ICS65.020.01CCSB3132CodeofpracticeofstemcellsfromDendrobiumOfficinaleIDB32/TXXXX—XXXX 錯(cuò)誤！未定義書簽。 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 13.1鐵皮石斛干細(xì)胞 4生產(chǎn)條件 5種源干細(xì)胞獲取、篩選與增殖 15.1培養(yǎng)基配制 15.2種源干細(xì)胞獲取 25.3篩選與純化 25.4種源干細(xì)胞增殖 26培育生產(chǎn) 26.1增殖培養(yǎng)基配制 26.2培育操作 27擴(kuò)大生產(chǎn) 37.1接種 3 38采收 38.1采收標(biāo)準(zhǔn) 38.2采收方法 38.3質(zhì)量等級(jí)劃分 39生產(chǎn)記錄 3DB32/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本文件由江蘇省園藝標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、蘇州普朗特爾皮膚細(xì)胞科技有限公司、西交利物浦大學(xué)、蘇州珀立科技服務(wù)有限公司、思格（蘇州）生物科技有限公司、蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院。本文件主要起草人：陳小龍、張杰、吳紅升、余向陽、宋立曉、周燕群、王牧、任寶永、李毅、覃鴻妮。DB32/TXXXX—XXXX1鐵皮石斛干細(xì)胞生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了鐵皮石斛干細(xì)胞室內(nèi)培育的生產(chǎn)條件、種源干細(xì)胞獲取、篩選與增殖、培育生產(chǎn)、擴(kuò)大生產(chǎn)、日常管理、采收和生產(chǎn)記錄。本文件適用于鐵皮石斛干細(xì)胞室內(nèi)培育生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T2306—2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1鐵皮石斛干細(xì)胞StemcellsofDendrobiumOfficinale從鐵皮石斛莖尖離體培養(yǎng)愈傷組織，經(jīng)培育，獲得的迅速穩(wěn)定增殖的植物干細(xì)胞。4生產(chǎn)條件室內(nèi)環(huán)境潔凈度應(yīng)達(dá)到十萬級(jí)以上，溫度25℃~28℃,光照強(qiáng)度1800Lux~2000Lux（增殖階段為完全黑暗），濕度40%~70%。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749，過濾水應(yīng)符合GB/T6682。5種源干細(xì)胞獲取、篩選與增殖5.1培養(yǎng)基配制5.1.1誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基采用1/2MS+2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂進(jìn)行種源干細(xì)胞的固體培養(yǎng)。5.1.2種源干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基DB32/TXXXX—XXXX2采用1/2MS+1mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂進(jìn)行固體培養(yǎng)增殖。5.2種源干細(xì)胞獲取5.2.1材料選取應(yīng)選取良種鐵皮石斛植物體莖尖端5mm的組織。5.2.2消毒用0.1%升汞消毒。5.2.3組織切碎將尖端組織切成0.1毫米的碎塊，使植物靜止中心組織暴露。5.2.4愈傷組織培養(yǎng)將上述組織碎塊置于愈傷組織誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基（MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1.0mg/LNAA+0.8mg/L6-BA+25g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂,pH值5.8）中，25℃~26℃黑暗條件下培養(yǎng)21d~28d，獲得愈傷組織。5.2.5愈傷組織細(xì)胞增殖在相同固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下增殖愈傷組織細(xì)胞。5.3篩選與純化5.3.1清理愈傷組織細(xì)胞增殖后，每10d將死亡的、褐化的以及玻璃化的愈傷組織清理出培養(yǎng)體系。5.3.2篩選篩選留存淡黃色或淡綠色、生長茁壯、均一的種源干細(xì)胞，用于進(jìn)一步培養(yǎng)。經(jīng)過20代培養(yǎng)后，逐漸篩選到干細(xì)胞。5.4種源干細(xì)胞增殖按照鮮重0.2g~0.3g/cm2接種量，將種源干細(xì)胞轉(zhuǎn)接至500mL玻璃瓶中進(jìn)行固體培養(yǎng)。在溫度26℃~28℃環(huán)境下，光照強(qiáng)度為800Lux~1000Lux，每天光照8小時(shí)，黑暗培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)過程中，每21~28天更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期為50d~55d。6培育生產(chǎn)6.1增殖培養(yǎng)基配制采用1/2MS培養(yǎng)基+1mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂固體培養(yǎng)基+10g/L馬鈴薯提取物進(jìn)行種源干細(xì)胞繼代培養(yǎng)。6.2培育操作DB32/TXXXX—XXXX3操作條件與5.4相同，按0.4g/L~0.5g/L接種量，將種源干細(xì)胞轉(zhuǎn)接至1L玻璃瓶中。在培養(yǎng)過程中，每20~25天更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期為50d~55d，持續(xù)繼代應(yīng)達(dá)到100代以上。7擴(kuò)大生產(chǎn)7.1接種按0.4g/L~0.5g/L接種量，將采收的種源干細(xì)胞轉(zhuǎn)接至2L~3L的固體培養(yǎng)瓶中，其它按本文件第6章的規(guī)定執(zhí)行。7.2日常管理每天觀察培養(yǎng)瓶，如發(fā)現(xiàn)褐化、玻璃化組織，及時(shí)清除出培養(yǎng)體系。如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌或真菌的污染，立即將污染品移出培育生產(chǎn)間并銷毀。8采收8.1采收標(biāo)準(zhǔn)選取形態(tài)規(guī)則，干細(xì)胞成團(tuán)性好，干細(xì)胞顆粒均勻，淡黃色或淡綠色的干細(xì)胞。8.2采收方法采收時(shí)剔除褐化的干細(xì)胞團(tuán)，選取顏色，生長狀態(tài)和生長速率穩(wěn)定的干細(xì)胞組織，無菌包裝，用于后續(xù)的誘導(dǎo)和育苗。8.3質(zhì)量等級(jí)劃分8.3.1特級(jí)形態(tài)規(guī)則，干細(xì)胞成團(tuán)性好，直徑大于8mm，干細(xì)胞顆粒均勻，淡黃色或淡綠色。8.3.2一級(jí)形態(tài)基本規(guī)則，干細(xì)胞成團(tuán)性較好，直徑3mm