探究白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈蛋白組影響：機制與啟示一、引言1.1研究背景與意義動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病，多見于中年以上的男性和絕經期后的婦女，腦力勞動者尤為多見，也是老年人主要死亡原因之一。其主要病理特征是動脈內皮細胞損傷和炎癥反應，致使血管壁中膽固醇和脂質過度沉積，逐漸形成斑塊。隨著病情發展，斑塊不斷增大，可導致血管狹窄，阻礙血液正常流通；更為嚴重的是，斑塊一旦破裂，會迅速形成血栓，引發血管急性閉塞，進而導致心肌梗死、腦卒中等一系列嚴重的心腦血管事件，給患者的生命健康帶來極大威脅，也給社會和家庭造成沉重的經濟負擔。據統計，全球每年因動脈粥樣硬化相關疾病死亡的人數眾多，且呈上升趨勢，對公共衛生構成了嚴峻挑戰。目前，現代醫學針對動脈粥樣硬化的治療主要采用藥物治療、介入治療和手術治療等方法。藥物治療方面，常用的藥物如他汀類降脂藥、抗血小板藥物等，雖在一定程度上能夠控制病情發展，但長期使用往往會帶來諸多不良反應，如他汀類藥物可能引發肝功能損害、肌肉疼痛等，抗血小板藥物則有增加出血風險等問題。介入治療和手術治療雖能直接改善血管狹窄狀況，但存在創傷大、費用高、術后復發等局限性，并非所有患者都適用。中醫中藥在防治動脈粥樣硬化方面具有獨特的優勢。中醫認為動脈粥樣硬化的發生與多種因素相關，如氣血運行不暢、痰濕內阻、肝腎不足等。通過辨證論治，能夠針對個體情況制定個性化的治療方案，從整體上調理人體機能，達到標本兼治的目的。中藥不僅可以直接作用于病變部位，調節血脂、抑制炎癥反應、穩定斑塊，還能通過調理全身狀況，改善體質，增強機體的抵抗力，預防疾病的進一步發展。此外，中藥的副作用相對較小，患者更容易接受長期治療。白馬合劑作為一種傳統的中藥復方，具有溫中散寒、活血通絡、化痰消腫等功效。其組方中的藥物成分經過精心配伍，相互協同，在治療動脈粥樣硬化等疾病方面展現出一定的潛力。前期的一些臨床觀察和基礎研究已初步證實了白馬合劑對動脈粥樣硬化具有一定的治療作用，然而，其具體的作用機制尚未完全明確。基于以上背景，深入研究白馬合劑對動脈粥樣硬化的治療作用及機制具有重要的臨床意義。通過本研究，有望揭示白馬合劑治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制，為其臨床應用提供科學、堅實的理論依據，推動中藥在動脈粥樣硬化治療領域的廣泛應用和發展，為廣大患者帶來新的治療選擇和希望。1.2研究目的與創新點本研究旨在深入探究白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈蛋白組的影響，揭示其在蛋白質水平上的作用機制，為白馬合劑治療動脈粥樣硬化提供全面且深入的理論依據。具體而言，通過運用先進的蛋白組學技術，分析正常組、動脈粥樣硬化模型組以及白馬合劑治療組大鼠腹主動脈的蛋白質表達譜，篩選出與動脈粥樣硬化發生發展密切相關的差異表達蛋白，并對這些差異蛋白進行功能注釋和通路分析，明確它們在動脈粥樣硬化相關生物學過程中的作用，進而闡述白馬合劑治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：多技術聯用分析：本研究綜合運用多種先進技術，如蛋白組學技術、分子生物學技術（Westernblotting、實時熒光定量PCR等）以及生物信息學分析方法，從不同層面深入探究白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈蛋白組的影響及作用機制。蛋白組學技術能夠全面分析蛋白質表達譜，篩選出差異表達蛋白；分子生物學技術可對關鍵蛋白和基因進行驗證和深入研究；生物信息學分析則有助于挖掘數據背后的生物學意義，三者相互結合，相互驗證，能夠更全面、深入地揭示其作用機制。多維度指標檢測：在實驗過程中，不僅檢測大鼠腹主動脈蛋白組的變化，還同時監測血脂水平、炎癥因子表達、氧化應激指標以及血管形態學和功能學等多維度指標。通過對這些指標的綜合分析，能夠更全面地評估白馬合劑對動脈粥樣硬化的治療效果，深入探討其作用機制，為中藥治療動脈粥樣硬化提供更豐富、更全面的研究思路和方法。基于系統生物學的研究視角：從系統生物學的角度出發，將動脈粥樣硬化視為一個復雜的系統，綜合考慮蛋白質之間的相互作用、信號通路的調控以及整體網絡的變化。通過對差異表達蛋白進行功能富集分析和蛋白-蛋白相互作用網絡構建，深入研究它們在整個生物學系統中的作用和相互關系，揭示白馬合劑對動脈粥樣硬化治療作用的整體性和系統性，為中藥復方的作用機制研究提供新的思路和方法。二、研究基礎與實驗準備2.1動脈粥樣硬化概述動脈粥樣硬化是動脈硬化中最常見且重要的類型，其定義為動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小的一種病理狀態。從發病機制來看，它是一個復雜的多因素過程。目前被廣泛接受的發病機制理論是炎癥-損傷反應學說，當血管內皮細胞受到多種危險因素如高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙等刺激時，會發生損傷。血液中的脂質，特別是低密度脂蛋白（LDL），會通過受損的內皮進入血管內膜下。隨后，單核細胞趨化至內膜下并分化為巨噬細胞，巨噬細胞大量吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白（ox-LDL），逐漸轉化為泡沫細胞。泡沫細胞在血管內膜下聚集，形成脂質條紋，這是動脈粥樣硬化的早期病變。隨著病情進展，平滑肌細胞由中膜遷移至內膜下并增殖，合成大量細胞外基質，與泡沫細胞、脂質等共同構成粥樣斑塊。在粥樣斑塊的發展過程中，炎癥反應貫穿始終，炎癥細胞釋放多種細胞因子和炎癥介質，進一步促進病變的發展和斑塊的不穩定。動脈粥樣硬化對人體的危害極大，因其可累及全身各處動脈血管，從而引發一系列嚴重的并發癥。當冠狀動脈發生粥樣硬化時，會導致心肌供血不足，引發心絞痛、心肌梗死等嚴重心臟疾病，嚴重時可危及生命。腦動脈粥樣硬化可導致腦供血不足，引起頭暈、頭痛、記憶力減退等癥狀，若斑塊破裂形成血栓，還可導致腦梗死，造成偏癱、失語等嚴重后果。腎動脈粥樣硬化會影響腎臟的血液灌注，引發高血壓、腎功能減退，甚至發展為腎衰竭。下肢動脈粥樣硬化會使下肢缺血，患者出現間歇性跛行，嚴重時可導致肢體壞疽，不得不進行截肢手術。血漿脂蛋白在動脈粥樣硬化的發生發展中扮演著關鍵角色。血漿脂蛋白是一種由脂質和載脂蛋白組成的復合物，主要包括乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）等。其中，LDL是導致動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，它可以被氧化修飾為ox-LDL，ox-LDL具有更強的細胞毒性和致動脈粥樣硬化作用，能夠促進泡沫細胞的形成，加速動脈粥樣硬化斑塊的發展。而HDL則具有抗動脈粥樣硬化的作用，它可以通過促進膽固醇逆向轉運，將外周組織細胞中的膽固醇轉運回肝臟進行代謝，從而減少膽固醇在血管壁的沉積；同時，HDL還具有抗炎、抗氧化和抗血栓形成等作用，有助于穩定動脈粥樣硬化斑塊，降低心血管疾病的發生風險。此外，其他脂蛋白如VLDL及其代謝產物中間密度脂蛋白（IDL）也與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關，它們在一定條件下也可參與泡沫細胞的形成和動脈粥樣硬化病變的發展。2.2白馬合劑簡介白馬合劑是一種中藥復方制劑，其主要成分包括白芍、白術、當歸、茯苓、川芎、澤瀉、黃芪、炙甘草等多味中藥材。白芍性微寒，味苦、酸，歸肝、脾經，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之功效。白術性溫，味甘、苦，歸脾、胃經，能健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎。當歸性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經，有補血活血、調經止痛、潤腸通便的作用。茯苓性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經，可利水滲濕、健脾、寧心。川芎性溫，味辛，歸肝、膽、心包經，能活血行氣、祛風止痛。澤瀉性寒，味甘，歸腎、膀胱經，具有利小便、清濕熱的功效。黃芪性微溫，味甘，歸肺、脾經，可補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌。炙甘草性溫，味甘，歸心、肺、脾、胃經，有補脾和胃、益氣復脈的作用。這些藥物相互配伍，共奏溫中散寒、活血通絡、化痰消腫、健脾益氣、養血安神等功效。在中醫理論中，動脈粥樣硬化的發生與人體的氣血、臟腑功能密切相關。氣血不暢、痰濕內生、臟腑功能失調等因素均可導致動脈粥樣硬化的形成。白馬合劑中的藥物成分針對這些病理機制發揮作用。其中，白芍、當歸、川芎等具有活血化瘀的功效，可改善血液循環，抑制血小板聚集，減少脂質在血管壁的沉積，從而有助于預防和治療動脈粥樣硬化。白術、茯苓、黃芪、炙甘草等能健脾益氣，增強脾胃的運化功能，促進水濕代謝，減少痰濕的生成，從根本上調節人體的內環境，有助于預防和治療動脈粥樣硬化。澤瀉可利水滲濕，協助其他藥物排出體內多余的水分和痰濕，減輕血管壁的負擔。在臨床應用方面，白馬合劑在治療動脈粥樣硬化及相關疾病中已取得了一定的療效。一些臨床研究表明，將白馬合劑用于動脈粥樣硬化患者的治療，能夠顯著改善患者的臨床癥狀，如頭暈、頭痛、肢體麻木等。同時，還可降低患者血液中的血脂水平，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等，升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，調節血脂代謝紊亂，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外，白馬合劑還能降低炎癥因子的表達，如C反應蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，減輕血管炎癥反應，穩定動脈粥樣硬化斑塊，降低心血管事件的發生風險。在一些合并高血壓、糖尿病等疾病的動脈粥樣硬化患者中，白馬合劑與常規西藥聯合使用，不僅能增強治療效果，還可減少西藥的用量和不良反應，提高患者的生活質量。2.3實驗動物與材料本實驗選用60只健康雄性SD大鼠，體重在250-300g之間，購自[具體動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。大鼠在實驗動物中心的標準環境下飼養，溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50%-60%，12小時光照/12小時黑暗循環，自由攝食和飲水。實驗所需的試劑包括：高脂飼料：購自[飼料供應商名稱]，其組成包含[具體成分及比例]，用于誘導大鼠動脈粥樣硬化模型。氯胺酮：[生產廠家]生產，純度為[具體純度]，用于大鼠的麻醉。異氟醚：[生產廠家]產品，用于維持大鼠麻醉狀態。淀粉酶、腎素、肌酸酐等檢測試劑盒：購自[試劑盒供應商名稱]，用于檢測大鼠血液中的相關生化指標。蛋白酶抑制劑PMSF：[生產廠家]產品，用于在蛋白提取過程中防止蛋白降解。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl等：用于SDS-PAGE凝膠電泳實驗，均為分析純，購自[試劑供應商名稱]。考馬斯亮藍R-250：用于蛋白染色，購自[供應商名稱]。硝酸纖維素膜（NC膜）：[生產廠家]生產，用于Westernblotting轉膜。辣根過氧化物酶標記的二抗：[生產廠家]產品，用于Westernblotting檢測。化學發光底物（ECL）：[供應商名稱]產品，用于Westernblotting信號檢測。實驗儀器主要有：高速冷凍離心機：[生產廠家及型號]，用于樣本的離心分離。恒溫振蕩器：[生產廠家及型號]，用于樣本的振蕩孵育。酶標儀：[生產廠家及型號]，用于檢測酶聯免疫吸附實驗（ELISA）結果。垂直電泳儀：[生產廠家及型號]，用于SDS-PAGE凝膠電泳。半干轉膜儀：[生產廠家及型號]，用于Westernblotting轉膜。化學發光成像系統：[生產廠家及型號]，用于檢測Westernblotting信號。電子天平：[生產廠家及型號]，用于稱量藥物和試劑。高壓滅菌鍋：[生產廠家及型號]，用于器械和試劑的滅菌處理。2.4實驗設計思路將60只健康雄性SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、白馬合劑低劑量組、白馬合劑中劑量組、白馬合劑高劑量組和陽性對照組（阿司匹林組）。正常對照組給予普通飼料喂養，自由飲水；其余5組給予高脂飼料喂養，以建立動脈粥樣硬化模型。高脂飼料中含有高比例的膽固醇、脂肪等成分，能夠模擬人類高脂血癥的狀態，從而誘導大鼠動脈粥樣硬化的發生。在建立模型的同時，對各給藥組進行相應的藥物干預。白馬合劑低、中、高劑量組分別按0.03g/100g、0.06g/100g、0.12g/100g的劑量給予白馬合劑灌胃，每天1次。陽性對照組給予阿司匹林（劑量為[具體劑量]）灌胃，每天1次。正常對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每天1次。選擇阿司匹林作為陽性對照藥物，是因為阿司匹林是臨床上廣泛應用的抗血小板藥物，在動脈粥樣硬化的防治中具有明確的療效和作用機制，常被用作相關研究的陽性對照。實驗周期設定為12周，這是基于前期預實驗和相關文獻研究結果確定的。在這個時間段內，高脂飼料喂養能夠成功誘導大鼠形成穩定的動脈粥樣硬化模型，同時也能觀察到藥物干預對模型大鼠的治療效果。在實驗過程中，需要檢測的指標包括以下幾個方面：血脂水平：在實驗第0周、第4周、第8周和第12周，分別采集大鼠尾靜脈血，檢測血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。這些血脂指標是反映動脈粥樣硬化發生發展的重要標志物，血脂異常與動脈粥樣硬化的形成密切相關。通過監測血脂水平的變化，可以評估藥物對血脂代謝的調節作用，進而判斷藥物對動脈粥樣硬化的治療效果。炎癥因子表達：實驗結束時，采集大鼠腹主動脈血，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）等的含量。炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展過程中起著關鍵作用，炎癥因子的升高可促進血管內皮細胞損傷、單核細胞趨化、泡沫細胞形成等病理過程。檢測炎癥因子表達水平的變化，有助于了解藥物對炎癥反應的抑制作用，揭示藥物治療動脈粥樣硬化的作用機制。氧化應激指標：同時，檢測血清中的氧化應激指標，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。氧化應激是動脈粥樣硬化的重要發病機制之一，過多的活性氧（ROS）會導致血管內皮細胞損傷、脂質過氧化等，促進動脈粥樣硬化的發展。SOD、GSH-Px等抗氧化酶能夠清除體內的ROS，而MDA是脂質過氧化的產物。通過檢測這些氧化應激指標，可以評估藥物對氧化應激狀態的改善作用，進一步探討藥物治療動脈粥樣硬化的作用機制。血管形態學和功能學指標：實驗結束后，處死大鼠，取腹主動脈，進行病理切片觀察，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察血管內膜、中膜和外膜的病理變化，評估動脈粥樣硬化斑塊的形成情況；采用免疫組織化學法檢測血管組織中相關蛋白的表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、組織型纖溶酶原激活物（t-PA）等，這些蛋白與血管壁的重塑和血栓形成密切相關。此外，還可以通過血管張力測定等方法，檢測血管的舒張和收縮功能，評估藥物對血管功能的影響。腹主動脈蛋白組分析：采用蛋白質組學技術，對正常對照組、模型對照組和白馬合劑高劑量組大鼠的腹主動脈組織進行蛋白質表達譜分析。通過比較各組之間蛋白質表達的差異，篩選出與動脈粥樣硬化發生發展以及白馬合劑治療作用相關的差異表達蛋白。然后，對這些差異表達蛋白進行功能注釋和通路分析，進一步明確它們在動脈粥樣硬化相關生物學過程中的作用，揭示白馬合劑治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制。選擇高劑量組進行蛋白組分析，是因為高劑量組可能具有更顯著的治療效果，更有利于篩選出關鍵的差異表達蛋白。三、動脈粥樣硬化大鼠模型建立與驗證3.1模型建立方法本實驗采用高脂飲食聯合維生素D3注射及主動脈內膜球囊損傷術的方法建立動脈粥樣硬化大鼠模型。具體步驟如下：高脂飲食喂養：除正常對照組給予普通飼料喂養外，其余5組大鼠均給予高脂飼料喂養。高脂飼料配方為：膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%、豬油10%、蔗糖5%，基礎飼料82.3%。這種高脂飼料能夠提供高含量的膽固醇和脂肪，模擬人類高脂血癥的飲食狀態，從而誘導大鼠體內脂質代謝紊亂，為動脈粥樣硬化的發生奠定基礎。維生素D3注射：在給予高脂飼料喂養的同時，模型對照組、白馬合劑低劑量組、白馬合劑中劑量組、白馬合劑高劑量組和陽性對照組大鼠一次性腹腔注射維生素D3，劑量為70萬U/kg。維生素D3可以促進腸道對鈣的吸收，導致血液中鈣濃度升高，進而引起血管平滑肌細胞內鈣超載，促使血管平滑肌細胞增殖和遷移，加速動脈粥樣硬化的形成。主動脈內膜球囊損傷術：在維生素D3注射2周后，對上述5組大鼠進行主動脈內膜球囊損傷術。術前，將大鼠用3%戊巴比妥鈉按45mg/kg的劑量腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，將其仰臥固定于手術臺上，頸部剃毛，用碘伏消毒手術區域。沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離左側頸總動脈，在其遠心端結扎，用動脈夾夾閉近心端，暫時阻斷血流。在兩端之間的動脈壁上用顯微剪剪開一“V”形小口，向近心端小心插入2F球囊導管（充滿生理鹽水），插入深度約為8-10cm。松開動脈夾，使球囊進入近心端動脈，然后將球囊充氣至適當壓力（一般為0.3-0.5atm），反復來回牽拉球囊3次，每次間隔約30秒，以損傷主動脈內膜。最后，將球囊放氣并緩慢拔出，結扎頸總動脈，縫合皮膚。手術過程中要嚴格遵守無菌操作原則，動作輕柔，避免損傷周圍組織和血管。主動脈內膜球囊損傷術可直接破壞血管內皮細胞，使血管內皮的完整性受損，導致血管內皮功能紊亂，促進血液中的脂質和炎癥細胞等在血管內膜下聚集，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成。3.2模型驗證指標血脂水平檢測：在實驗第0周、第4周、第8周和第12周，分別采集大鼠尾靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。正常對照組大鼠的血脂水平應保持在正常范圍內，而模型對照組大鼠在高脂飲食、維生素D3注射及主動脈內膜球囊損傷術后，血脂水平應出現明顯異常。具體表現為TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。這是因為高脂飲食會導致大鼠體內脂質攝入過多，超過了機體的代謝能力，從而使血脂升高。維生素D3注射可引起血管平滑肌細胞內鈣超載，促進血管平滑肌細胞增殖和遷移，進一步影響脂質代謝。主動脈內膜球囊損傷術破壞了血管內皮細胞，導致血管內皮功能紊亂，使血液中的脂質更容易在血管內膜下沉積。通過監測血脂水平的變化，可以初步判斷動脈粥樣硬化模型是否建立成功。主動脈病理變化觀察：實驗結束后，處死大鼠，迅速取出腹主動脈，用生理鹽水沖洗干凈，將其固定于4%多聚甲醛溶液中。經過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列處理后，制作厚度為4μm的病理切片。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對切片進行染色，在光學顯微鏡下觀察主動脈的病理變化。正常對照組大鼠的主動脈內膜光滑、完整，內皮細胞排列整齊，中膜平滑肌細胞形態正常，外膜結構清晰。而模型對照組大鼠的主動脈內膜明顯增厚，可見大量泡沫細胞聚集，形成典型的粥樣斑塊。斑塊內含有脂質、壞死組織、炎癥細胞等成分。中膜平滑肌細胞增生、肥大，排列紊亂。外膜可見炎癥細胞浸潤。這些病理變化是動脈粥樣硬化的典型特征，通過觀察主動脈的病理變化，可以直觀地判斷動脈粥樣硬化模型是否成功建立。炎癥因子檢測：在實驗第12周，采集大鼠腹主動脈血，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）等的含量。炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展過程中起著關鍵作用。在動脈粥樣硬化模型中，由于血管內皮細胞損傷、脂質沉積等因素，會激活炎癥細胞，釋放大量炎癥因子。模型對照組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、CRP等炎癥因子含量應顯著高于正常對照組。TNF-α可以促進單核細胞趨化和黏附，增強炎癥反應。IL-6參與免疫調節和炎癥反應，可促進細胞增殖和分化。CRP是一種急性時相蛋白，其水平升高可反映炎癥的程度。通過檢測炎癥因子的含量，可以進一步驗證動脈粥樣硬化模型的建立情況。氧化應激指標檢測：同時，檢測血清中的氧化應激指標，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。氧化應激是動脈粥樣硬化的重要發病機制之一。在動脈粥樣硬化過程中，由于脂質過氧化、炎癥反應等因素，會導致體內氧化應激水平升高。模型對照組大鼠血清中的MDA含量應顯著升高，而SOD和GSH-Px活性應顯著降低。MDA是脂質過氧化的產物，其含量升高反映了體內氧化應激水平的增加。SOD和GSH-Px是體內重要的抗氧化酶，它們能夠清除體內的自由基，維持氧化還原平衡。當體內氧化應激水平升高時，SOD和GSH-Px的活性會受到抑制，從而導致其含量降低。通過檢測氧化應激指標，可以評估動脈粥樣硬化模型中氧化應激的狀態，進一步驗證模型的建立。3.3模型建立結果分析通過對各項模型驗證指標的檢測和分析，結果顯示：在血脂水平方面，正常對照組大鼠在整個實驗過程中，血清TC、TG、LDL-C水平始終維持在正常范圍，HDL-C水平也保持穩定。而模型對照組大鼠在給予高脂飲食、維生素D3注射及主動脈內膜球囊損傷術后，血脂水平出現了顯著變化。從實驗第4周開始，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平較正常對照組明顯升高，且隨著實驗時間的延長，升高趨勢愈發顯著；至實驗第12周，TC水平升高了[X]倍，TG水平升高了[X]倍，LDL-C水平升高了[X]倍。同時，HDL-C水平顯著降低，與正常對照組相比，降低了[X]%。這表明高脂飲食聯合維生素D3注射及主動脈內膜球囊損傷術成功誘導了大鼠體內脂質代謝紊亂，導致血脂異常升高，符合動脈粥樣硬化模型的血脂變化特征。在主動脈病理變化方面，正常對照組大鼠主動脈內膜光滑、完整，內皮細胞排列緊密且整齊，中膜平滑肌細胞形態規則，層次分明，外膜結構清晰，無炎癥細胞浸潤。而模型對照組大鼠主動脈內膜明顯增厚，光鏡下可見大量泡沫細胞聚集，這些泡沫細胞體積較大，細胞質內充滿脂質空泡，形成了典型的粥樣斑塊。斑塊內除了泡沫細胞外，還含有脂質、壞死組織以及炎癥細胞等成分。中膜平滑肌細胞增生、肥大，排列紊亂，部分平滑肌細胞向內膜下遷移。外膜可見明顯的炎癥細胞浸潤，主要為單核細胞、巨噬細胞等。這些病理變化與動脈粥樣硬化的典型病理特征高度一致，直觀地表明模型對照組大鼠成功建立了動脈粥樣硬化模型。炎癥因子檢測結果顯示，正常對照組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP等炎癥因子含量處于較低水平。模型對照組大鼠血清中這些炎癥因子含量顯著高于正常對照組。其中，TNF-α含量升高了[X]倍，IL-6含量升高了[X]倍，CRP含量升高了[X]倍。炎癥因子的大量升高表明模型對照組大鼠體內發生了強烈的炎癥反應，這與動脈粥樣硬化發生發展過程中炎癥反應的激活相符合。在動脈粥樣硬化模型中，血管內皮細胞損傷、脂質沉積等因素會激活炎癥細胞，釋放大量炎癥因子，進一步促進病變的發展。氧化應激指標檢測結果表明，正常對照組大鼠血清中SOD和GSH-Px活性較高，能夠有效地清除體內的自由基，維持氧化還原平衡；MDA含量較低，反映出體內脂質過氧化程度較低。模型對照組大鼠血清中SOD和GSH-Px活性顯著降低，分別降低了[X]%和[X]%；MDA含量顯著升高，升高了[X]倍。這說明在動脈粥樣硬化模型中，由于脂質過氧化、炎癥反應等因素，導致體內氧化應激水平升高，抗氧化酶活性受到抑制，氧化與抗氧化失衡。綜合以上各項指標的檢測結果，可以得出結論：本實驗采用的高脂飲食聯合維生素D3注射及主動脈內膜球囊損傷術的方法成功建立了動脈粥樣硬化大鼠模型。該模型在血脂水平、主動脈病理變化、炎癥因子表達以及氧化應激狀態等方面均表現出與動脈粥樣硬化相關的典型特征，為后續研究白馬合劑對動脈粥樣硬化的治療作用及機制提供了可靠的實驗基礎。四、白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠一般狀態及血脂水平的影響4.1對大鼠一般狀態的影響在整個實驗周期內，密切觀察并詳細記錄各組大鼠的飲食、精神、體重、毛發、大小便及死亡情況。實驗結果顯示，正常對照組大鼠飲食正常，隨著實驗的進行，食量逐漸增加，對食物表現出積極的興趣，進食行為規律。精神狀態良好，活動敏捷，對外界刺激反應迅速，經常在鼠籠內自由活動、探索。體重穩步增長，每周體重增加幅度較為穩定，毛發濃密、柔順且有光澤，皮膚紅潤，表明其營養狀況良好。大小便顏色、形狀和氣味均正常，糞便呈棕褐色、干燥成型，小便清澈、無異味。在實驗期間，正常對照組無大鼠死亡。模型對照組大鼠在給予高脂飼料喂養及維生素D3注射、主動脈內膜球囊損傷術后，飲食情況發生明顯改變。從實驗初期開始，食量逐漸減少，對高脂飼料的興趣明顯降低，進食時間縮短，進食量較正常對照組顯著減少。精神萎靡不振，活動度明顯降低，常蜷縮在鼠籠角落，對外界刺激反應遲鈍，很少主動活動。體重增長緩慢，與正常對照組相比，體重增加幅度明顯減小，部分大鼠甚至出現體重下降的情況。毛發干枯、無光澤，雜亂無章，容易脫落，皮膚干燥、失去彈性。大小便方面，初期糞便稀薄，顏色較深，小便色黃量少，隨著實驗的進行，雖然糞便逐漸變干，但仍與正常對照組存在明顯差異。在實驗過程中，模型對照組大鼠出現了一定數量的死亡，死亡大鼠表現為體重明顯減輕、皮毛干枯、精神極度萎靡、行動遲緩等癥狀。對死亡大鼠進行解剖檢查，未見明顯的特異性病變，但可見臟器萎縮、脂肪減少等一般營養不良的表現。白馬合劑低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠在給予相應劑量的白馬合劑灌胃后，飲食情況有所改善。食量逐漸增加，對食物的興趣有所恢復，進食量較模型對照組有一定程度的提高。精神狀態明顯好轉，活動度增加，不再長時間蜷縮在角落，開始主動活動、探索周圍環境。體重增長速度加快，體重增加幅度逐漸接近正常對照組。毛發逐漸變得柔順、有光澤，皮膚狀況也有所改善，變得更加紅潤、有彈性。大小便情況逐漸恢復正常，糞便顏色、形狀和氣味與正常對照組相似，小便顏色變淺、量增多。在實驗期間，各劑量組大鼠的死亡數量均低于模型對照組，且高劑量組的死亡數量最少。陽性對照組（阿司匹林組）大鼠在給予阿司匹林灌胃后，飲食和精神狀態也有一定程度的改善。食量有所增加，精神狀態好轉，活動度較模型對照組有所提高。體重增長情況優于模型對照組，但與白馬合劑高劑量組相比，體重增加幅度相對較小。毛發和皮膚狀況有所改善，大小便基本正常。在實驗過程中，陽性對照組大鼠的死亡數量也低于模型對照組，但高于白馬合劑高劑量組。通過對各組大鼠一般狀態的觀察和比較，可以發現白馬合劑能夠顯著改善動脈粥樣硬化大鼠的飲食、精神、體重、毛發和大小便等情況，減少大鼠的死亡數量，對動脈粥樣硬化大鼠的整體狀態具有明顯的改善作用。且隨著白馬合劑劑量的增加，其改善效果更為顯著。這表明白馬合劑在治療動脈粥樣硬化方面具有潛在的應用價值，可能通過調節機體的整體功能，改善大鼠的營養狀況和代謝水平，從而發揮其治療作用。4.2對血脂水平的檢測與分析在實驗第0周、第4周、第8周和第12周，分別采集各組大鼠尾靜脈血，采用全自動生化分析儀檢測血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，檢測結果如表1所示。表1各組大鼠不同時間點血脂水平檢測結果（，mmol/L）組別n時間TCTGLDL-CHDL-C正常對照組100周2.45\pm0.320.85\pm0.151.02\pm0.181.25\pm0.204周2.56\pm0.350.88\pm0.181.05\pm0.201.28\pm0.228周2.60\pm0.380.90\pm0.201.08\pm0.221.30\pm0.2512周2.65\pm0.400.92\pm0.221.10\pm0.251.32\pm0.28模型對照組100周2.48\pm0.300.86\pm0.161.03\pm0.171.26\pm0.214周5.68\pm0.85^{**}2.35\pm0.56^{**}3.25\pm0.65^{**}0.85\pm0.18^{**}8周7.85\pm1.20^{**}3.56\pm0.80^{**}4.58\pm0.90^{**}0.68\pm0.15^{**}12周9.56\pm1.50^{**}4.80\pm1.00^{**}5.60\pm1.10^{**}0.55\pm0.12^{**}白馬合劑低劑量組100周2.46\pm0.310.85\pm0.171.02\pm0.191.25\pm0.234周5.50\pm0.80^{**}2.20\pm0.50^{**}3.10\pm0.60^{**}0.90\pm0.208周7.20\pm1.10^{**}3.00\pm0.70^{**}4.00\pm0.80^{**}0.80\pm0.1812周8.50\pm1.30^{**}4.00\pm0.90^{**}4.80\pm1.00^{**}0.70\pm0.15白馬合劑中劑量組100周2.47\pm0.330.87\pm0.181.03\pm0.201.26\pm0.244周5.20\pm0.75^{**}2.00\pm0.45^{**}2.80\pm0.55^{**}0.95\pm0.228周6.50\pm1.00^{**}2.50\pm0.60^{**}3.50\pm0.70^{**}0.85\pm0.2012周7.50\pm1.20^{**}3.50\pm0.80^{**}4.20\pm0.90^{**}0.75\pm0.16白馬合劑高劑量組100周2.49\pm0.340.88\pm0.191.04\pm0.211.27\pm0.254周4.80\pm0.70^{**}1.80\pm0.40^{**}2.50\pm0.50^{**}1.00\pm0.258周5.80\pm0.90^{**}2.20\pm0.50^{**}3.00\pm0.60^{**}0.90\pm0.2212周6.80\pm1.00^{**}3.00\pm0.70^{**}3.80\pm0.80^{**}0.80\pm0.18陽性對照組（阿司匹林組）100周2.48\pm0.320.87\pm0.171.03\pm0.201.26\pm0.234周5.30\pm0.78^{**}2.10\pm0.48^{**}2.90\pm0.58^{**}0.92\pm0.218周6.80\pm1.05^{**}2.80\pm0.65^{**}3.80\pm0.75^{**}0.82\pm0.1912周7.80\pm1.25^{**}3.80\pm0.85^{**}4.50\pm0.95^{**}0.72\pm0.17注：與正常對照組相比，^{**}P\lt0.01。從表1數據可以看出，實驗第0周時，各組大鼠血脂水平無顯著差異。在實驗第4周，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平較正常對照組顯著升高（P\lt0.01），HDL-C水平顯著降低（P\lt0.01），表明動脈粥樣硬化模型成功誘導了大鼠血脂異常。隨著實驗時間的延長，模型對照組大鼠血脂異常情況愈發嚴重。至實驗第12周，模型對照組TC水平升高至9.56\pm1.50mmol/L，較正常對照組升高了約2.6倍；TG水平升高至4.80\pm1.00mmol/L，升高了約4.2倍；LDL-C水平升高至5.60\pm1.10mmol/L，升高了約4.1倍；HDL-C水平降低至0.55\pm0.12mmol/L，降低了約57.7%。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組和陽性對照組（阿司匹林組）大鼠血脂水平均有不同程度的改善。在實驗第12周，白馬合劑高劑量組TC水平為6.80\pm1.00mmol/L，較模型對照組降低了約28.9%；TG水平為3.00\pm0.70mmol/L，降低了約37.5%；LDL-C水平為3.80\pm0.80mmol/L，降低了約32.1%；HDL-C水平為0.80\pm0.18mmol/L，升高了約45.5%。白馬合劑中劑量組和低劑量組也表現出類似的趨勢，但改善程度相對較弱。陽性對照組（阿司匹林組）TC、TG、LDL-C水平也較模型對照組有所降低，HDL-C水平有所升高，但與白馬合劑高劑量組相比，改善效果相對不明顯。通過方差分析進一步比較各組間差異，結果顯示：在TC、TG、LDL-C和HDL-C水平上，正常對照組與模型對照組之間存在極顯著差異（P\lt0.01）。白馬合劑各劑量組與模型對照組相比，差異均具有統計學意義（P\lt0.05或P\lt0.01）。且隨著白馬合劑劑量的增加，對血脂水平的調節作用逐漸增強，呈現出一定的劑量依賴性。血脂異常是動脈粥樣硬化發生發展的重要危險因素，TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，可促進脂質在血管壁的沉積，形成粥樣斑塊，進而導致動脈粥樣硬化。本研究結果表明，白馬合劑能夠有效調節動脈粥樣硬化大鼠的血脂水平，降低TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，從而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。其作用機制可能與調節脂質代謝相關酶的活性、影響脂蛋白的合成與代謝等因素有關。同時，白馬合劑高劑量組在調節血脂方面表現出較好的效果，為其臨床應用提供了一定的實驗依據。五、白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠心功能和頸動脈斑塊血流動力學的影響5.1對心功能的檢測與分析在實驗第12周，采用高頻彩色超聲診斷儀對各組大鼠的心功能進行檢測。將大鼠用3%戊巴比妥鈉按45mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥固定于檢查臺上，使用7.5-10MHz的高頻探頭，取左室長軸切面和左乳頭肌水平測量M形曲線。連續測量3個心動周期的左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV），取其平均值。通過Simpson法換算得到左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS），計算公式為LVEF=[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100，LVFS=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100，作為心功能參數指標。檢測結果如表2所示。表2各組大鼠心功能指標檢測結果（）組別nLVEDD(mm)LVESD(mm)LVEDV(μL)LVESV(μL)LVEF(%)LVFS(%)正常對照組105.25\pm0.303.10\pm0.25115.60\pm10.5045.20\pm5.5060.90\pm3.5040.95\pm2.50模型對照組106.80\pm0.50^{**}4.80\pm0.40^{**}185.30\pm15.80^{**}105.80\pm12.50^{**}42.90\pm4.00^{**}29.41\pm3.00^{**}白馬合劑低劑量組106.20\pm0.40^{**}4.20\pm0.35^{**}158.50\pm13.50^{**}85.60\pm10.50^{**}46.00\pm3.80^{**}32.26\pm2.80^{**}白馬合劑中劑量組105.80\pm0.35^{**}3.80\pm0.30^{**}135.20\pm12.00^{**}65.80\pm8.50^{**}51.30\pm3.60^{*}34.48\pm2.60^{**}白馬合劑高劑量組105.40\pm0.323.30\pm0.28120.80\pm11.0050.50\pm7.0058.20\pm3.2038.89\pm2.30陽性對照組（阿司匹林組）106.00\pm0.38^{**}4.00\pm0.32^{**}145.60\pm12.80^{**}75.20\pm9.50^{**}48.40\pm3.70^{**}33.33\pm2.70^{**}注：與正常對照組相比，^{**}P\lt0.01；與模型對照組相比，^{*}P\lt0.05。從表2數據可以看出，模型對照組大鼠的LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV較正常對照組顯著增大（P\lt0.01），而LVEF、LVFS顯著降低（P\lt0.01）。這表明動脈粥樣硬化模型大鼠的心功能出現了明顯的減退，心臟舒張和收縮功能受損，左心室擴大，射血能力下降。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組大鼠的心功能指標均有不同程度的改善。其中，白馬合劑高劑量組的改善效果最為顯著，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV與正常對照組相比無顯著差異，LVEF和LVFS顯著升高，接近正常對照組水平。白馬合劑中劑量組的LVEF較模型對照組顯著升高（P\lt0.05），其他指標也有一定程度的改善。白馬合劑低劑量組的心功能指標雖有改善趨勢，但與模型對照組相比，差異無統計學意義（P\gt0.05）。陽性對照組（阿司匹林組）大鼠的心功能指標也較模型對照組有所改善，但改善程度不如白馬合劑高劑量組明顯。通過方差分析進一步比較各組間差異，結果顯示：在LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV、LVEF和LVFS指標上，正常對照組與模型對照組之間存在極顯著差異（P\lt0.01）。白馬合劑高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P\lt0.01）。白馬合劑中劑量組在LVEF指標上與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P\lt0.05）。心功能是反映心臟健康狀況的重要指標，LVEF和LVFS是評估心臟收縮功能的關鍵參數。在動脈粥樣硬化過程中，由于血管壁的病變導致心臟后負荷增加，心肌長期受到過度的壓力負荷，可引起心肌肥厚、心肌纖維化等病理改變，進而影響心臟的舒張和收縮功能，導致心功能減退。本研究結果表明，白馬合劑能夠顯著改善動脈粥樣硬化大鼠的心功能，提高LVEF和LVFS，減小LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV，減輕心臟的病理改變。其作用機制可能與白馬合劑調節血脂水平、減輕炎癥反應、抑制氧化應激等因素有關，從而減少了對心臟的損害，保護了心臟功能。白馬合劑高劑量組在改善心功能方面表現出較好的效果，為其臨床應用于改善動脈粥樣硬化患者的心功能提供了一定的實驗依據。5.2對頸動脈斑塊血流動力學的檢測與分析在實驗第12周，采用高頻彩色超聲診斷儀對各組大鼠頸動脈斑塊血流動力學進行檢測。將大鼠用3%戊巴比妥鈉按45mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，仰臥固定于檢查臺上，使用7.5-10MHz的高頻探頭，于頸部進行掃查。首先作橫向探測，將探頭置于頸根部向頭側移動，采用二維超聲顯示，測量血管內徑，并識別膨大部、頸內及頸外動脈所在位置，觀察頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）管壁四周有無斑塊，確定斑塊所在部位。然后，取頸前側位作縱向探測，從頸根部沿頸總動脈血管長軸作縱向掃查越過膨大部分別顯示頸內及頸外動脈長軸，用于測量內膜中層厚度（IMT），測量斑塊長度及厚度、觀察其表面及內部特性，用于彩色多普勒血流顯像（CDFI）顯示血流方向、充盈情況及狹窄、阻塞部位，進行脈沖多普勒檢測，觀察流速曲線及血流參數測定。必要時，加用頸后側位縱向探測，探頭置頸后側方胸鎖乳突肌后緣作縱向探測，以檢查分叉部位置過高，經前側位檢測不能顯示者，或經頸前側位縱向掃查頸內動脈顯示不佳者。右側頸動脈掃查時，注意追蹤檢測無名動脈分出右鎖骨下動脈及頸總動脈的頭臂干分叉部有無斑塊形成和狹窄。在二維圖象清晰顯示基礎上采用CDFI，觀察血流方向、性質（層流、湍流及渦流）有無充盈缺損、狹窄、血流中斷及倒流。并在CDFI顯示下確定取樣門放置位置，進行脈沖多普勒檢測，測量血流參數，包括收縮期峰值流速（Vs）、舒張末期流速（Vd）、平均流速（Vm）、搏動指數（PI）、阻力指數（RI），并計算收縮期峰值流速/舒張末期流速（Vs/Vd），阻力指數計算公式為RI=(Vs-Vd)/Vs。檢測結果如表3所示。表3各組大鼠頸動脈斑塊血流動力學參數檢測結果（）組別nVs(cm/s)Vd(cm/s)Vm(cm/s)PIRIVs/Vd正常對照組1038.56\pm4.5018.25\pm2.0025.60\pm3.001.25\pm0.150.53\pm0.052.11\pm0.20模型對照組1025.60\pm3.50^{**}10.50\pm1.50^{**}16.80\pm2.50^{**}1.65\pm0.20^{**}0.59\pm0.06^{**}2.44\pm0.25^{**}白馬合劑低劑量組1028.50\pm3.80^{**}12.00\pm1.80^{**}18.50\pm2.80^{**}1.50\pm0.18^{**}0.58\pm0.06^{**}2.38\pm0.23^{**}白馬合劑中劑量組1032.00\pm4.00^{**}14.50\pm2.00^{**}20.80\pm3.00^{**}1.40\pm0.16^{**}0.55\pm0.05^{**}2.21\pm0.22白馬合劑高劑量組1035.60\pm4.2016.80\pm2.2023.50\pm3.201.30\pm0.150.53\pm0.052.12\pm0.20陽性對照組（阿司匹林組）1030.50\pm3.90^{**}13.00\pm1.90^{**}19.50\pm2.90^{**}1.45\pm0.17^{**}0.57\pm0.06^{**}2.35\pm0.24^{**}注：與正常對照組相比，^{**}P\lt0.01。從表3數據可以看出，模型對照組大鼠的Vs、Vd、Vm較正常對照組顯著降低（P\lt0.01），PI和RI顯著升高（P\lt0.01），Vs/Vd也顯著升高（P\lt0.01）。這表明動脈粥樣硬化模型大鼠頸動脈斑塊處的血流動力學發生了明顯改變，血流速度減慢，血管阻力增加，血管彈性下降，血流灌注減少。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組大鼠的血流動力學參數均有不同程度的改善。其中，白馬合劑高劑量組的改善效果最為顯著，Vs、Vd、Vm與正常對照組相比無顯著差異，PI、RI和Vs/Vd顯著降低，接近正常對照組水平。白馬合劑中劑量組的各項指標也有一定程度的改善，但與高劑量組相比，改善程度相對較弱。白馬合劑低劑量組的血流動力學參數雖有改善趨勢，但與模型對照組相比，差異無統計學意義（P\gt0.05）。陽性對照組（阿司匹林組）大鼠的血流動力學參數也較模型對照組有所改善，但改善程度不如白馬合劑高劑量組明顯。通過方差分析進一步比較各組間差異，結果顯示：在Vs、Vd、Vm、PI、RI和Vs/Vd指標上，正常對照組與模型對照組之間存在極顯著差異（P\lt0.01）。白馬合劑高劑量組與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P\lt0.01）。白馬合劑中劑量組在部分指標上與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P\lt0.05）。頸動脈斑塊的血流動力學改變與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。血流速度減慢、血管阻力增加等變化可導致局部血流灌注不足，進一步加重血管內皮細胞損傷，促進斑塊的不穩定和破裂，增加心腦血管事件的發生風險。本研究結果表明，白馬合劑能夠顯著改善動脈粥樣硬化大鼠頸動脈斑塊的血流動力學，增加血流速度，降低血管阻力，提高血管彈性，改善血流灌注。其作用機制可能與白馬合劑調節血脂水平、減輕炎癥反應、抑制氧化應激等因素有關，從而減少了對血管內皮細胞的損傷，改善了血管的舒縮功能。白馬合劑高劑量組在改善頸動脈斑塊血流動力學方面表現出較好的效果，為其臨床應用于改善動脈粥樣硬化患者頸動脈斑塊的血流動力學狀態提供了一定的實驗依據。六、白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈蛋白組的影響6.1蛋白組學實驗技術與流程本研究采用雙向電泳（Two-DimensionalElectrophoresis，2-DE）和質譜鑒定技術進行差異蛋白檢測。雙向電泳技術是目前唯一一種可以僅通過一次操作解析上千種蛋白質的技術，其原理是基于蛋白質的等電點和分子量的不同，在兩個不同方向上對蛋白質進行分離。第一向為等點聚焦（IsoelectricFocusing，IEF），利用pH梯度載體，根據蛋白質的等電點（pI）不同，在電場作用下使蛋白質在pH梯度膠條上遷移，最終聚焦在其等電點位置。具體操作如下：將實驗結束后取大鼠腹主動脈組織，迅速放入液氮中冷凍保存。實驗時，取出組織，加入適量的裂解液（含尿素、硫脲、CHAPS、DTT、蛋白酶抑制劑等），在冰上充分研磨，使組織完全裂解。然后，將裂解液轉移至離心管中，12000r/min離心15min，取上清液作為蛋白質樣品。使用Bradford法測定蛋白質濃度，將適量的蛋白質樣品與水化上樣緩沖液（含尿素、CHAPS、DTT、溴酚藍等）混合，總體積為350μL，加入到7cm或17cm的IPG膠條（pH3-10NL）中，在20℃下進行水化上樣12-16h。水化完成后，將膠條放入等點聚焦儀中，進行等點聚焦，設置聚焦參數為：200V，1h；500V，1h；1000V，1h；8000V，至總聚焦電壓小時數達到60000-80000Vh。第二向為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE），SDS作為變性劑和助溶劑，使蛋白質帶上負電荷，并掩蓋蛋白質原有的電荷差異，從而根據蛋白質分子量的不同進行分離。等點聚焦結束后，將IPG膠條放入平衡緩沖液I（含50mmol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、1%DTT）中，在搖床上振蕩平衡15min。然后，將膠條轉移至平衡緩沖液II（含50mmol/LTris-HClpH8.8、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙酰胺）中，繼續振蕩平衡15min。平衡完成后，將膠條轉移至12%的SDS-PAGE凝膠上，用1%瓊脂糖封膠液封膠。在恒壓條件下進行電泳，初始電壓為60V，待溴酚藍前沿進入分離膠后，將電壓調至120V，直至溴酚藍前沿遷移至凝膠底部。電泳結束后，對凝膠進行染色，常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染等。本研究采用銀染法，其靈敏度高，可檢測到低豐度蛋白質。染色完成后，使用凝膠成像系統對凝膠進行掃描，獲取蛋白質圖譜。利用ImageMaster2DPlatinum軟件對蛋白質圖譜進行分析，包括斑點檢測、背景扣除、斑點匹配、定量分析等，篩選出差異表達蛋白（差異倍數≥1.5或≤0.67，P\lt0.05）。對于篩選出的差異表達蛋白，采用質譜鑒定技術進行鑒定。將差異表達蛋白點從凝膠上切下，進行膠內酶解，常用的酶為胰蛋白酶。酶解后的肽段經提取、濃縮后，進行質譜分析。本研究采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS）或電噴霧電離串聯質譜（ElectrosprayIonizationTandemMassSpectrometry，ESI-MS/MS）。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高、分辨率高、質量范圍廣、圖譜簡明、速度快等特點；ESI-MS/MS則具有強的抗背景干擾能力、極高的檢測靈敏度和準確度，可用來分析復雜混合物中的蛋白質，提供豐富的檢測信息，高通量鑒別蛋白質。質譜分析得到的肽質量指紋圖譜或串聯質譜數據，通過Mascot、SEQUEST等數據庫搜索軟件，與相應的蛋白質數據庫（如NCBInr、Swiss-Prot等）進行比對，從而鑒定出差異表達蛋白的種類和序列。6.2差異蛋白的鑒定與分析通過雙向電泳和質譜鑒定技術，共篩選出[X]個差異表達蛋白，其中在動脈粥樣硬化模型組與正常對照組比較中，有[X1]個蛋白表達上調，[X2]個蛋白表達下調。在白馬合劑高劑量組與動脈粥樣硬化模型組比較中，有[X3]個蛋白表達上調，[X4]個蛋白表達下調。將這些差異表達蛋白進行功能注釋和分類，主要涉及脂質代謝、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、血管平滑肌細胞增殖與遷移等多個與動脈粥樣硬化發生發展密切相關的生物學過程。例如，載脂蛋白A-I（ApolipoproteinA-I，ApoA-I）在動脈粥樣硬化模型組中表達顯著下調，而在白馬合劑高劑量組中表達有所回升。ApoA-I是高密度脂蛋白（HDL）的主要載脂蛋白，具有促進膽固醇逆向轉運、抗氧化、抗炎等作用。其表達下調可能導致HDL功能受損，使膽固醇逆向轉運減少，從而促進動脈粥樣硬化的發生發展。而白馬合劑可能通過上調ApoA-I的表達，增強HDL的功能，發揮抗動脈粥樣硬化作用。又如，腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）在動脈粥樣硬化模型組中表達顯著上調，它是一種重要的促炎細胞因子，可激活炎癥細胞，釋放多種炎癥介質，促進血管內皮細胞損傷、單核細胞趨化和黏附，加速動脈粥樣硬化的發展。在白馬合劑高劑量組中，TNF-α表達下調，表明白馬合劑可能通過抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應，從而對動脈粥樣硬化起到治療作用。再如，超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）在動脈粥樣硬化模型組中表達下調，SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠清除體內的超氧陰離子自由基，保護細胞免受氧化損傷。其表達下調會導致體內氧化應激水平升高，促進動脈粥樣硬化的發生。而在白馬合劑高劑量組中，SOD表達上調，說明白馬合劑可能通過提高SOD的表達，增強機體的抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，進而發揮抗動脈粥樣硬化作用。通過對差異表達蛋白的鑒定和分析，初步揭示了白馬合劑治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制，這些差異表達蛋白可能成為評估動脈粥樣硬化病情和治療效果的潛在生物標志物，為進一步研究中藥治療動脈粥樣硬化提供了新的靶點和思路。6.3關鍵蛋白的功能富集與通路分析運用DAVID（DatabaseforAnnotationVisualizationandIntegratedDiscovery）數據庫對篩選出的關鍵差異表達蛋白進行功能富集分析，包括基因本體（GeneOntology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路分析。GO分析從生物過程（BiologicalProcess，BP）、細胞組分（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個層面進行。在生物過程方面，關鍵蛋白主要富集在脂質代謝過程、炎癥反應調節、氧化還原過程、細胞凋亡調控、血管平滑肌細胞增殖與遷移的調控等生物過程。例如，在脂質代謝過程中，涉及脂肪酸代謝、膽固醇代謝、甘油三酯代謝等多個環節，這些過程的異常與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。在炎癥反應調節方面，關鍵蛋白參與了細胞因子介導的信號通路、趨化因子的產生與作用、炎癥細胞的活化與募集等過程，表明炎癥反應在動脈粥樣硬化中起著關鍵作用。在細胞組分方面，關鍵蛋白主要分布在細胞膜、細胞外基質、線粒體、細胞核等細胞結構中。其中，細胞膜上的關鍵蛋白可能參與細胞間的信號傳遞、物質交換等過程，細胞外基質中的關鍵蛋白與維持血管壁的結構和功能密切相關，線粒體中的關鍵蛋白則可能參與能量代謝和氧化應激反應，細胞核中的關鍵蛋白可能參與基因表達的調控。在分子功能方面，關鍵蛋白主要具有酶活性、結合活性、轉運活性、信號傳導活性等。例如，一些關鍵蛋白具有氧化還原酶活性，參與氧化應激反應；一些關鍵蛋白具有轉錄因子活性，調控基因的表達；一些關鍵蛋白具有細胞因子受體結合活性，參與炎癥信號的傳導。KEGG通路分析結果顯示，關鍵蛋白主要參與了多條與動脈粥樣硬化相關的信號通路，如Toll樣受體信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、膽固醇代謝通路等。Toll樣受體信號通路是機體天然免疫的重要組成部分，當Toll樣受體被病原體相關分子模式或損傷相關分子模式激活后，可通過一系列信號轉導過程，激活NF-κB等轉錄因子，促進炎癥因子的表達，從而引發炎癥反應。在動脈粥樣硬化中，Toll樣受體信號通路的異常激活可導致炎癥反應失控，加速動脈粥樣硬化的發展。而白馬合劑可能通過調節Toll樣受體信號通路，抑制炎癥因子的表達，減輕炎癥反應。NF-κB信號通路在炎癥反應、細胞增殖、凋亡等過程中發揮著關鍵作用。在動脈粥樣硬化中，多種因素如氧化應激、炎癥因子等可激活NF-κB信號通路，導致炎癥因子、趨化因子等的表達增加，促進單核細胞趨化、黏附，平滑肌細胞增殖等，進而加速動脈粥樣硬化的進程。白馬合劑可能通過抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的產生，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用。MAPK信號通路參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡以及應激反應等多種生物學過程。在動脈粥樣硬化中，MAPK信號通路可被多種刺激激活，如生長因子、細胞因子、氧化應激等，激活后的MAPK信號通路可調節相關基因的表達，促進血管平滑肌細胞增殖、遷移，炎癥細胞浸潤等，推動動脈粥樣硬化的發展。白馬合劑可能通過調節MAPK信號通路，抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，減輕炎癥反應，從而對動脈粥樣硬化起到治療作用。PI3K/Akt信號通路在細胞存活、增殖、代謝等過程中具有重要作用。在動脈粥樣硬化中，PI3K/Akt信號通路的異常激活或抑制可影響血管內皮細胞的功能、平滑肌細胞的增殖與凋亡、炎癥反應等。例如，PI3K/Akt信號通路的激活可促進血管內皮細胞的存活和增殖，抑制細胞凋亡，維持血管內皮的完整性；同時，還可抑制炎癥因子的表達，減輕炎癥反應。白馬合劑可能通過調節PI3K/Akt信號通路，改善血管內皮細胞功能，抑制炎癥反應，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用。膽固醇代謝通路與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。膽固醇代謝異常，如膽固醇合成增加、轉運受阻、逆向轉運減少等，可導致膽固醇在血管壁沉積，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。關鍵蛋白在膽固醇代謝通路中參與膽固醇的合成、轉運、代謝等環節，白馬合劑可能通過調節膽固醇代謝通路相關關鍵蛋白的表達，改善膽固醇代謝，減少膽固醇在血管壁的沉積，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用。通過對關鍵蛋白的功能富集與通路分析，進一步揭示了白馬合劑治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制，為深入理解中藥復方的作用機制提供了重要的理論依據。這些關鍵蛋白和信號通路可能成為治療動脈粥樣硬化的潛在靶點，為新藥研發提供了新的方向。七、研究結果與討論7.1研究結果總結本研究通過一系列實驗，全面探究了白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠的治療作用及機制，取得了以下主要研究結果：對一般狀態的影響：在整個實驗過程中，正常對照組大鼠的飲食、精神、體重、毛發及大小便等均表現正常，無大鼠死亡。而模型對照組大鼠出現飲食減少、精神萎靡、體重增長緩慢、毛發干枯、大小便異常及一定數量的死亡情況。給予白馬合劑灌胃后，各劑量組大鼠的飲食、精神、體重、毛發及大小便情況均有不同程度的改善，死亡數量減少，且高劑量組的改善效果最為顯著。對血脂水平的影響：實驗第0周時，各組大鼠血脂水平無顯著差異。隨著實驗進行，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組和陽性對照組（阿司匹林組）大鼠血脂水平均有不同程度的改善。其中，白馬合劑高劑量組在降低TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平方面表現出較好的效果，且具有一定的劑量依賴性。對心功能的影響：模型對照組大鼠的心功能出現明顯減退，表現為LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV顯著增大，LVEF、LVFS顯著降低。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組大鼠的心功能指標均有不同程度的改善。白馬合劑高劑量組的改善效果最為顯著，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV與正常對照組相比無顯著差異，LVEF和LVFS顯著升高，接近正常對照組水平。對頸動脈斑塊血流動力學的影響：模型對照組大鼠頸動脈斑塊處的血流動力學發生明顯改變，表現為Vs、Vd、Vm顯著降低，PI和RI顯著升高，Vs/Vd也顯著升高。與模型對照組相比，白馬合劑各劑量組大鼠的血流動力學參數均有不同程度的改善。白馬合劑高劑量組的改善效果最為顯著，Vs、Vd、Vm與正常對照組相比無顯著差異，PI、RI和Vs/Vd顯著降低，接近正常對照組水平。對腹主動脈蛋白組的影響：通過蛋白組學實驗技術，共篩選出[X]個差異表達蛋白。功能注釋和分類表明，這些蛋白主要涉及脂質代謝、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、血管平滑肌細胞增殖與遷移等多個與動脈粥樣硬化發生發展密切相關的生物學過程。關鍵蛋白的功能富集與通路分析顯示，其主要參與了Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路、膽固醇代謝通路等多條與動脈粥樣硬化相關的信號通路。7.2結果討論與機制探討本研究結果表明，白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠具有顯著的治療作用，其作用機制可能涉及多個方面。調節血脂水平：血脂異常是動脈粥樣硬化發生發展的關鍵危險因素之一，本研究中模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，這與動脈粥樣硬化的病理特征相符。而給予白馬合劑治療后，各劑量組大鼠血脂水平均有不同程度的改善，高劑量組效果尤為顯著。這可能是因為白馬合劑中的多種中藥成分協同作用，調節了脂質代謝相關酶的活性，影響了脂蛋白的合成與代謝。例如，方中的澤瀉具有利水滲濕的功效，現代研究表明其可能通過抑制肝臟中膽固醇的合成，促進膽固醇的排泄，從而降低血脂水平。黃芪可調節脂質代謝，提高脂蛋白酯酶活性，促進甘油三酯的分解代謝，降低血液中TG含量。這些成分相互配合，共同調節血脂，減少脂質在血管壁的沉積，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用。改善心功能：動脈粥樣硬化可導致心臟后負荷增加，心肌受損，進而影響心功能。本研究中模型對照組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV顯著增大，LVEF、LVFS顯著降低，表明心功能明顯減退。白馬合劑各劑量組大鼠心功能指標均有不同程度改善，高劑量組接近正常對照組水平。其作用機制可能與白馬合劑調節血脂水平、減輕炎癥反應、抑制氧化應激等因素有關。調節血脂水平可減少脂質在血管壁的沉積，降低血管阻力，減輕心臟后負荷。減輕炎癥反應可減少炎癥因子對心肌的損傷，抑制氧化應激可減少自由基對心肌細胞的損害，從而保護心臟功能。此外，白馬合劑中的一些成分可能直接作用于心肌細胞，增強心肌收縮力，改善心臟的舒張和收縮功能。改善頸動脈斑塊血流動力學：頸動脈斑塊血流動力學的改變與動脈粥樣硬化的發展密切相關，可影響局部血流灌注，增加心腦血管事件的風險。本研究中模型對照組大鼠Vs、Vd、Vm顯著降低，PI和RI顯著升高，Vs/Vd也顯著升高，說明頸動脈斑塊處血流動力學異常。白馬合劑各劑量組大鼠血流動力學參數均有不同程度改善，高劑量組效果顯著。這可能是因為白馬合劑通過調節血脂水平，減少脂質在血管壁的沉積，減輕血管壁的炎癥反應，改善血管內皮細胞功能，從而使血管彈性增加，阻力降低，血流速度加快，改善了頸動脈斑塊的血流動力學。例如，白馬合劑中的當歸、川芎等具有活血化瘀的作用，可改善血液循環，增加血管的通透性和彈性，促進血流灌注。影響腹主動脈蛋白組：通過蛋白組學研究，發現了[X]個差異表達蛋白，這些蛋白涉及脂質代謝、炎癥反應、氧化應激等多個生物學過程。在脂質代謝方面，ApoA-I等蛋白的表達變化可能影響HDL的功能，進而影響膽固醇的逆向轉運。在炎癥反應方面，TNF-α等蛋白的表達改變表明白馬合劑可能通過抑制炎癥因子的表達，減輕炎癥反應。在氧化應激方面，SOD等蛋白的表達變化說明白馬合劑可能增強機體的抗氧化能力，減輕氧化應激損傷。關鍵蛋白的功能富集與通路分析顯示，其參與了Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等多條與動脈粥樣硬化相關的信號通路。白馬合劑可能通過調節這些信號通路，干預動脈粥樣硬化的發生發展過程。例如，調節Toll樣受體信號通路，抑制炎癥因子的表達；調節NF-κB信號通路，減少炎癥反應；調節MAPK信號通路，抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移；調節PI3K/Akt信號通路，改善血管內皮細胞功能。這些信號通路之間相互關聯，共同調節動脈粥樣硬化的病理過程，而白馬合劑可能通過多靶點、多通路的作用方式，發揮其抗動脈粥樣硬化的作用。7.3研究的局限性與展望本研究在探究白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈蛋白組影響及作用機制方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。在實驗動物選擇上，本研究選用SD大鼠作為實驗對象。雖然大鼠具有繁殖能力強、飼養成本低、實驗操作方便等優點，且能在一定程度上模擬人類動脈粥樣硬化的病理過程，但與人類在生理結構、代謝特點和基因背景等方面仍存在差異。例如，大鼠的血脂代謝途徑與人類不完全相同，其高密度脂蛋白代謝更為活躍，這可能影響研究結果向人類的外推。未來研究可考慮選用與人類更為相似的動物模型，如小型豬或非人靈長類動物，以提高研究結果的臨床轉化價值。在觀察指標方面，盡管本研究檢測了血脂水平、心功能、頸動脈斑塊血流動力學以及腹主動脈蛋白組等多個指標，但仍存在一定局限性。例如，在蛋白組學研究中，僅對腹主動脈組織進行了分析，未能全面考慮其他相關組織和器官中蛋白質表達的變化。此外，對于一些與動脈粥樣硬化密切相關的指標，如血管內皮功能、血小板功能等，未進行深入檢測。未來研究可進一步拓展觀察指標的范圍，全面深入地探究白馬合劑的作用機制。從實驗周期來看，本研究的實驗周期為12周。雖然在這個時間段內能夠觀察到動脈粥樣硬化模型的形成以及白馬合劑的治療效果，但動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，其病程較長。較短的實驗周期可能無法完全反映白馬合劑在長期治療過程中的作用和潛在不良反應。后續研究可適當延長實驗周期，觀察白馬合劑的長期療效和安全性。基于本研究的局限性，未來研究可從以下幾個方向展開：一是深入研究白馬合劑中各成分的協同作用機制，明確各成分在治療動脈粥樣硬化中的具體作用和相互關系，為優化方劑組成提供理論依據。二是進一步探索白馬合劑對動脈粥樣硬化相關信號通路的調控機制，不僅關注本研究中涉及的信號通路，還可研究其他潛在的信號通路，全面揭示其作用機制。三是開展臨床研究，驗證白馬合劑在人體中的治療效果和安全性，為其臨床應用提供更直接的證據。通過以上研究，有望進一步揭示白馬合劑治療動脈粥樣硬化的作用機制，為動脈粥樣硬化的防治提供更有效的治療手段和藥物。八、結論與建議8.1研究結論概括本研究通過建立動脈粥樣硬化大鼠模型，全面系統地探究了白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠的治療作用及機制。研究結果表明，白馬合劑對動脈粥樣硬化大鼠具有顯著的治療效果，其作用機制涉及多個層面。在一般狀態