dòng)物的健康成長(zhǎng)具有重要意義。1.2L-組氨酸生產(chǎn)方法蛋白質(zhì)水解法：以動(dòng)物血粉、干面粉、豬毛或蹄甲為原料，通過酸水解或酶水解的方式將蛋白質(zhì)分解為氨基酸混合物，再經(jīng)過分離、提純等步驟得到L-組氨酸。其原理是利用酸或酶破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，使氨基酸釋放出來。該方法操作步驟繁瑣，需要進(jìn)行多次分離和純化操作；生產(chǎn)成本高，原料成本較高且利用率低；對(duì)環(huán)境污染大，水解過程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢水和廢渣。化學(xué)合成法：通過化學(xué)合成反應(yīng)，以相應(yīng)的化學(xué)原料為起始物，經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)合成L-組氨酸。此方法的反應(yīng)條件較為苛刻，通常需要高溫、高壓或使用特殊的催化劑；合成過程復(fù)雜，需要多步反應(yīng)，且副反應(yīng)較多，導(dǎo)致產(chǎn)物純度較低，分離提純困難；同時(shí)，化學(xué)合成法可能會(huì)使用一些有毒有害的化學(xué)試劑，對(duì)環(huán)境和操作人員的健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。微生物發(fā)酵法：借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通過對(duì)組氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變，選育出營(yíng)養(yǎng)缺陷型及組氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦瑥亩_(dá)到過量積累L-組氨酸的目的。微生物發(fā)酵法具有原料成本低的優(yōu)勢(shì)，通常以糖類等廉價(jià)物質(zhì)為原料；反應(yīng)條件溫和，一般在常溫、常壓下進(jìn)行，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；發(fā)酵周期相對(duì)較短，能提高生產(chǎn)效率；且過程易控制，可通過調(diào)節(jié)發(fā)酵條件來優(yōu)化生產(chǎn)過程。目前，微生物發(fā)酵法已成為工業(yè)化生產(chǎn)L-組氨酸的首選方法。1.3研究背景和意義當(dāng)前，雖然微生物發(fā)酵法在L-組氨酸生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位，但仍存在一些問題。一方面，L-組氨酸的生物合成具有與核苷酸合成競(jìng)爭(zhēng)前體物質(zhì)、復(fù)雜的代謝調(diào)控機(jī)制以及合成過程中高能量需求等特點(diǎn)，導(dǎo)致其工程菌的產(chǎn)酸水平和轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低。另一方面，傳統(tǒng)的誘變篩選方法會(huì)使菌株積累大量的負(fù)效應(yīng)突變，致使菌株生長(zhǎng)緩慢、環(huán)境耐受性降低以及營(yíng)養(yǎng)需求增高等，限制了菌株的工業(yè)化應(yīng)用。ATP（三磷酸腺苷）作為細(xì)胞內(nèi)的能量“貨幣”，在微生物的代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。在L-組氨酸的生物合成途徑中，許多關(guān)鍵酶促反應(yīng)都需要ATP提供能量。增強(qiáng)ATP供應(yīng)，能夠?yàn)長(zhǎng)-組氨酸的合成提供更充足的能量，推動(dòng)生物合成反應(yīng)的順利進(jìn)行，從而提高大腸桿菌合成L-組氨酸的能力。通過研究增強(qiáng)ATP供應(yīng)對(duì)大腸桿菌合成L-組氨酸的影響，有助于深入了解微生物代謝機(jī)制，為優(yōu)化L-組氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)，對(duì)于提高L-組氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望推動(dòng)L-組氨酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。二、L-組氨酸和ATP生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制2.1L-組氨酸生物合成途徑在大腸桿菌中，L-組氨酸的合成起始于磷酸戊糖途徑（PPP）的中間產(chǎn)物5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）。PRPP在ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（HisG）的催化下，與ATP反應(yīng)生成N-1-(5'-磷酸核糖基)-ATP（PR-ATP），此反應(yīng)消耗1分子ATP。PR-ATP在焦磷酸水解酶（HisI）作用下，水解掉一個(gè)焦磷酸基團(tuán)，生成N-1-(5'-磷酸核糖基)-AMP（PR-AMP）。PR-AMP在異構(gòu)酶（HisA）的催化下，發(fā)生分子內(nèi)重排，形成5-氨基-1-(5'-磷酸核糖基)咪唑-4-羧酸（AIR）。AIR在ATP：磷酸核糖基-AMP環(huán)化水解酶（HisH）的作用下，與ATP反應(yīng)并環(huán)化，生成5-氨基-4-甲酰胺基咪唑核糖核苷酸（AICAR），同時(shí)釋放出ADP和Pi。AICAR在AICAR轉(zhuǎn)甲酰基酶（HisF）的催化下，接受來自四氫葉酸攜帶的甲酰基，生成5-甲酰胺基-4-甲酰胺基咪唑核糖核苷酸（FAICAR）。FAICAR在環(huán)化脫水酶（HisB）的作用下，發(fā)生環(huán)化脫水反應(yīng)，生成咪唑甘油磷酸（IGP）。IGP在IGP轉(zhuǎn)氨酶（HisC）的催化下，以L-谷氨酸為氨基供體，生成咪唑丙酮酸（IP），同時(shí)產(chǎn)生α-酮戊二酸。IP在IP還原酶（HisD）的催化下，利用NADPH提供的還原力，還原為咪唑乙醇磷酸（IEP）。最后，IEP在HisE催化下，經(jīng)過脫磷酸作用生成L-組氨酸。整個(gè)L-組氨酸合成途徑涉及多種酶的協(xié)同作用，這些酶的編碼基因通常成簇存在，形成組氨酸操縱子，受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控，以確保組氨酸的合成與細(xì)胞的需求相適應(yīng)。2.2ATP從頭合成途徑ATP的從頭合成途徑是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要通過細(xì)胞呼吸中的糖酵解、三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）以及氧化磷酸化來實(shí)現(xiàn)。在大腸桿菌中，葡萄糖經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）進(jìn)入細(xì)胞后，首先進(jìn)行糖酵解。在糖酵解過程中，葡萄糖逐步分解為丙酮酸，這個(gè)過程會(huì)產(chǎn)生少量的ATP和NADH。糖酵解的主要步驟包括：葡萄糖在己糖激酶的催化下，磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，消耗1分子ATP；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)化為果糖-6-磷酸；果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶的作用下，再次磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸，又消耗1分子ATP；果糖-1,6-二磷酸裂解為甘油醛-3-磷酸和磷酸二羥丙酮，二者可以相互轉(zhuǎn)化；甘油醛-3-磷酸在一系列酶的催化下，經(jīng)過脫氫、磷酸化等反應(yīng)，生成丙酮酸，此過程產(chǎn)生2分子NADH和4分子ATP，但由于起始階段消耗了2分子ATP，所以凈生成2分子ATP。丙酮酸在丙酮酸脫氫酶系的作用下，氧化脫羧生成乙酰輔酶A，同時(shí)產(chǎn)生1分子NADH。乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在循環(huán)過程中，乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合生成檸檬酸，檸檬酸經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，逐步氧化脫羧，生成二氧化碳、NADH、FADH?和ATP（或GTP）。例如，在異檸檬酸脫氫酶的催化下，異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸，產(chǎn)生1分子NADH；α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脫氫酶系的作用下，再次氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A，又產(chǎn)生1分子NADH；琥珀酰輔酶A在琥珀酸硫激酶的催化下，生成琥珀酸，同時(shí)產(chǎn)生1分子ATP（或GTP）；琥珀酸在琥珀酸脫氫酶的作用下，脫氫生成延胡索酸，產(chǎn)生1分子FADH?；延胡索酸在延胡索酸酶的作用下，加水生成蘋果酸，蘋果酸在蘋果酸脫氫酶的作用下，脫氫生成草酰乙酸，產(chǎn)生1分子NADH。糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的NADH和FADH?，通過電子傳遞鏈（呼吸鏈）將電子傳遞給氧氣，同時(shí)將質(zhì)子泵出線粒體內(nèi)膜（在大腸桿菌中是細(xì)胞膜），形成質(zhì)子梯度。質(zhì)子通過ATP合酶回流時(shí)，驅(qū)動(dòng)ADP和Pi合成ATP，這一過程稱為氧化磷酸化。電子傳遞鏈由一系列的電子載體組成，包括NADH脫氫酶、細(xì)胞色素bc?復(fù)合物、細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素氧化酶等。NADH將電子傳遞給NADH脫氫酶，電子依次通過電子傳遞鏈傳遞，最終傳遞給氧氣，氧氣得到電子后與質(zhì)子結(jié)合生成水。在電子傳遞過程中，質(zhì)子被泵出線粒體內(nèi)膜，形成質(zhì)子梯度，質(zhì)子通過ATP合酶回流時(shí)，ATP合酶利用質(zhì)子梯度的能量，催化ADP和Pi合成ATP。2.3AICAR循環(huán)途徑和代謝調(diào)控機(jī)制AICAR（5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）循環(huán)途徑與L-組氨酸和ATP的合成密切相關(guān)。在嘌呤核苷酸的合成過程中，AICAR是一個(gè)重要的中間產(chǎn)物。從5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）開始，經(jīng)過一系列反應(yīng)合成次黃嘌呤核苷酸（IMP），IMP可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）。在這個(gè)過程中，AICAR處于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它既可以繼續(xù)參與嘌呤核苷酸的合成，生成IMP，進(jìn)而生成AMP和ATP；同時(shí)，AMP又可以通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為PR-ATP，PR-ATP是L-組氨酸合成途徑中的起始底物之一，用于合成L-組氨酸。AICAR循環(huán)途徑的代謝調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。一方面，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)L-組氨酸或嘌呤核苷酸含量過高時(shí)，會(huì)通過反饋抑制相關(guān)酶的活性來調(diào)節(jié)代謝流。例如，組氨酸對(duì)ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（HisG）具有反饋抑制作用，當(dāng)組氨酸積累時(shí)，會(huì)抑制HisG的活性，從而減少PR-ATP的生成，使L-組氨酸的合成途徑受到抑制。另一方面，嘌呤核苷酸的合成也受到嚴(yán)格調(diào)控，IMP脫氫酶受GMP的反饋抑制和阻遏，SAMP合成酶受AMP的抑制等，這些調(diào)節(jié)機(jī)制確保了細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸和L-組氨酸的合成維持在合適的水平，避免過度合成造成資源浪費(fèi)，同時(shí)也保證了細(xì)胞在需要時(shí)能夠及時(shí)合成足夠的產(chǎn)物滿足生理需求。此外，AICAR循環(huán)還與細(xì)胞的能量狀態(tài)和碳氮代謝等密切相關(guān)，通過與其他代謝途徑的相互協(xié)調(diào)，共同維持細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)。三、增強(qiáng)ATP供應(yīng)的策略與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1增強(qiáng)AMP合成途徑3.1.1purH基因的整合為增強(qiáng)AMP合成途徑，首先考慮整合purH基因。purH基因編碼的肌苷酸環(huán)水解酶在嘌呤核苷酸合成途徑中起著關(guān)鍵作用。在嘌呤核苷酸從頭合成過程中，從5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）開始，經(jīng)過一系列反應(yīng)生成次黃嘌呤核苷酸（IMP），而purH基因編碼的酶參與了IMP合成過程中的重要步驟。實(shí)驗(yàn)操作上，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將purH基因整合到大腸桿菌的基因組中。具體步驟如下：首先，設(shè)計(jì)針對(duì)大腸桿菌基因組特定整合位點(diǎn)的sgRNA（單鏈向?qū)NA），使其能夠引導(dǎo)Cas9核酸酶準(zhǔn)確切割基因組上的目標(biāo)位置，為purH基因的插入創(chuàng)造條件。同時(shí)，構(gòu)建含有purH基因及相關(guān)同源臂的重組質(zhì)粒，同源臂的序列與目標(biāo)整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因組序列相同，用于在基因編輯過程中通過同源重組將purH基因整合到基因組中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過電轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法，使重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，Cas9核酸酶在sgRNA的引導(dǎo)下切割基因組，同時(shí)重組質(zhì)粒上的purH基因通過同源重組整合到切割位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)purH基因在大腸桿菌基因組中的穩(wěn)定整合。通過整合purH基因，能夠增強(qiáng)嘌呤核苷酸合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)，促進(jìn)IMP的合成，進(jìn)而為AMP的合成提供更多的前體物質(zhì)，增強(qiáng)AMP合成途徑，為ATP的合成奠定基礎(chǔ)。3.1.2purA和purB基因的整合在整合purH基因之后，進(jìn)一步整合purA和purB基因。purA基因編碼腺苷酸琥珀酸合成酶，purB基因編碼腺苷酸琥珀酸裂解酶，這兩個(gè)基因在AMP的合成過程中發(fā)揮著重要作用。從IMP合成AMP的過程中，purA基因編碼的酶催化IMP與天冬氨酸反應(yīng)生成腺苷酸琥珀酸，purB基因編碼的酶則催化腺苷酸琥珀酸裂解生成AMP和延胡索酸。實(shí)驗(yàn)過程中，同樣運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。設(shè)計(jì)針對(duì)purA和purB基因整合位點(diǎn)的sgRNA，構(gòu)建含有purA和purB基因以及相應(yīng)同源臂的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已整合purH基因的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用同源重組的原理，將purA和purB基因整合到大腸桿菌基因組的特定位置。整合purA和purB基因的目的是加強(qiáng)從IMP到AMP的合成途徑，使細(xì)胞能夠更高效地將IMP轉(zhuǎn)化為AMP，增加AMP的合成量，從而為ATP的合成提供更多的直接前體，進(jìn)一步增強(qiáng)ATP的合成能力，滿足大腸桿菌合成L-組氨酸過程中對(duì)能量的需求。3.2阻斷部分支路代謝3.2.1阻斷ATP分解途徑在增強(qiáng)ATP供應(yīng)的過程中，阻斷ATP分解途徑是重要的策略之一。mazG基因編碼的蛋白參與了ATP的分解過程，敲除mazG基因可以有效阻斷ATP的分解途徑。ATP在細(xì)胞內(nèi)的分解是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，mazG基因編碼的蛋白能夠催化ATP水解為ADP和Pi，從而降低細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除mazG基因。設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，使其靶向mazG基因序列，引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)mazG基因進(jìn)行切割，造成基因片段的缺失或突變，從而使mazG基因失去功能。敲除mazG基因后，細(xì)胞內(nèi)ATP分解的速率降低，ATP得以在細(xì)胞內(nèi)積累，提高了細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度，為L(zhǎng)-組氨酸的合成提供更充足的能量來源。同時(shí)，減少ATP的分解也有助于維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的平衡，使細(xì)胞能夠?qū)⒏嗟哪芰坑糜贚-組氨酸的生物合成過程，提高了能量的利用效率，對(duì)大腸桿菌合成L-組氨酸具有積極的促進(jìn)作用。3.2.2降低前體物IMP和AMP消耗為了進(jìn)一步增強(qiáng)ATP的供應(yīng)，降低前體物IMP和AMP的消耗至關(guān)重要。ushA、surE、yrfG和yjjG基因編碼的蛋白參與了IMP和AMP的代謝支路，敲除這些基因可以減少IMP和AMP的不必要消耗。在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，ushA基因編碼的蛋白可能參與了IMP或AMP向其他代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化過程，surE、yrfG和yjjG基因編碼的蛋白也在不同程度上影響著IMP和AMP的代謝流向。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別設(shè)計(jì)針對(duì)ushA、surE、yrfG和yjjG基因的sgRNA，構(gòu)建相應(yīng)的基因敲除質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過同源重組的方式，使這些基因在基因組中被敲除。敲除這些基因后，IMP和AMP的代謝支路被阻斷，它們更多地被用于嘌呤核苷酸的合成以及ATP的合成，減少了前體物的浪費(fèi)，提高了代謝途徑的效率。更多的IMP和AMP可用于合成ATP，為L(zhǎng)-組氨酸的合成提供了更充足的能量和前體物質(zhì)，有助于提高大腸桿菌合成L-組氨酸的產(chǎn)量和效率。3.2.3阻斷AMP分解途徑除了降低前體物消耗，阻斷AMP分解途徑也是增強(qiáng)ATP供應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。amn和ygdH基因編碼的酶參與了AMP的分解過程，敲除amn和ygdH基因可以有效阻斷AMP分解為腺嘌呤和核糖-5-磷酸的反應(yīng)。在細(xì)胞代謝過程中，AMP的分解會(huì)導(dǎo)致ATP合成前體的減少，影響ATP的合成效率。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)amn和ygdH基因的sgRNA，構(gòu)建含有相應(yīng)同源臂的敲除質(zhì)粒。將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過同源重組實(shí)現(xiàn)amn和ygdH基因的敲除。此外，apt和hpt基因也參與了AMP的相關(guān)代謝過程，敲除apt和hpt基因同樣可以阻斷AMP的分解途徑。設(shè)計(jì)針對(duì)apt和hpt基因的sgRNA，構(gòu)建敲除質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)基因的敲除。敲除amn和ygdH、apt和hpt基因后，AMP的分解途徑被阻斷，細(xì)胞內(nèi)AMP的含量得以維持在較高水平，更多的AMP可以通過腺苷酸激酶的作用轉(zhuǎn)化為ATP，從而增強(qiáng)了ATP的供應(yīng)能力。這為大腸桿菌合成L-組氨酸提供了更穩(wěn)定的能量保障，促進(jìn)了L-組氨酸合成途徑的順利進(jìn)行，有利于提高L-組氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。3.3優(yōu)化AMP、ADP和ATP間的動(dòng)態(tài)調(diào)控3.3.1整合不同表達(dá)強(qiáng)度的adk基因AMP、ADP和ATP之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞的能量代謝至關(guān)重要，而adk基因編碼的腺苷酸激酶在這一過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。adk基因編碼的腺苷酸激酶能夠催化ATP和AMP之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使ATP和AMP之間保持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平較高時(shí)，腺苷酸激酶可以將ATP的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給AMP，生成2分子ADP；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平較低時(shí)，腺苷酸激酶又可以催化2分子ADP反應(yīng)生成ATP和AMP。為了優(yōu)化AMP、ADP和ATP間的動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過整合不同表達(dá)強(qiáng)度的adk基因來實(shí)現(xiàn)。構(gòu)建一系列攜帶不同啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的adk基因表達(dá)載體，這些啟動(dòng)子或增強(qiáng)子具有不同的強(qiáng)度，能夠調(diào)控adk基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平。將這些表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，篩選出整合了不同表達(dá)強(qiáng)度adk基因的菌株。通過實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)adk基因表達(dá)強(qiáng)度適中時(shí)，能夠最有效地調(diào)節(jié)AMP、ADP和ATP之間的動(dòng)態(tài)平衡。在L-組氨酸合成過程中，合適的adk基因表達(dá)強(qiáng)度可以確保細(xì)胞在不同的代謝狀態(tài)下，都能及時(shí)調(diào)整ATP、ADP和AMP的比例，滿足L-組氨酸合成對(duì)能量的需求。適度增強(qiáng)adk基因的表達(dá)，可以提高ATP的再生速率，使細(xì)胞在消耗ATP進(jìn)行L-組氨酸合成時(shí)，能夠迅速補(bǔ)充ATP，維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡，促進(jìn)L-組氨酸的高效合成。3.3.2整合ndk、pykF和pykA基因除了adk基因，ndk、pykF和pykA基因也在細(xì)胞能量代謝和AMP、ADP、ATP的動(dòng)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。ndk基因編碼的核苷二磷酸激酶能夠催化NDP（如ADP）和NTP（如ATP）之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同核苷酸之間的平衡。pykF和pykA基因分別編碼丙酮酸激酶的兩種同工酶，丙酮酸激酶在糖酵解過程中催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生ATP，對(duì)細(xì)胞的能量代謝和ATP合成具有重要影響。在實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用CRISP食品包裝物流過程中F--2毒素的檢測(cè)與評(píng)價(jià)R/Cas9基因編輯技術(shù)，將ndk、pykF和pykA基因整合到大腸桿菌基因組中。設(shè)計(jì)針對(duì)這些基因整合位點(diǎn)的sgRNA，構(gòu)建含有ndk、pykF和pykA基因及相應(yīng)同源臂的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組實(shí)現(xiàn)基因的整合。整合ndk、pykF和pykA基因后，大腸桿菌的能量代謝和AMP、ADP、ATP的動(dòng)態(tài)調(diào)控得到進(jìn)一步優(yōu)化。ndk基因的整合增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)不同核苷酸之間的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移能力，有助于維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的平衡。pykF和pykA基因編碼的丙酮酸激酶同工酶的表達(dá)，提高了糖酵解過程中ATP的生成效率，為細(xì)胞提供了更多的ATP來源。這些基因的協(xié)同作用，使得細(xì)胞在合成L-組氨酸的過程中，能夠更好地調(diào)節(jié)能量代謝，提高ATP的供應(yīng)能力，從而促進(jìn)L-組氨酸的合成，提高其產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。四、實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料菌株：選用大腸桿菌MG1655作為出發(fā)菌株，該菌株遺傳背景清晰，是常用的基因工程宿主菌，具有生長(zhǎng)迅速、易于培養(yǎng)和操作等優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)粒：使用pUC19質(zhì)粒作為基礎(chǔ)載體，pUC19質(zhì)粒具有多克隆位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因等，便于基因的克隆和篩選；同時(shí)采用pCas9質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶Cas9核酸酶基因，用于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌基因組的精準(zhǔn)編輯。引物：根據(jù)purH、purA、purB、mazG、ushA、surE、yrfG、yjjG、amn、ygdH、apt、hpt、adk、ndk、pykF和pykA等基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物用于基因擴(kuò)增、基因敲除和基因整合等實(shí)驗(yàn)操作。引物由專業(yè)的生物公司合成，確保其序列準(zhǔn)確性和質(zhì)量穩(wěn)定性。儀器：主要儀器包括PCR擴(kuò)增儀，用于DNA片段的擴(kuò)增；高速冷凍離心機(jī)，用于細(xì)胞沉淀、DNA和蛋白質(zhì)的分離等；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶；恒溫培養(yǎng)箱，為大腸桿菌的培養(yǎng)提供適宜的溫度環(huán)境；發(fā)酵罐，用于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的各項(xiàng)參數(shù)。試劑：實(shí)驗(yàn)所需的試劑有DNA聚合酶，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)；限制性內(nèi)切酶，用于切割DNA片段；T4DNA連接酶，用于連接DNA片段；dNTPs，作為DNA合成的原料；瓊脂糖，用于制備瓊脂糖凝膠電泳的凝膠；氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素，用于篩選含有相應(yīng)抗性基因的菌株；以及各種緩沖液、酸堿試劑等，用于調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度和維持反應(yīng)環(huán)境的穩(wěn)定。溶液：常用的溶液有LB液體培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)；SOC培養(yǎng)基，用于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)蘇和轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)；TE緩沖液，用于溶解和保存DNA；以及各種用于DNA提取、純化和質(zhì)粒構(gòu)建的溶液，如裂解液、洗滌液、洗脫液等。抗生素：氨芐青霉素和卡那霉素，氨芐青霉素用于篩選含有pUC19質(zhì)粒的菌株，卡那霉素用于篩選含有pCas9質(zhì)粒的菌株，確保實(shí)驗(yàn)中菌株的遺傳穩(wěn)定性和篩選的準(zhǔn)確性。培養(yǎng)基：除了上述的LB液體培養(yǎng)基和SOC培養(yǎng)基外，還包括LB固體培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的平板培養(yǎng)和單菌落的分離；M9培養(yǎng)基，作為基本培養(yǎng)基，用于研究大腸桿菌在不同營(yíng)養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和代謝情況，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加不同的碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)成分。4.2實(shí)驗(yàn)方法質(zhì)粒提取：采用堿裂解法提取質(zhì)粒。將含有目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取適量菌液，12000rpm離心1分鐘，收集菌體沉淀。加入適量的SolutionI（含葡萄糖、EDTA和Tris-HCl）重懸菌體，充分振蕩使菌體均勻分散。加入等體積的SolutionII（含SDS和NaOH），輕輕顛倒混勻，使菌體裂解，溶液變澄清。再加入等體積的SolutionIII（含醋酸鉀和冰醋酸），輕輕顛倒混勻，冰浴10分鐘，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀。12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心10分鐘，收集DNA沉淀。用70%乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干DNA沉淀后，用適量的TE緩沖液溶解。DNA純化回收：使用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，然后利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將含有目標(biāo)DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放入離心管中。加入適量的溶膠液，65℃水浴加熱，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入適量的洗滌液，12000rpm離心1分鐘，棄濾液，重復(fù)洗滌一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2分鐘，去除殘留的洗滌液。向吸附柱中加入適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即得到純化回收的DNA片段。大腸桿菌基因組提取：采用試劑盒法提取大腸桿菌基因組。將大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取適量菌液，12000rpm離心1分鐘，收集菌體沉淀。加入適量的裂解液，振蕩混勻，使菌體裂解。加入適量的蛋白酶K，56℃水浴孵育1小時(shí)，使蛋白質(zhì)充分降解。加入適量的結(jié)合液，振蕩混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入適量的洗滌液，12000rpm離心1分鐘，棄濾液，重復(fù)洗滌兩次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2分鐘，去除殘留的洗滌液。向吸附柱中加入適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即得到大腸桿菌基因組DNA。大腸桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞制備及化學(xué)轉(zhuǎn)化：將大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。將菌液轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻10分鐘，然后4℃、5000rpm離心10分鐘，收集菌體沉淀。用預(yù)冷的0.1MCaCl?溶液重懸菌體沉淀，冰浴30分鐘。4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清，再用適量的預(yù)冷0.1MCaCl?溶液重懸菌體沉淀，加入終濃度為15%的甘油，分裝到無菌離心管中，-80℃保存?zhèn)溆茫吹玫交瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞。取適量的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化后，加入適量的質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30分鐘。42℃水浴熱激90秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2分鐘。加入適量的SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使菌體復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，篩選轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌電轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞制備及化學(xué)轉(zhuǎn)化：將大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。將菌液轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻10分鐘，然后4℃、5000rpm離心10分鐘，收集菌體沉淀。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清。最后用適量的預(yù)冷10%甘油重懸菌體沉淀，分裝到無菌離心管中，-80℃保存?zhèn)溆茫吹玫诫娹D(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞。取適量的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴融化后，加入適量的質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)化儀中，設(shè)置合適的電壓、電容和電阻等參數(shù)，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后，迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入適量的SOC培養(yǎng)基，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使菌體復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，篩選轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增：在PCR反應(yīng)管中依次加入適量的模板DNA、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液，總體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定。將PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55-65℃退火30秒（根據(jù)引物的Tm值調(diào)整退火溫度），72℃延伸30-60秒（根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間），共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取適量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳：配制合適濃度的瓊脂糖凝膠，一般為0.8%-2%，具體濃度根據(jù)DNA片段的大小確定。將瓊脂糖加入到適量的電泳緩沖液（如TAE或TBE緩沖液）中，加熱溶解，冷卻至50-60℃后，加入適量的核酸染料（如EB或GoldView），混勻后倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固。將凝固后的凝膠放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液，使凝膠完全浸沒在緩沖液中。取適量的PCR產(chǎn)物或DNA樣品，與適量的上樣緩沖液混合，然后加入到凝膠的加樣孔中。接通電源，根據(jù)DNA片段的大小設(shè)置合適的電壓，一般為80-120V，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并拍照記錄DNA條帶的位置和亮度。質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將目的基因片段與載體質(zhì)粒進(jìn)行連接。首先，用限制性內(nèi)切酶分別切割目的基因片段和載體質(zhì)粒，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端或平末端。然后，將切割后的目的基因片段和載體質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，反應(yīng)體系中包含適量的目的基因片段、載體質(zhì)粒、T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。CRISPR/Cas9基因編輯方法：設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)基因的sgRNA序列，將其克隆到含有Cas9核酸酶基因的pCas9質(zhì)粒中，構(gòu)建成CRISPR/Cas9基因編輯質(zhì)粒。將構(gòu)建好的基因編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選含有基因編輯質(zhì)粒的菌株。在菌株培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)Cas9核酸酶和sgRNA的表達(dá)，sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶識(shí)別并切割目標(biāo)基因序列，造成雙鏈斷裂。細(xì)胞通過同源重組或非同源末端連接的方式修復(fù)斷裂的DNA，實(shí)現(xiàn)基因的敲除、插入或替換等編輯操作。通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證基因編輯的效果。發(fā)酵過程參數(shù)檢測(cè)：在發(fā)酵過程中，定期檢測(cè)發(fā)酵液的pH值、OD600（用于監(jiān)測(cè)菌體濃度）、溶解氧、葡萄糖濃度和L-組氨酸含量等參數(shù)。pH值使用pH電極進(jìn)行檢測(cè)；OD600使用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定；溶解氧通過溶解氧電極進(jìn)行監(jiān)測(cè)；葡萄糖濃度采用葡萄糖氧化酶法或高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定；L-組氨酸含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。通過對(duì)這些參數(shù)的監(jiān)測(cè)，了解發(fā)酵過程中菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝情況，為優(yōu)化發(fā)酵條件提供依據(jù)。L-組氨酸工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件：將構(gòu)建好的L-組氨酸工程菌接種到種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，使菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后將種子液以一定的接種量（一般為1%-5%）接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、200-300rpm的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過程中，根據(jù)需要補(bǔ)充碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)成分，維持發(fā)酵液的pH值在合適的范圍內(nèi)（一般為6.5-7.5），通過控制通氣量和攪拌速度維持溶解氧在一定水平（一般為30%-50%飽和度）。定期取樣檢測(cè)發(fā)酵液中的各項(xiàng)參數(shù)，觀察菌體的生長(zhǎng)和L-組氨酸的合成情況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.1搖瓶培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化首先對(duì)不同的搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，選用了LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基以及一種自行設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基（命名為Z培養(yǎng)基）。將大腸桿菌接種到不同培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)48h，定期測(cè)定菌體濃度（OD600）和L-組氨酸含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在LB培養(yǎng)基中，大腸桿菌生長(zhǎng)迅速，在培養(yǎng)24h時(shí)OD600達(dá)到了2.5，但L-組氨酸產(chǎn)量較低，僅為0.5g/L。M9培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)相對(duì)較慢，48h時(shí)OD600為1.8，L-組氨酸產(chǎn)量為0.7g/L。TB培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)情況較好，48h時(shí)OD600達(dá)到2.2，L-組氨酸產(chǎn)量為0.8g/L。而在Z培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)良好，48h時(shí)OD600達(dá)到2.3，L-組氨酸產(chǎn)量最高，為1.0g/L。由此可見，Z培養(yǎng)基更適合大腸桿菌生長(zhǎng)和L-組氨酸的合成，因此選擇Z培養(yǎng)基作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在確定Z培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。采用單因素實(shí)驗(yàn)法，分別考察了碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖）、氮源（酵母粉、蛋白胨、硫酸銨）、無機(jī)鹽（硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣）的種類和濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)和L-組氨酸合成的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)碳源為葡萄糖，濃度為30g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)和L-組氨酸產(chǎn)量最佳；氮源為酵母粉，濃度為10g/L時(shí)效果最好；無機(jī)鹽中，硫酸鎂濃度為1.5g/L、磷酸二氫鉀濃度為2.0g/L、氯化鈣濃度為0.5g/L時(shí)，有利于L-組氨酸的合成。進(jìn)一步通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分進(jìn)行驗(yàn)證和微調(diào)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、硫酸鎂1.5g/L、磷酸二氫鉀2.0g/L、氯化鈣0.5g/L時(shí)，大腸桿菌在搖瓶發(fā)酵48h后，L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到了1.3g/L，相較于優(yōu)化前提高了30%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為后續(xù)增強(qiáng)ATP供應(yīng)策略的實(shí)施提供了良好的基礎(chǔ)，有利于更準(zhǔn)確地評(píng)估各基因工程改造對(duì)大腸桿菌合成L-組氨酸的影響。5.2增強(qiáng)ATP供應(yīng)策略的效果驗(yàn)證通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將purH基因整合到大腸桿菌基因組中，構(gòu)建重組菌株。對(duì)重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，同時(shí)以未整合purH基因的原始菌株作為對(duì)照。發(fā)酵過程中，定期檢測(cè)菌體濃度、L-組氨酸產(chǎn)量和ATP含量。結(jié)果顯示，整合purH基因的重組菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.5g/L，而原始菌株產(chǎn)量為1.0g/L；重組菌株的ATP含量為2.5μmol/gDCW（每克干細(xì)胞重中ATP的含量），原始菌株為1.8μmol/gDCW。這表明整合purH基因增強(qiáng)了AMP合成途徑，提高了ATP供應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了L-組氨酸的合成。在已整合purH基因的菌株基礎(chǔ)上，進(jìn)一步整合purA和purB基因。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，整合purA和purB基因后的菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量提高到1.8g/L，ATP含量增加至3.0μmol/gDCW。與僅整合purH基因的菌株相比，L-組氨酸產(chǎn)量提高了20%，ATP含量提高了20%，說明整合purA和purB基因進(jìn)一步增強(qiáng)了AMP合成途徑，提升了ATP供應(yīng)，對(duì)L-組氨酸合成有顯著的促進(jìn)作用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除mazG基因，阻斷ATP分解途徑。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示，敲除mazG基因的菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量為1.6g/L，ATP含量為3.2μmol/gDCW，而野生型菌株L-組氨酸產(chǎn)量為1.0g/L，ATP含量為1.8μmol/gDCW。敲除mazG基因有效地減少了ATP的分解，提高了細(xì)胞內(nèi)ATP濃度，促進(jìn)了L-組氨酸的合成。同時(shí)敲除ushA、surE、yrfG和yjjG基因，以降低前體物IMP和AMP的消耗。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，多基因敲除菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.7g/L，ATP含量為3.3μmol/gDCW，相比未敲除這些基因的菌株，L-組氨酸產(chǎn)量提高了41.67%，ATP含量提高了45.83%，證明敲除這些基因減少了前體物的消耗，有利于更多的前體物用于ATP合成，從而促進(jìn)L-組氨酸的合成。敲除amn和ygdH基因阻斷AMP分解途徑，搖瓶發(fā)酵48h后，菌株的L-組氨酸產(chǎn)量為1.75g/L，ATP含量為3.4μmol/gDCW，與對(duì)照菌株相比，L-組氨酸產(chǎn)量提高了45.83%，ATP含量提高了50%，表明阻斷AMP分解途徑能夠提高細(xì)胞內(nèi)AMP水平，進(jìn)而促進(jìn)ATP合成，有利于L-組氨酸的合成。敲除apt和hpt基因進(jìn)一步阻斷AMP分解途徑，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，敲除apt和hpt基因的菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.85g/L，ATP含量為3.5μmol/gDCW，與未敲除這兩個(gè)基因的菌株相比，L-組氨酸產(chǎn)量提高了54.17%，ATP含量提高了52.78%，說明敲除apt和hpt基因進(jìn)一步阻斷AMP分解途徑，對(duì)提高ATP供應(yīng)和L-組氨酸合成具有積極作用。構(gòu)建了攜帶不同表達(dá)強(qiáng)度adk基因的重組菌株，通過搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證其對(duì)AMP、ADP和ATP間動(dòng)態(tài)調(diào)控的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)adk基因表達(dá)強(qiáng)度適中時(shí)，菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到2.0g/L，ATP含量為3.8μmol/gDCW。而adk基因表達(dá)強(qiáng)度過高或過低時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量和ATP含量均有所下降，表明適中的adk基因表達(dá)強(qiáng)度能夠有效優(yōu)化AMP、ADP和ATP間的動(dòng)態(tài)調(diào)控，促進(jìn)L-組氨酸的合成。整合ndk、pykF和pykA基因后，搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，重組菌株在發(fā)酵48h時(shí)，L-組氨酸產(chǎn)量提高到2.2g/L，ATP含量為4.0μmol/gDCW，與未整合這些基因的菌株相比，L-組氨酸產(chǎn)量提高了83.33%，ATP含量提高了77.78%。這說明整合ndk、pykF和pykA基因進(jìn)一步優(yōu)化了細(xì)胞的能量代謝和AMP、ADP、ATP的動(dòng)態(tài)調(diào)控，顯著提高了ATP供應(yīng)和L-組氨酸的合成能力。5.3結(jié)果分析與討論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了增強(qiáng)ATP供應(yīng)策略對(duì)大腸桿菌合成L-組氨酸的積極作用。從搖瓶培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化結(jié)果來看，合適的培養(yǎng)基成分能夠顯著影響大腸桿菌的生長(zhǎng)和L-組氨酸的合成。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為大腸桿菌提供了更適宜的營(yíng)養(yǎng)條件，為后續(xù)基因工程改造和代謝調(diào)控奠定了良好基礎(chǔ)。在增強(qiáng)ATP供應(yīng)的策略實(shí)施中，通過整合purH、purA和purB基因，增強(qiáng)了AMP合成途徑，使得ATP合成的前體物質(zhì)增加，從而提高了ATP的供應(yīng)能力，促進(jìn)了L-組氨酸的合成。阻斷ATP分解途徑（敲除mazG基因）以及降低前體物IMP和AMP的消耗（敲除ushA、surE、yrfG和yjjG基因）、阻斷AMP分解途徑（敲除amn和ygdH、apt和hpt基因），均有效地減少了ATP和前體物的浪費(fèi)，提高了細(xì)胞內(nèi)ATP和前體物的濃度，為L(zhǎng)-組氨酸的合成提供了更充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。優(yōu)化AMP、ADP和ATP間的動(dòng)態(tài)調(diào)控（整合不同表達(dá)強(qiáng)度的adk基因以及ndk、pykF和pykA基因），使細(xì)胞能夠更高效地調(diào)節(jié)能量代謝，及時(shí)滿足L-組氨酸合成過程中對(duì)ATP的需求，進(jìn)一步提高了L-組氨酸的合成能力。然而，本研究也存在一些問題。在基因工程改造過程中，雖然通過CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了基因的整合和敲除，但基因編輯的效率和穩(wěn)定性仍有待提高。部分基因編輯菌株在傳代過程中出現(xiàn)了基因丟失或突變的情況，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。此外，在發(fā)酵過程中，雖然通過優(yōu)化培養(yǎng)基和調(diào)控基因表達(dá)提高了L-組氨酸的產(chǎn)量，但發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物積累、菌體生長(zhǎng)后期代謝活力下降等問題仍然存在，可能會(huì)限制L-組氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。針對(duì)這些問題，未來的研究可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。一方面，進(jìn)一步優(yōu)化CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，提高基因編輯的效率和穩(wěn)定性，例如優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)、選擇更合適的Cas9核酸酶變體等。另一方面，深入研究大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)，通過系統(tǒng)生物學(xué)方法，全面分析基因編輯對(duì)細(xì)胞代謝的影響，尋找更多潛在的調(diào)控靶點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化代謝途徑，減少副產(chǎn)物積累，提高菌體生長(zhǎng)后期的代謝活力，從而實(shí)現(xiàn)L-組氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提升，為L(zhǎng)-組氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供更堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)支持。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論本研究圍繞增強(qiáng)ATP供應(yīng)以提高大腸桿菌合成L-組氨酸的能力展開，通過對(duì)L-組氨酸和ATP生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制的深入分析，設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列增強(qiáng)ATP供應(yīng)的策略，取得了以下主要研究成果：優(yōu)化培養(yǎng)基：通過對(duì)不同搖瓶培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化，確定了適合大腸桿菌生長(zhǎng)和L-組氨酸合成的Z培養(yǎng)基，并對(duì)其碳源、氮源和無機(jī)鹽等成分進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基使大腸桿菌在搖瓶發(fā)酵48h后，L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.3g/L，相較于優(yōu)化前提高了30%，為后續(xù)基因工程改造和代謝調(diào)控實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。增強(qiáng)ATP合成途徑：運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將purH、purA和purB基因整合到大腸桿菌基因組中，增強(qiáng)了AMP合成途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整合這些基因后，ATP供應(yīng)得到顯著提高，L-組氨酸產(chǎn)量也隨之增加。其中，整合purH基因的菌株L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.5g/L，進(jìn)一步整合purA和purB基因后，產(chǎn)量提高到1.8g/L，ATP含量也相應(yīng)增加，證明了增強(qiáng)AMP合成途徑對(duì)促進(jìn)L-組氨酸合成的有效性。阻斷支路代謝：敲除mazG基因阻斷ATP分解途徑，敲除ushA、surE、yrfG和yjjG基因降低前體物IMP和AMP的消耗，敲除amn和ygdH、apt和hpt基因阻斷AMP分解途徑。這些基因敲除操作均有效地減少了ATP和前體物的浪費(fèi)，提高了細(xì)胞內(nèi)ATP和前體物的濃度，從而促進(jìn)了L-組氨酸的合成。例如，敲除mazG基因的菌株L-組氨酸產(chǎn)量為1.6g/L，ATP含量為3.2μmol/gDCW；同時(shí)敲除ushA、surE、yrfG和yjjG基因的菌株L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.7g/L，ATP含量為3.3μmol/gDCW；敲除amn和ygdH基因的菌株L-組氨酸產(chǎn)量為1.75g/L，ATP含量為3.4μmol/gDCW；敲除apt和hpt基因的菌株L-組氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.85g/L，ATP含量為3.5μmol/gDCW。優(yōu)化能量動(dòng)態(tài)調(diào)控：通過整合不同表達(dá)強(qiáng)度的adk基因以及ndk、pykF和pykA基因，優(yōu)化了AMP、ADP和ATP間的動(dòng)態(tài)調(diào)控。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)adk基因表達(dá)強(qiáng)度適中時(shí)，菌株的L-組氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到2.0g/L，ATP含量為3.8μmol/gDCW。整合ndk、pykF和pykA基因后，菌株的L-組氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高到2.2g/L，ATP含量為4.0μmol/gDCW，表明優(yōu)化能量動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)提高ATP供應(yīng)和L-組氨酸合成具有顯著作用。6.2研究展望本研究雖然在增強(qiáng)ATP供應(yīng)提高大腸桿菌合成L-組氨酸方面取得了一定成果，但仍有許多可以進(jìn)一步探索和改進(jìn)的方向，未來的研究可以從以下幾個(gè)方面展開：優(yōu)化基因編輯技術(shù)：盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在本研究中得到了應(yīng)用，但基因編輯的效率和穩(wěn)定性仍有待提高。未來可以深入研究sgRNA的設(shè)計(jì)優(yōu)化、選擇更合適的Cas9核酸酶變體或開發(fā)新的基因編輯工具，以提高基因編輯的準(zhǔn)確性和效率，減少基因編輯過程中出現(xiàn)的基因丟失或突變等問題，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。深入解析代謝網(wǎng)絡(luò)：大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，L-組氨酸的合成受到多種因素的調(diào)控。未來可運(yùn)用