FISHhays什么是FISH?熒光原位雜交（Fluorescence

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situ

Hybridization，F(xiàn)ISH）基本原理：應(yīng)用熒光染料標(biāo)記探針

DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交，在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。概述FISH

探針種類CSP著絲粒探針GLP特異性位點探針FISH操作簡單快速出結(jié)果標(biāo)本來源豐富靈敏度特異性高準(zhǔn)確率高FISH診斷的優(yōu)勢FISH在石臘切片標(biāo)本中的應(yīng)用FISH在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用FISH結(jié)果分析及注意事項二甲苯脫蠟梯度乙醇復(fù)水沸水煮30min37oC蛋白酶k5-30min變性雜交2XSSC漂洗2次石蠟切片標(biāo)本處理基本步驟：2XSSC漂洗2次梯度脫水洗片閱片DAPI染色脫蠟石蠟切片浸于二甲苯中3次,每次10分鐘浸入100%的乙醇中5分鐘.然后梯度復(fù)水各2分鐘浸入去離子水3分鐘(脫蠟不足會導(dǎo)致探針雜交強(qiáng)度和雜交率降低,熒光背景高等)預(yù)處理100

oC沸水處理組織切片30分鐘100ug/mL的蛋白酶K溶液,37

oC孵育5-30分鐘2*SSC漂洗,梯度脫水各2分鐘,干燥玻片.變性雜交洗滌DAPI復(fù)染50%甲酰胺2XSSC0.1%NP-4075%乙醇探針變性玻片變性83

oC5min42oC

濕盒孵育過夜羊水處理的步驟玻片制備懸液滴片及預(yù)處理變性雜交加探針變性雜交過熒光顯微鏡下觀察計數(shù)結(jié)果統(tǒng)計羊水標(biāo)本玻片的制備離心胰酶消化低滲（0.075M

KCL）預(yù)固定、固定滴片（控制好懸液濃度、量、高度）胰蛋白酶（Trypsin）消化操作中要控制好酶的工作濃度,適量加大酶有助于加強(qiáng)消化作用,但盲目加大酶量超過酶飽和度不一定起到加強(qiáng)消化的作用。實驗中應(yīng)控制好酶的工作濃度,不同批次、不同儲存時間及溫度影響酶消化強(qiáng)度及飽和度。低滲處理和固定細(xì)胞置于KCL低滲溶液中吸收水分可使細(xì)胞脹破，使探針更容易與核內(nèi)DNA雜交結(jié)合，便于結(jié)果分析。固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形成核蛋白交聯(lián)定型。提高細(xì)胞核與載玻片的親和力，使探針DNA易于進(jìn)入細(xì)胞。預(yù)處理37

oC

PBS

5min37

oC

0.005%胃酶15min1xPBS

3min1%多聚甲醛10min1xPBS

3min

2次梯度脫水胃蛋白酶處理胃蛋白酶處理可以取出細(xì)胞漿中的蛋白質(zhì)，減少探針在載玻片上與核酸和蛋白質(zhì)的非特異結(jié)合，提高雜交效率。變性雜交變性使DNA變性保持單鏈結(jié)構(gòu)雜交

濕潤密閉環(huán)境結(jié)果分析洗滌DAPI復(fù)染鏡下觀察計數(shù)FISH結(jié)果分析及注意事項FISH成像分析系統(tǒng)熒光顯微鏡的使用自己眼睛的保護(hù)。汞燈/氙燈的使用和保養(yǎng)。標(biāo)本熒光信號的保護(hù)。AF細(xì)胞觀察計數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下選擇探針雜交充分，不重疊的細(xì)胞計數(shù)50個陽性：異常細(xì)胞比率占60%以上陰性：正常細(xì)胞比率占90%以上無法判斷：沒達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，可擴(kuò)大計數(shù)范圍HER-2細(xì)胞觀察計數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下浸潤區(qū)隨機(jī)計數(shù)30個細(xì)胞，計算紅綠信號的比值（Ratio）陽性（擴(kuò)增）：

I:Ratio>2.2

II：成簇擴(kuò)增陰性：Ratio<1.8無法判斷：Ratio在1.8-2.2之間，分析更多細(xì)胞或重復(fù)實驗HER-2基因擴(kuò)增模式肺癌細(xì)胞觀察計數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下癌區(qū)隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞，計算紅綠信號的比值（Ratio）擴(kuò)增：I:

Ratio>2II:15copy>或=10%III:成簇擴(kuò)增IV：Ratio<2但4copy>或=40%陰性：除以上擴(kuò)增的情況EGFR基因擴(kuò)增檢測試劑盒（FISH）鏡下觀察可能現(xiàn)的問題無熒光信號出沒有用酶進(jìn)行處理,用了不恰當(dāng)?shù)臑V光鏡沒有加入探針(或探針沒有經(jīng)過適當(dāng)變性),雜交條件不夠恰當(dāng)探針不合格(或探針沒有適當(dāng)保存),熒光顯微鏡沒有適當(dāng)?shù)仄鹱饔脽晒庑盘栁⑷蹼s交條件不夠充分探針過分稀釋造成濃度太低,沒有適當(dāng)變性,探針和雜交液沒有充分混合,洗滌條件不夠恰當(dāng)(或洗滌太過),濾光鏡不對有背景熒光雜交后洗滌不夠充分洗滌緩沖液鹽的濃度過高洗滌時溫度過低熒光信號計數(shù)問題選擇分散較好不重疊的細(xì)胞計數(shù)IGH/CHER-2HER-2擴(kuò)增C-MYCCBFB基因斷裂重組檢測試劑盒探針：GLP

CBFBCBFB基因（Core

binding

factor

β，CBFB）：核心結(jié)合因子,位于16號染色體上。CBFB也是早期造血所必需的轉(zhuǎn)錄因子，通過與AML1的Runt同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，由AM