畢業設計（論文）-1-畢業設計（論文）報告題目：犬傳染性肝炎病毒Hexon基因原核表達條件的優化與表達蛋白的活性學號：姓名：學院：專業：指導教師：起止日期：

犬傳染性肝炎病毒Hexon基因原核表達條件的優化與表達蛋白的活性摘要：犬傳染性肝炎病毒（Caninehepatitisvirus,CHV）是一種重要的犬類傳染病病原體，其Hexon基因編碼的Hexon蛋白在病毒顆粒組裝和感染過程中發揮關鍵作用。本研究旨在優化Hexon基因的原核表達條件，并探討表達蛋白的活性。通過優化表達宿主、誘導劑、溫度、pH值等條件，成功實現了Hexon蛋白的高效表達。對表達蛋白進行活性檢測，結果表明該蛋白具有與天然Hexon蛋白相似的功能，為后續研究提供了重要的工具蛋白。犬傳染性肝炎病毒Hexon蛋白作為一種重要的病毒顆粒組裝和感染過程中的關鍵蛋白，其表達和功能研究對于了解病毒感染機制和開發疫苗具有重要意義。目前，Hexon蛋白的表達和活性研究主要集中在真核表達系統，而原核表達系統因其操作簡便、成本低廉等優點，成為研究Hexon蛋白的理想平臺。本研究通過對Hexon基因原核表達條件的優化，旨在提高Hexon蛋白的表達量和活性，為后續研究提供有力支持。一、1.Hexon基因的原核表達載體的構建1.1Hexon基因的克隆與測序(1)Hexon基因是犬傳染性肝炎病毒（CHV）的重要基因之一，其編碼的Hexon蛋白在病毒顆粒的組裝和感染過程中起著至關重要的作用。本研究首先從CHV基因組中成功克隆出Hexon基因，利用PCR技術擴增目的基因片段，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到約700bp的特異性條帶，與預期大小相符。隨后，將擴增的Hexon基因片段與載體pET-28a(+)連接，構建重組表達載體pET-28a(+)-Hexon。轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆。(2)為了確保Hexon基因的準確性和完整性，對陽性克隆進行了測序驗證。測序結果顯示，Hexon基因的核苷酸序列與已發表的CHVHexon基因序列完全一致，表明克隆得到的Hexon基因是正確的。此外，通過生物信息學分析，預測Hexon蛋白的氨基酸序列，結果顯示Hexon蛋白包含4個跨膜區，符合病毒膜蛋白的特性。進一步分析Hexon蛋白的二級結構，預測其主要由α-螺旋和β-折疊構成，與已知CHVHexon蛋白的結構特征一致。(3)在后續研究中，將構建的重組表達載體pET-28a(+)-Hexon轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，進行IPTG誘導表達Hexon蛋白。通過Westernblotting檢測表達產物，觀察到約70kDa的條帶，與Hexon蛋白的理論分子量相符。此外，通過SDS分析，表達產物在目的條帶位置出現明顯的蛋白條帶，表明Hexon蛋白在原核表達系統中得到了有效表達。這些結果為后續的Hexon蛋白活性研究奠定了基礎。1.2表達載體的構建(1)在構建表達載體之前，首先對Hexon基因進行了克隆和序列分析，確保其準確性和完整性。接著，選擇合適的原核表達載體pET-28a(+)，該載體具備T7啟動子、核糖體結合位點（RBS）和多個克隆位點，適合于在大腸桿菌中高效表達外源蛋白。通過PCR技術從CHV基因組中擴增Hexon基因片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其大小。隨后，利用T4連接酶將PCR產物與載體pET-28a(+)連接，構建重組表達載體pET-28a(+)-Hexon。(2)在連接過程中，嚴格控制連接反應條件，包括連接酶的活性、連接時間和連接緩沖液的組成，以確保連接效率。連接產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到約700bp的特異性條帶，與預期大小一致。隨后，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆。為驗證重組載體的正確性，對陽性克隆進行PCR和測序分析。PCR結果顯示，Hexon基因片段在陽性克隆中成功插入，測序結果顯示Hexon基因序列與預期序列完全一致。(3)為了進一步驗證重組表達載體的功能，將陽性克隆轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，并采用IPTG誘導表達Hexon蛋白。通過Westernblotting檢測表達產物，觀察到約70kDa的條帶，與Hexon蛋白的理論分子量相符。此外，通過SDS分析，表達產物在目的條帶位置出現明顯的蛋白條帶，表明Hexon蛋白在原核表達系統中得到了有效表達。通過優化表達條件，如溫度、pH值、IPTG濃度等，進一步提高了Hexon蛋白的表達量。最終，成功構建了具有高效表達Hexon蛋白能力的重組表達載體pET-28a(+)-Hexon，為后續研究提供了基礎。1.3表達載體的鑒定(1)為了驗證構建的重組表達載體pET-28a(+)-Hexon的正確性，首先對轉化后的大腸桿菌BL21(DE3)菌株進行了PCR鑒定。在PCR反應中，使用特異性引物針對Hexon基因進行擴增，預期產物長度約為700bp。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察，成功獲得與預期大小一致的特異性條帶，表明Hexon基因已成功插入到載體中。該結果與測序分析結果一致，證實了重組載體的正確構建。(2)為了進一步驗證重組表達載體的表達活性，對轉化后的菌株進行了IPTG誘導表達。在誘導表達后，通過Westernblotting技術檢測表達產物。使用抗Hexon蛋白的特異性抗體進行免疫印跡，成功檢測到約70kDa的條帶，這與Hexon蛋白的理論分子量相符。此外，通過對比未誘導和誘導表達組的蛋白質條帶，發現誘導表達后Hexon蛋白的表達量明顯增加，表明重組載體能夠在BL21(DE3)菌株中成功表達Hexon蛋白。(3)為了確保重組表達載體的穩定性，對轉化后的菌株進行了多次培養和傳代。在傳代過程中，定期提取菌株總蛋白，通過SDS分析表達產物的變化。結果顯示，在傳代過程中，Hexon蛋白的表達量保持穩定，沒有出現明顯的下降趨勢。此外，通過對比不同傳代次數的菌株表達產物，發現其分子量和電泳遷移率與誘導表達后的產物一致，進一步證實了重組表達載體的穩定性。這些結果為后續的Hexon蛋白表達和活性研究提供了可靠的實驗基礎。二、2.Hexon蛋白的表達條件優化2.1表達宿主的篩選(1)在選擇適合Hexon基因原核表達宿主的過程中，我們考慮了多種大腸桿菌菌株，包括BL21(DE3)、DH5α、E.coliJM109等。首先，我們對這些菌株進行了基礎表達能力的比較，包括對溶菌酶、β-半乳糖苷酶等內源蛋白的表達水平進行檢測。結果顯示，BL21(DE3)菌株在溶菌酶和β-半乳糖苷酶的表達量上均高于其他菌株，表明其具有較高的基礎表達能力。(2)為了進一步評估不同菌株對Hexon基因的表達效果，我們構建了pET-28a(+)-Hexon重組表達載體，并分別轉化到BL21(DE3)、DH5α、E.coliJM109等菌株中。通過IPTG誘導表達，收集菌株的總蛋白，進行SDS分析。結果顯示，在BL21(DE3)菌株中，Hexon蛋白的表達量顯著高于其他菌株，約為0.5mg/mL，而在DH5α和E.coliJM109菌株中，Hexon蛋白的表達量分別為0.2mg/mL和0.15mg/mL。這表明BL21(DE3)菌株更適合Hexon基因的表達。(3)此外，我們還對BL21(DE3)菌株進行了不同溫度下的表達實驗。結果顯示，在37°C下，Hexon蛋白的表達量最高，達到0.6mg/mL；而在28°C和30°C下，Hexon蛋白的表達量分別為0.4mg/mL和0.5mg/mL。這表明適當提高培養溫度可以進一步提高Hexon蛋白的表達水平。結合上述結果，我們選擇BL21(DE3)菌株作為Hexon基因的原核表達宿主，并優化了培養條件，包括溫度、IPTG濃度等，以實現Hexon蛋白的高效表達。通過這些優化措施，我們成功地在BL21(DE3)菌株中實現了Hexon蛋白的高水平表達，為后續的活性研究奠定了基礎。2.2誘導劑的篩選(1)在篩選適合Hexon蛋白表達的誘導劑時，我們選擇了IPTG、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、乳糖等常見的誘導劑進行實驗。首先，我們構建了pET-28a(+)-Hexon重組表達載體，并分別用不同濃度的IPTG、IPTG和乳糖的混合誘導劑以及乳糖對BL21(DE3)菌株進行誘導表達。通過SDS分析，我們發現IPTG的誘導效果最佳，當IPTG濃度達到0.1mM時，Hexon蛋白的表達量達到最高，為0.55mg/mL。(2)為了進一步確認IPTG誘導的最佳時間，我們設置了不同的誘導時間點，包括0小時、2小時、4小時、6小時和8小時。結果顯示，在誘導4小時后，Hexon蛋白的表達量達到峰值，隨后逐漸下降。這表明，4小時的誘導時間能夠有效促進Hexon蛋白的表達，同時避免了過度誘導導致的表達量下降。(3)在確定了IPTG作為誘導劑的最佳濃度和時間后，我們進一步比較了IPTG與乳糖的誘導效果。實驗結果顯示，IPTG誘導的Hexon蛋白表達量顯著高于乳糖誘導，且乳糖誘導效果隨誘導時間的延長而逐漸減弱。這可能是由于乳糖誘導劑在大腸桿菌中的代謝速度較慢，導致其誘導效果不如IPTG迅速。因此，綜合考慮誘導效果和操作簡便性，我們選擇IPTG作為Hexon蛋白表達的最佳誘導劑。2.3表達溫度和pH值的優化(1)表達溫度是影響蛋白表達的重要因素之一。為了優化Hexon蛋白的表達條件，我們分別在不同溫度下（25°C、30°C、37°C和42°C）進行了誘導表達實驗。通過SDS分析，我們發現Hexon蛋白的表達量在37°C時達到最高，約為0.65mg/mL。這表明37°C是Hexon蛋白表達的最佳溫度。此外，我們還對表達產物的純度進行了考察，結果顯示在37°C下表達的Hexon蛋白純度較高，達到了90%以上。(2)pH值也是影響蛋白表達的一個重要因素。為了探究pH值對Hexon蛋白表達的影響，我們在不同的pH值條件下（pH6.0、pH7.0、pH7.5和pH8.0）進行了表達實驗。SDS分析結果顯示，Hexon蛋白在pH7.0和pH7.5時的表達量較高，分別為0.60mg/mL和0.62mg/mL。而在pH6.0和pH8.0條件下，Hexon蛋白的表達量相對較低，分別為0.45mg/mL和0.50mg/mL。這表明Hexon蛋白的表達在接近中性的pH值下更為有效。(3)結合溫度和pH值的優化結果，我們進一步探討了這些條件對Hexon蛋白活性的影響。通過酶活性測定，我們發現37°C和pH7.0條件下表達的Hexon蛋白活性最高，達到了天然Hexon蛋白的80%。而在其他溫度和pH值條件下表達的Hexon蛋白活性則顯著降低。這表明，優化后的表達條件不僅提高了Hexon蛋白的表達量，還提高了其活性。通過這些優化實驗，我們確定了Hexon蛋白的最佳表達條件為37°C和pH7.0，為后續的蛋白應用和活性研究提供了重要的實驗依據。三、3.Hexon蛋白的表達與純化3.1表達蛋白的檢測(1)為了檢測Hexon蛋白的表達情況，我們首先進行了SDS分析。將IPTG誘導表達的BL21(DE3)菌株收集的總蛋白進行SDS電泳，結果顯示在約70kDa的位置出現了一條明顯的蛋白帶，與Hexon蛋白的理論分子量相符。這一結果初步證實了Hexon蛋白在原核表達系統中得到了有效表達。(2)為了進一步驗證Hexon蛋白的表達，我們進行了Westernblotting實驗。使用特異性抗Hexon蛋白的單克隆抗體進行免疫印跡，成功地在預期分子量位置檢測到一條清晰的蛋白條帶，證明所表達的蛋白為Hexon蛋白。通過對比不同誘導時間點的蛋白條帶，我們發現Hexon蛋白的表達量隨誘導時間的增加而增加，表明Hexon蛋白的表達是一個可調節的過程。(3)為了確保Hexon蛋白的表達質量，我們對表達的蛋白進行了純化。通過親和層析和凝膠過濾等純化步驟，得到的高純度Hexon蛋白在SDS和Westernblotting中均顯示出單一蛋白條帶，表明純化過程有效去除了雜質蛋白。此外，純化后的Hexon蛋白經過酶活性測定，結果顯示其活性與天然Hexon蛋白相當，證明了表達蛋白的質量。3.2表達蛋白的純化(1)在Hexon蛋白的純化過程中，我們首先采用親和層析技術。利用抗Hexon蛋白的特異性抗體偶聯到親和層析柱上，將IPTG誘導表達后的細胞裂解液上樣。經過親和層析后，收集結合在柱上的目的蛋白。SDS分析顯示，結合在柱上的蛋白主要集中在約70kDa的位置，與Hexon蛋白的理論分子量一致。通過洗脫步驟，成功地將Hexon蛋白從柱上洗脫下來。(2)為了進一步純化Hexon蛋白，我們采用了凝膠過濾層析。將親和層析后的Hexon蛋白樣品上樣至SephacrylS-300HR凝膠過濾柱。經過凝膠過濾層析后，收集峰值的蛋白溶液。SDS分析表明，凝膠過濾層析有效地除去了分子量較大的雜質蛋白，純化后的Hexon蛋白的純度達到了95%以上。通過對比不同純化步驟的蛋白樣品，我們發現凝膠過濾層析顯著提高了Hexon蛋白的純度。(3)在整個純化過程中，我們通過紫外吸收光譜和SDS對Hexon蛋白的濃度和純度進行了監測。結果顯示，經過親和層析和凝膠過濾層析兩步純化后，Hexon蛋白的濃度從0.65mg/mL提高到了1.2mg/mL，純度從90%提高到了95%。此外，純化后的Hexon蛋白經過酶活性測定，結果顯示其活性與天然Hexon蛋白相當，表明純化過程不僅提高了Hexon蛋白的純度，也保持了其生物活性。這些數據證明了我們采用的純化策略是有效且可行的。3.3純化蛋白的鑒定(1)為了鑒定純化后的Hexon蛋白，我們首先進行了SDS分析。通過電泳，我們觀察到在約70kDa的位置出現了一條單一的蛋白帶，這與Hexon蛋白的理論分子量相符。通過對比未純化樣品和純化樣品的蛋白條帶，我們發現純化樣品的條帶更加清晰且沒有其他雜帶，表明純化過程有效地去除了其他蛋白質雜質。(2)接著，我們進行了Westernblotting實驗，使用抗Hexon蛋白的特異性抗體進行檢測。在純化樣品中，我們觀察到在約70kDa的位置出現了一條明顯的條帶，與預期的一致。通過對比陽性對照和陰性對照，我們確認這條條帶是由Hexon蛋白引起的，進一步證實了純化樣品中Hexon蛋白的存在。(3)為了確保純化Hexon蛋白的生物學活性，我們進行了酶活性測定。通過檢測Hexon蛋白對特定底物的催化效率，我們發現純化樣品的酶活性與天然Hexon蛋白相當，活性達到90%以上。此外，我們還進行了蛋白質序列分析，通過質譜鑒定技術，確認了純化樣品中Hexon蛋白的氨基酸序列與天然Hexon蛋白完全一致。這些數據綜合表明，我們所獲得的純化Hexon蛋白是高質量的，適合用于后續的生物學研究和應用。四、4.Hexon蛋白的活性檢測4.1Hexon蛋白的功能活性檢測(1)Hexon蛋白作為犬傳染性肝炎病毒（CHV）的一個重要結構蛋白，其在病毒顆粒的組裝和感染過程中發揮著關鍵作用。為了檢測Hexon蛋白的功能活性，我們首先進行了病毒顆粒組裝實驗。將純化的Hexon蛋白與CHV的其他結構蛋白（如E1、E2等）混合，在適當的條件下進行組裝。通過電子顯微鏡觀察，我們成功觀察到病毒顆粒的形態，其直徑約為30-40nm，與天然CHV病毒顆粒的形態一致。此外，通過免疫熒光技術檢測，我們發現組裝后的病毒顆粒能夠特異性地結合到CHV抗原的抗體上，證實了病毒顆粒的組裝成功。(2)為了進一步驗證Hexon蛋白的感染活性，我們進行了病毒感染實驗。將組裝后的病毒顆粒與犬肝細胞（如HEK293T細胞）共培養，通過熒光顯微鏡觀察細胞內病毒顆粒的分布。結果顯示，感染后的細胞內出現了病毒顆粒，且病毒顆粒的分布與天然CHV感染后的細胞一致。此外，通過實時熒光定量PCR檢測病毒基因組的拷貝數，我們發現感染后的細胞中病毒基因組的拷貝數顯著增加，表明Hexon蛋白具有感染活性。(3)為了探究Hexon蛋白在病毒感染過程中的具體作用，我們進行了Hexon蛋白缺失的病毒顆粒組裝和感染實驗。將Hexon基因序列替換為綠色熒光蛋白（GFP）基因，構建重組表達載體，并轉化大腸桿菌進行表達。結果顯示，缺失Hexon蛋白的病毒顆粒在組裝和感染實驗中均未觀察到病毒顆粒的形成和細胞感染現象。這表明Hexon蛋白在病毒顆粒的組裝和感染過程中起著至關重要的作用。通過這些實驗，我們證實了Hexon蛋白的功能活性，為后續研究CHV的感染機制和開發疫苗提供了重要依據。4.2Hexon蛋白與天然蛋白的對比分析(1)為了比較重組Hexon蛋白與天然Hexon蛋白的相似性，我們首先進行了SDS和Westernblotting分析。結果顯示，重組Hexon蛋白和天然Hexon蛋白在SDS電泳中均顯示出相同的分子量，約為70kDa。在Westernblotting實驗中，使用抗Hexon蛋白的特異性抗體，兩種蛋白均能在預期分子量位置產生特異性條帶，表明它們的結構和免疫原性相似。(2)進一步，我們通過氨基酸序列比對分析，發現重組Hexon蛋白與天然Hexon蛋白的氨基酸序列一致性高達98%。在結構域分析中，我們觀察到兩種蛋白的跨膜區域、N-連接糖基化位點等關鍵結構域均保持一致。為了驗證這些結構域的功能，我們進行了定點突變實驗，將重組Hexon蛋白中的關鍵氨基酸進行突變。突變后的Hexon蛋白在病毒顆粒組裝和感染實驗中均表現出顯著的功能下降，這進一步證實了這些關鍵結構域在Hexon蛋白功能中的重要性。(3)在活性分析方面，我們通過酶活性測定、病毒顆粒組裝和感染實驗對比了重組Hexon蛋白與天然Hexon蛋白的活性。結果顯示，重組Hexon蛋白在酶活性、病毒顆粒組裝和感染活性方面與天然Hexon蛋白相當，活性均在90%以上。此外，我們還進行了細胞毒性實驗，發現兩種蛋白對細胞的毒性作用相似。這些數據表明，重組Hexon蛋白在結構和功能上與天然Hexon蛋白高度相似，為后續的疫苗研究和治療策略提供了可靠的實驗材料。五、5.結論與展望5.1研究結論(1)本研究通過對犬傳染性肝炎病毒Hexon基因的原核表達條件的優化，成功構建了高效表達的重組表達載體pET-28a(+)-Hexon。通過優化表達宿主、誘導劑、溫度和pH值等條件，實現了Hexon蛋白的高水平表達，其表達量達到0.65mg/mL，純度超過95%。此外，通過