第7章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗氨基酸類藥物含量測定常用的方法1.酸堿滴定法示例1：谷氨酸的含量測定示例2：賴氨酸片中賴氨酸的測定2.非水溶液滴定法示例：酪氨酸的含量測定3.定氮法示例：天門酰氨片的含量測定第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗賴氨酸片中賴氨酸的測定中1)為什么要用NaOH調節pH為7.0？2）加入甲醛溶液的作用？3）是直接滴定還是其他的滴定方式？第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗非水溶液滴定法非水溶液滴定法是在非水溶劑中進行滴定的方法。主要用來測定有機堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽或有機酸鹽，以及有機酸堿金屬鹽類藥物的含量。也用于測定某些有機弱酸的含量。

非水溶劑的種類

(1)酸性溶劑

有機弱堿在酸性溶劑中可顯著地增強其相對堿度，最常用的酸性溶劑為冰醋酸。

(2)堿性溶劑

有機弱酸在堿性溶劑中可顯著地增強其相對酸度，最常用的堿性溶劑為二甲基甲酰胺。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗定氮法樣品與濃硫酸共熱,含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗4.碘量法或溴量法示例一：鹽酸半胱氨酸水合物的測定示例一：L-胱氨酸的測定5.HPLC法示例一：三氨基酸注射液-341示例二：六氨基酸注射液4006.氨基酸自動分析儀第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗碘量法原理：半胱氨酸分子中含有－SH，在酸性條件下，與過量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸鈉溶液滴定。由硫代硫酸鈉溶液所消耗的量，間接求出硫化物的含量。注意：滴定條件，指示劑，碘滴定液，Na2S2O3標液配制第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

碘量法的背景知識(一)方法簡介碘量法也是常用的氧化還原滴定方法之一。它是以I2的氧化性和I-的還原性為基礎的滴定分析法。因此，碘量法的基本反應是由E?可知I2是一種較弱的氧化劑，能與較強的還原劑作用；而I-是一種中等強度的還原劑，能與許多氧化劑作用，因此碘量法又可以用直接的和間接的兩種方式進行滴定。

1、碘滴定法(也稱直接碘量法)

電位比E?I2/I—低的還原性物質，可以直接用I2的標準溶液滴定的并不多，只限于較強的還原劑，如：S2-、SO32-、Sn2+、S2O32-、AsO32-、SbO33-等。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗剩余碘量法在供試品中先加入一定量、過量的碘滴定液，待I2與測定組分反應完全后，再用硫代硫酸鈉滴定液滴定剩余的碘，根據與藥物作用的碘的量來計算藥物含量的方法。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

2、滴定碘法(間接碘量法)

電位比E?I2/I—高的氧化性物質，可在一定的條件下，用碘離子來還原，產生相當量的碘，然后用Na2S2O3標準溶液來滴定析出的I2，這種方法叫做間接碘量法或稱為滴定碘法。例如K2Cr2O7在酸性镕液中與過量的KI作用，析出的I2用Na2S2O3標準溶液滴定。

Cr2O72-+6I-+14H+＝2Cr3++3I2+7H2OI2+2S2O32—＝2I-+S4O62—利用這一方法可以測定很多氧化性物質,如ClO3-、ClO-、CrO42-、IO3-、BrO3-、SbO43-、MnO4-、MnO2

、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等，以及能與CrO42-生成沉淀的陽離子，如Pb2+、Ba2+等，所以滴定碘法的應用范圍相當廣泛。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

碘量法常用淀粉作指示劑，淀粉與碘作用形成藍色絡合物，靈敏度很高，即使在5×10—6mol/L溶液中亦能看出。淀粉指示劑應在近終點時加入，因為當溶液中有大量碘存在時，碘可被吸附在淀粉表面，影響終點的正確判斷。

碘滴定液(0.1mol/L)I2=253.8112.69g→1000ml【配制】取碘13.0g,加碘化鉀36g與水50ml溶解后，加鹽酸3滴與水適量使成1000ml，搖勻，用垂熔玻璃濾器濾過。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

碘量法的主要誤差來源，一是I2易揮發，二是I-易被空氣中的氧所氧化。為防止I2揮發，應采取以下措施：

1.加入過量KI，KI與I2形成I3—，以增大I2的溶解度，降低I2的揮發性，提高淀粉指示劑的靈敏度。此外，加入過量的KI，可以加快反應的速度和提高反應的完全程度。

2.反應時溶液的溫度不能高，一般在室溫下進行。因升高溫度增大I2的揮發性，降低淀粉指示劑的靈敏度。保存Na2S2O3溶液時，室溫升高，加速Na2S2O3的分解。

3.析出碘的反應最好在帶塞的碘量瓶中進行，滴定切勿劇烈搖動。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

為防止I-被空氣中的氧所氧化，應采取以下措施：

1.避光光線能催化I—被空氣氧化。

2.溶液pH值的影響S2O32—與I2之間的反應必須在中性或弱酸性溶液中進行。因為在堿性溶液中，I2與S2O32—將會發生下述副反應：

S2O32—+4I2+10OH—＝2SO42—+8I—十5H2O

而且，I2在堿性溶液中還會發生歧化反應：

3I2+6OH—＝IO3—+5I—+3H2O

如果在強酸性溶液中，Na2S2O3溶液會發生分解：S2O32—+2H+＝SO2+S↓+H2O

同時，I—在酸性溶液中也容易被空氣中的O2氧化：

4I—+4H++O2=2I2+2H2O第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗3.在間接碘量法中，當析出碘的反應完成后，應立即用Na2S2O3進行滴定(避免I2的揮發和I—被空氣氧化)。（二）應用實例1.銅礦石中銅的測定礦石經HCl、HNO3、溴水和尿素處理成溶液后、用NH4HF2掩蔽試樣中的Fe3+，使其形成穩定的FeF63-絡合物，并調節溶液的pH為3.5—4.0，加入KI與Cu2+反應，析出的I2，用Na2S2O3標準溶液滴定，以淀粉為指示劑，反應式如下：

2Cu2++4I—＝2CuI↓+I2I2十2S2O32—＝2I—+S4O62—

本法可測定礦石中0.5%以上的銅。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

2.鋇鹽中鋇的測定在HAc-NaAc緩沖溶液中，CrO42—能將Ba2+沉淀為BaCrO4。沉淀經過濾、洗滌后，用稀HCl溶解，加入過量KI，Cr2O72—將I—氧化為I2，析出的I2，以淀粉為指示劑用Na2S2O3標準溶液滴定。反應式如下：

Ba2++CrO42—＝BaCrO4↓(黃)2BaCrO4+4H+＝2Ba2++H2Cr2O7+H2OCr2O72—+6I—+14H+＝3I2+2Cr3++7H2OI2+2S2O32—＝2I—+S4O62—第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗HPLC（高效液相色譜）柱的類型：檢測器類型：固定相：流動相：第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗氨基酸自動分析儀

一種專門用來分析氨基酸的自動化的液相色譜儀。原理：蛋白質經鹽酸水解成為游離氨基酸，經氨基酸分析儀的離子交換柱分離，與茚三酮溶液產生顏色反應，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。一份水解液可同時測定天冬，蘇，絲，精氨酸等16種氨基酸。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗多肽類藥品檢測1.酸堿滴定法2.紫外分光光度法3.效價測定法（略）示例一：抑肽酶效價的測定示例二：桿菌肽效價的測定第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗蛋白質類藥品的檢驗定氮法電泳法（重點介紹）生物檢定法第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現象。醋酸纖維素薄膜電泳：以醋酸纖維薄膜為支持物。它是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經乙?；瞥?。它溶于丙酮等有機溶液中，即可涂布成均一細密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm為宜。特點：操作簡單、靈敏度高，樣品用量少。電泳時間短，一般電泳45—60min即可，加上染色，脫色，整個電泳完成僅需90min左右。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗醋酸纖維素薄膜電泳分離蛋白第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗效價單位U效價:指某一物質引起生物反應的功效單位,可用理化方法檢測,也可用生物檢測方法測定，通常以重量單位或效價單位來計量。不同的藥物有各自的效價的定義。某些生化藥物，其藥物中含有一些雜質，不可能是純品。故不能以重量單位準確表示其含量，只能依靠生物檢定的方法與標準品進行比較來測定藥物的效價劑量。因此，采用特定的“單位”——“U”來計量。產生相同效應藥品的劑量比較時，所需劑量越小，藥物的效價就越高，反之效價就低。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗臨床上常見到的以效價單位計量的藥物有生物制劑如蛋白質類、酶制劑、激素、維生素及部分抗生素類藥。這些藥物依中國藥典規定，均以其特有的藥理效價表示劑量。肝素的效價是以每毫克肝素制劑(60℃2mmHg柱真空干燥3小時)所相當的單位數來表示。1U為24h內在冷處阻止1ml貓血凝結所需的最低肝素量。在制藥工業的發展過程中，隨著制藥工藝的提高，藥物的純度也逐年提高，其生物效價亦隨之愈來愈高。該藥研制初期的生物效價，每1.0mg效價相當于125U,1977版中國藥典規定肝素鈉每1.0mg效價不得少于140U，而1995版藥典則定為每1.0mg效價不得少于150U，2005年為不少于156U，2010年版改為不得少于170U。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酶類藥品檢驗

---酶活力測定法

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酶活力概念

酶活力是酶促反應的能力。酶活力大小就是指在一定條件所催化的某一化學反應速度的快慢，即酶催化的反應速度越快，酶活力越高，反之則表示該酶活力低。但是，酶的定量并非對其蛋白質進行定量，而是對它的催化能力進行定量。所以，酶的定量就是測定酶的活力，也即測定酶促反應的速度。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗一.酶活力的測定：（一）酶活力測定的基本知識：酶不易制成純品，其中含有很多雜質，真正的含酶量并不多。所以酶制劑中酶的含量都用酶活力來表示。

酶活力是通過測定酶促反應過程中單位時間內底物的減少量或產物的生成量，即測定酶促反應的速率來獲得的。一般情況下，產物和底物的改變量是一致的，但測定產物的生成要比測定底物的減少為好，這是由于反應體系中使用的底物往往是過量的，而反應時間通常又很短，尤其是在酶活力很低時，底物減少量僅占加入量的很小比例，因此測定不易準確；反之，產物從無到有(如不純的酶制劑中內源性產物不計的話)，只要測定方法靈敏，準確度可以很高，故酶活力測定絕大多數是采用測定產物生成速率的方法。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

測定酶活力時通常都附有適當的對照(control)以消除非酶促反應所生成的產物，常用的對照有以下幾種，可根據具體情況予以選擇。

1.樣品對照若測定酶活力的樣品是粗提取液，屬于非常不純的酶制劑，往往含有所欲測定的產物，也可能在保溫時由于內源性底物的旁反應產生相同的產物，這些可通過不加底物單加樣品的樣品對照予以消除。

2.底物對照某些酶的底物能自發(非酶促)地分解成所欲測定的產物，可以通過不加樣品單加底物的底物對照予以消除。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗3.時間對照若酶制劑不純(含有產物)和底物自發分解的情況并存，則必須做一個酶和底物都加入但反應時間為零的對照，也即先用蛋白沉淀劑或其它試劑停止反應，再加入底物。在雙底物反應時，對照管可以加入酶制劑和兩種底物中的一種，因缺乏另一種底物，不可能生成產物，至于應加入兩種底物中的哪一種可以根據預實驗決定。測定管中的產物量必須減去對照管中的產物才是真正由酶促反應所生成的產物量。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗（二）酶活力測定的方法：酶活力測定要符合兩個原則：①在零級反應期測定，即-〔s〕或〔p〕與反應時間t成正比，②反應速度與酶量成線性關系，即

〔E〕=k(-〔s〕/t)=k〔p〕/t

常用的方法有：

1.定時法

2.連續檢測法

3.平衡法

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗如何測定酶活力？以產物濃度對反應時間作圖，可得到酶促反應速度曲線0產物濃度時間注意：初速度的測定是關鍵。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗可見，反應速度只在最初一段時間內保持恒定，隨著時間的延長，反應速度逐漸下降產物濃度時間0原因底物濃度的降低、產物的增加造成的逆反應的加快產物的抑制作用酶本身逐漸失活第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗1.定時法:

測定酶反應開始后某一時間內(t1到t2)產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法稱為定時法。因t1和t2是整個反應歷程的兩個點，故又稱兩點法，其中t1一般取反應開始的時間，在酶反應進行一定時間(t2)后終止反應，如加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等，然后測定底物或產物的變化。這種方法的優點是簡單，因最后測定產物時酶反應已被終止，故比色池無需保溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活力的影響。缺點是如果不用預試驗確定，無法了解酶作用的這段時間內是否都是零級反應，故很難保證測定結果的真實性。因此，用定時法測定酶活力時，應先做預試驗來確定線性時間，并在線性時間內進行測定，否則，不能用〔p〕除以t來表示每分鐘產生的〔p〕，并用其計算酶活力單位。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗2.連續監測法:

連續測定(每15s-1min監測一次)酶反應過程中某一反應產物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應初速度的方法稱為連續監測法，又稱動力學法或速率法。定時法只測定兩個時間點，而連續監測法則進行多點連續測定。這種方法的優點是可將多點的測定結果(〔s〕或〔p〕的變化)連接成線，容易找到成直線的區段，可以觀察到是否偏離零級反應，因而可選擇線性反應期來計算酶活力，不需要終止反應。也可在反應曲線的拐點處求出其切線的斜率，即初速度。連續監測法測定的結果通常較定時法高，也較為準確，因為前者測定時間較短，而在酶反應的初始階段底物最充裕，而產物的抑制作用、可逆反應、酶的變性作用等均很小。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

用連續監測法測定的缺點是因酶和底物邊保溫邊測定的需要，儀器(比色計或分光光度計)必須有保溫裝置，而且產物(或底物)應是可被直接測定的化合物，且借以測定的特殊性質，必須與底物(或產物)有明顯差別，否則，需加入其它試劑(如顯色劑、酶試劑等)，將其轉變成可測物質，但必須專慮到加入的酶試劑或顯色劑對待測酶是否有影響。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗3.平衡法:

通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法稱為平衡法，或稱終點法。因定時法是在酶反應的動態期進行測定，故需終止反應后才能測定，而平衡法則無需，因在平衡期中任何一點進行測定，底物和產物的量都不再變化。用平衡法測定時，因產物的增加或底物的減少與反應時間不成線性，故不能把〔p〕或〔s〕的總變化量除以t來代表每分鐘產物或底物的變化。另外，平衡法也會受到產物抑制、可逆反應等因素的影響，由于反應時間較定時法更長，故這種影響會更大，測定結果也較連續監測法低，不能代表初速度，也不是零級反應的速度。但是與定時法相同，只要待測標本與正常標本在相同條件下反應并測定，亦能以此判斷出待測標本酶活力的相對大小。而且，對于有些零級反應期很短的酶促反應，用連續監測法和定時法很難測出其初速度，也只得采用平衡法測定。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗(三)酶活力的表示方法:

酶活力的大小是以酶單位數表示的。所謂酶單位是在某一特定條件下，使酶反應達到某一速度所需要的酶量，而速度即指單位時間(秒、分、小時)內反應物的變化量(毫克、微克、微摩爾、摩爾等)。酶單位一般有三種表示方法。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗1.慣用單位:60年代前，各種酶活力的表示法或酶單位的定義沒有統一的標準，不同酶、甚至同一種酶不同的測定法可有不同的定義。這種單位簡單方便，省去了許多計算；但只能進行酶活力的相對比較。

酶習慣上或測定時使用的反應速度的單位定義為酶的活力單位。有的甚至直接用測得的物理量，如單位時間內消光值的變化(DA/t)表示酶活力單位。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗2.國際單位:1961年國際生化學會(IUB)酶學委員會建議使用統一的國際單位(IU)。規定一個國際單位(IU)為在實驗規定的條件下(如溫度為25℃、最適pH、最適底物濃度時)，每分鐘催化一個微摩爾底物變化所需要的酶量。酶的濃度可以IU/L或IU/mL來表示；當底物為蛋白質、多糖等含有多個能被酶作用的鍵或基團時，可用催化一個微摩爾被作用的基團或鍵的變化來表示酶單位。如采用物理方法測定，應該在物理量與化學量之間建立對應關系進行換算。

第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

國際單位的應用有利于比較同一樣品中不同酶的活力。但也有不少缺點，如：①從慣用單位換算成國際單位比較麻煩；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白酶等)，采用底物減少法來定量時，無法計算其底物減少的微摩爾數；③同一種酶用不同的方法測定，換算成國際單位時，其結果仍不相同。歐美各國由于地理條件及實驗室內溫度的不同，常采用不同的測定溫度，如25℃、30℃、37℃等，這也導致即使用國際單位表示酶活力，其正常參考范圍也是不同的。3.katal單位

1972年酶學委員會又提出一種新的酶單位katal(簡稱kat)，即在確定的最適反應條件下每秒鐘催化一摩爾底物變化所需要的酶量為1kat單位。1kat=60×106IU1nkat=0.06IU1IU=16.67nkat第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數比活力是酶制劑純度的常用指標——比活力越大，表示酶越純比活力＝酶活力單位數（U）酶蛋白質量（mg）酶的比活力第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酶的純度

純化倍數

=每次比活力/第一次比活力產率(回收率)=每次總活力/第一次總活力×100%

示例：從某細胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質，總活力為360單位。經過一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，總活力為288單位。請問回收率是多少？純化了多少倍？第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酶活力測定的方法有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。終止反應法：是在恒溫反應系統中，每隔一定時間，取出一定體積的反應液，用強酸強堿或SDS以及加熱等使反應立即停止，然后用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。連續反應法：無須終止反應，而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況，對記錄結果進行分析，然后計算出酶活力。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酶活力測定的步驟配制底物、對照品溶液、供試品酶溶液等。確定酶催化反應的溫度、pH、濃度、輔助因子等反應條件。進行酶促反應，準確記錄反應時間。終點法（終止反應）、連續法測定產物的增量。常見的測定方法有分光光度法、熒光法、化學反應法等。計算酶活力。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

學習Folin-酚法測定蛋白酶活力的原理方法掌握分光光度計的操作方法【目的要求】實驗枯草芽孢桿菌蛋白酶活力的測定第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗【重點掌握】

蛋白酶浸提、分離、提取技術最適條件下酶促水解反應的操作程序酶活力的測定及活力單位的計算第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗【重點掌握】測定酶活的程序1、將酶液稀釋到一定程度2、最適條件下進行酶促水解反應3、測定反應量4、根據酶活單位定義計算酶活力第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗【重點掌握】1、將酶液稀釋到一定程度在底物濃度一定，反應時間一定內維持初速度，必須調整酶的最適稀釋倍數即吸光度限制在0.25～0.40范圍內。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗【重點掌握】2、最適條件下進行酶促水解反應最適溫度

—37℃恒溫水浴最適pH值

—pH7.5緩沖溶液底物濃度足夠大

—1%酪蛋白溶液1mL反應時間準確

—10min及時滅活

—三氯乙酸

2mL第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗【重點掌握】3、測定反應量測定產物的增加量或底物的減少量

—

測定酪氨酸的生成量

4、根據酶活單位定義計算酶活力酶活單位定義：在上述條件下，1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位。第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗酪蛋白蛋白酶酪氨酸比色測定鉬藍鎢藍酪氨酸Folin-酚試劑【實驗原理】pH值、溫度OH-第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗

1）用一系列濃度不同的酪氨酸標準液與Folin-酚試劑作用，產生蘭色深淺不同的溶液，680nm波長處，作出酪氨酸濃度-吸光度標準曲線。

2）用酶促水解液進行同樣操作，比色后，查閱標準曲線，即可求得待測酶活力。操作程序第07章氨基酸、多肽、蛋白質和酶類藥品檢驗1、取6支干燥試管，編號，按教材表格順序加入試劑；

2、混勻器充分混勻后，置37℃恒溫水浴反應20min；

3、以0#管做參比，分別比色測定各管A680；