1發布2015-02-27發布2015-03-01實施發布 II 2 2 2 3 4 6 本標準按照GB/T1.1-2009給出的規則起草。孫潔、陶虹、廖立珊、唐金明、陳書琨、葉奕優、1非洲豬瘟病毒抗體檢測阻斷酶聯免疫吸附法GB/T6682分析實驗室用水規格和SN/T2123出入境動物檢疫實驗樣品蛋白抗體，就會與包被抗原發生反應，從而阻斷下一步酶標抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆最終的顯色反應就越淺，因此可通過酶標儀讀數來判定待檢血清樣品中抗體的含量。ASF：非洲豬瘟。ASFV：非洲豬瘟病毒。2a)主要菌株與質粒:pET-52b(+)3C/LIC-p54重組表達質粒（含ASFVp54目的基因，片段大小為552bp）；感受態細胞BL21(b)主要試劑:LB培養基；PCR反應母液；瓊脂糖凝膠；IPTG；氨芐青霉素；細菌細胞蛋白裂解液；液體石蠟；胎牛血清；IMDM基礎培養液；ELISA包被液；封閉液；稀釋液；顯色液；終止液。具體配制方法見附錄A。非洲豬瘟標準陰性血清微量移液器（10μL、100μL、1000μ3采用引物對（上游引物序列為5’-ATGGATTCTGAATTTTTTCA-3’，下游引物序列為增出552bp的特異性條帶，具體核苷酸序列可參考7.3ASFVp54蛋白抗原的表達、將含pET-52b(+)3C/LIC-p54重組表達質粒載體的BL21(DE3)宿主細胞，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養，挑取單個菌落，接種于2mL含100mg/L氨芐青霉7.3.2.1將7.3.1中收集的菌液在4℃300沉淀，4℃3000r/min離心15min，去上清。用細菌細胞蛋白裂解液重懸菌體，冰7.3.3.1性狀真空凍干保存的非洲豬瘟病毒p54重組蛋7.3.3.2濃度測定復溶后蛋白質濃度應不低7.3.3.3純度測定采用SDS對表達產物進行考馬斯亮藍染色，結果只在28ku大小處結果應在28ku大小處出現誘導表達條帶。采用非洲豬瘟標準陽性血清對表達產物進行免疫7.3.3.5貯藏與有效期置2～8℃貯藏，有效期為4藏中心（CCTCC武漢）保藏（細胞株保藏號：C2014212由深圳市檢驗檢疫科學研采用商業辣根過氧化物酶標記試劑盒對單克隆抗體進行酶標記，分裝冷凍8.3.2.2濃度測定蛋白含量應不低于1.0mg/m8.3.2.3效價測定用7中制備的p54蛋白抗原（2.5μg/mL包被ELISA板進行間接ELISA試驗，HRP標記抗體1：1000稀釋，OD9.1.1非洲豬瘟標準陽性血清來源9.1.2非洲豬瘟陽性血清的檢驗及貯藏9.1.2.3效價檢驗用ASF國際參考ELISA試劑盒試驗，PI值大于80%。59.2.1非洲豬瘟陰性對照血清來源采自3月齡健康豬血清，經ASF國際參考ELISA試劑盒試驗，檢測為陰9.2.2非洲豬瘟陰性血清的檢驗及貯藏9.2.2.2無菌檢驗按現行《中國獸藥典》第三部附9.2.2.3效價檢驗國際參考試劑盒試驗檢測PI值小于40。9.3待檢血清樣品的準備樣品保存等操作可按《出入境動物檢疫實驗樣品采集、運輸和保存9.4阻斷ELISA試驗操作9.4.1包被9.4.2洗板9.4.3封閉每孔加封閉液100μL，37℃反應1h。9.4.4洗板9.4.5加樣板，每份樣品做兩孔，每孔50μL；37℃反應1h。9.4.6洗板），69.4.9洗板9.4.10加底物液每孔加50μL底物液，37℃作用10min。9.4.11加終止液9.4.12結果讀取當標準陽性血清PI值≥80%，而標準陰性血清OD值≥1.0時，試驗成立。則待檢樣品可按下表判定，可疑樣品需重復實驗，結果仍為可疑則7A.30.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（P磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉A.4包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液A.5洗滌液（0.01mol/LpH7.4PBS0.05%Tween-20，PBST）8KH2PO4Tween-200.A.7底物液A.7.3工作底物液配制：臨用前配制。9水1atggattctgaattttttcaaccggt61gtcaccccaccaagcttcttctcca121ttagtcattattatcatc181gccgctattgaggaggaagatatacagt241gaagtcactccacaaccaggtacctctaaaccggctgga301aaaccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccag