第43講第一課時基因工程的基本工具與操作程序高考總復習優化設計GAOKAOZONGFUXIYOUHUASHEJI2026素養目標考點一重組DNA技術的基本工具夯實基礎?精研教材1.基因工程的概念理解

目的基因基因重組受體分子2.基因工程的基本工具(1)限制性內切核酸酶(限制酶)——“分子手術刀”核苷酸序列磷酸二酯鍵一種特定的脫氧核苷酸序列黏性末端(2)DNA連接酶——“分子縫合針”(3)基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”質粒穩定保存限制酶切割位點3.限制酶的選擇原則(1)根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類。①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶,以便將目的基因“切出”,如圖可選擇PstⅠ。②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶,防止破壞目的基因,如圖不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒,如圖也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種限制酶的切割位點,而且這兩種限制酶切割后不會完全破壞標記基因)。(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類。

(3)根據Ti質粒的T-DNA片段選擇限制酶,圖中甲、乙、丁Ti質粒均不宜選取,丙Ti質粒宜選取(設切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。4.標記基因的作用標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞。教材深挖1.(選擇性必修3

P71旁欄思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么?2.(選擇性必修3

P74拓展應用1)限制酶來源于原核生物,為什么不切割自身的DNA分子?切割外源DNA以保證自身安全,防止外來病原物的危害

原核生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制,其DNA分子中不具備這種限制酶的識別序列,或通過甲基化酶將甲基轉移到限制酶所識別序列的堿基上,使限制酶不能將其切開易錯排查1.用某種限制性內切核酸酶完全酶切環狀質粒后,出現3個條帶,表明該質粒上一定至少有3個被該酶切開的位置。(

)2.用限制性內切核酸酶和DNA連接酶構建重組質粒。(

)3.切割質粒的限制性內切核酸酶均特異性地識別6個核苷酸序列。(

)√√×思維探究?考教銜接(根據2021·全國乙卷、2021·遼寧卷、2020·江蘇卷、2019·江蘇卷、2018·全國Ⅱ卷、2020·北京卷情境設計)用DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性,創造出更符合人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性內切核酸酶的切割位點如圖所示。回答下列問題。(1)EcoRⅠ是一種

酶,它通過識別特定的

切割特定位點。經SmaⅠ和EcoRⅤ切割出來的載體為

末端。

(2)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中

酶切割后的DNA片段更適合用T4DNA連接酶連接。DNA連接酶催化目的基因片段與質粒載體片段之間形成的化學鍵是

。

限制性內切核酸(或限制)

核苷酸序列

平SmaⅠ、EcoRⅤ

磷酸二酯鍵(3)DNA重組技術中所用的質粒載體具有一些特征。如質粒DNA分子上有復制原點,可以保證質粒在受體細胞中能

;質粒DNA分子上有

,便于外源DNA插入;質粒DNA分子上有標記基因(如某種抗生素抗性基因),利用抗生素可篩選出含質粒載體的宿主細胞,方法是

。

自我復制限制酶切割位點用含有該抗生素的培養基培養宿主細胞,能夠存活的即為含有質粒載體的宿主細胞(4)若某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5'末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱為甲),并將其插入質粒P0,構建了真核表達載體P1,其部分結構和酶切位點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。據圖推斷,該團隊在將甲插入質粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是

。使用這兩種酶進行酶切是為了保證

,也是為了保證

。

E1和E4甲的完整甲與載體正確連接(5)下圖C1酶基因以B鏈為轉錄模板鏈,轉錄時mRNA自身的延伸方向為5'端→3'端。為了使C1酶基因按照正確的方向與已被酶切的HT質粒連接,克隆C1酶基因時在其兩端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位點。該基因內部沒有這兩種酶切位點。圖中酶切位點1和2所對應的酶分別是

。

BamHⅠ、SmaⅠ(順序不能調換)考法練透?素養提升考法一

基因工程的基本工具1.(2025·云南模擬)研究人員欲將某動物體內基因X導入大腸桿菌的質粒中保存,質粒含有抗性基因與酶切位點,目的基因兩端酶切位點如下圖所示,下列敘述錯誤的是(

)A.使用HindⅢ和XbaⅠ進行酶切能避免基因X與質粒反向連接B.目的基因X與質粒連接可使用E.coliDNA連接酶C.Ca2+處理大腸桿菌能降低細胞膜通透性,有利于重組質粒導入受體細胞D.含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長答案

C

解析

分析題圖可知,使用HindⅢ和XbaⅠ進行酶切會產生不同的黏性末端,故能避免基因X與質粒反向連接,A項正確;目的基因X與質粒用HindⅢ和XbaⅠ酶切會產生黏性末端,可使用E.coli

DNA連接酶,B項正確;用Ca2+處理大腸桿菌,能提高細胞膜的通透性,使細胞處于感受態即能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,有利于重組質粒導入受體細胞,C項錯誤;分析題圖可知,重組質粒上含有氨芐青霉素抗性基因,故含有基因X的大腸桿菌能在氨芐青霉素選擇培養基中生長,D項正確?？挤ǘ?/p>

基因工程載體的應用2.(2024·遼寧丹東模擬)圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖,載體質粒P0具有四環素抗性基因(TetR)和氨芐青霉素抗性基因(AmpR)。請回答下列問題。圖1(1)EcoRⅤ酶切位點為…GAT↓ATC……CTA↑TAG…,EcoRⅤ酶切出來的線性載體P1為

末端。

(2)用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增獲得的目的基因片段,其兩端各自帶有一個腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理,在兩端各添加了一個堿基為_____________的脫氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在

酶作用下,形成重組質粒P3。

平

胸腺嘧啶(T)

DNA連接(3)為篩選出含有重組質粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板進行篩選,得到A、B、C三類菌落,其生長情況如下表(“+”代表生長,“-”代表不生長)。根據表中結果判斷,應選擇的菌落是

(填表中字母)類,另外兩類菌落質粒導入情況分別是

、

。

平板類型菌落類型ABC無抗生素+++氨芐青霉素++-四環素+--氨芐青霉素+四環素+--BA類菌落含有P0

C類菌落未轉入質粒

(4)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒,擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置,PCR鑒定時應選擇的一對引物是

。某學生嘗試用圖中另外一對引物,結果從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段,原因是

。

圖2乙、丙

目的基因反向連接解析

(1)從圖中可以看出,EcoRⅤ酶切出來的載體質粒為平末端。(2)由題意可知,目的基因片段的兩端各有一個腺嘌呤脫氧核苷酸,由于載體P1為平末端,所以載體P1的兩端應該各添加一個胸腺嘧啶脫氧核苷酸,這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來。(3)由題意可知,構建重組質粒時四環素抗性基因被破壞,所以導入目的基因的菌落只能在沒有抗生素或含有氨芐青霉素的培養基中存活,應該選B類菌落。A類菌落能在表中條件下存活,說明導入的是P0質粒。C類菌落只能在無抗生素的培養基中存活,說明C類菌落沒有導入質粒。(4)據圖分析,目的基因的外側鏈只能用丙作引物,內側鏈可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,則無論目的基因是否插入正確,都能通過PCR擴增大量目的基因,如果用乙、丙作為引物,當目的基因插入不正確(反向插入)時,則乙、丙兩引物都結合在外側,PCR不能正常進行,因此選用乙、丙作為引物可以進行RCR鑒定。若擴增出的DNA片段為400

bp,則正好是目的基因反向連接后,外側鏈用乙作引物,內側鏈用甲作引物擴增出的片段。考點二基因工程的基本操作程序夯實基礎?精研教材1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因:在基因工程的設計和操作中,用于改變

或獲得

等的基因。主要是指

的基因。

(2)篩選目的基因①從相關的已知

清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

②利用測序技術、

和序列比對工具等進行篩選。受體細胞性狀預期表達產物編碼蛋白質結構和功能序列數據庫(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕?。a.逆轉錄法:主要用于相對分子質量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板,借助逆轉錄酶合成雙鏈DNA,其過程如下:目的基因的mRNA

雙鏈DNA(目的基因)b.化學合成法:依據某一蛋白質的氨基酸序列,推測出其基因序列,然后直接合成目的基因,其過程如下:蛋白質的氨基酸序列

mRNA的核苷酸序列

目的基因的核苷酸序列

目的基因②利用PCR

和擴增

。

獲取目的基因引物脫氧核苷酸耐高溫溫度兩種引物耐高溫的DNA聚合酶指數形式瓊脂糖凝膠電泳③通過構建

來獲取目的基因。

2.基因表達載體的構建

基因工程的核心內容(1)構建基因表達載體的目的:使目的基因在受體細胞中

,并且可以

給下一代,并能夠

和發揮作用。

基因文庫穩定存在遺傳表達(2)基因表達載體的組成

(3)基因表達載體的構建過程

3.將目的基因導入受體細胞

該步驟未涉及堿基互補配對原則

生物類型受體細胞常用方法轉化過程植物體細胞花粉管通道法①用微量注射器直接注入

;

②借助花粉管通道進入

子房胚囊農桿菌轉化法生物類型受體細胞常用方法轉化過程動物

受精卵顯微注射技術生物類型受體細胞常用方法轉化過程微生物原核細胞感受態細胞法

能夠吸收外界DNA

Ca2+處理細胞↓感受態細胞↓基因表達載體與感受態細胞混合↓感受態細胞吸收DNA分子4.目的基因的檢測與鑒定

目的基因雜交帶易錯排查1.若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性內切核酸酶,則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定。(

)2.將抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株,其DNA檢測均含目的基因,抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNA。(

)3.可用抗原—抗體反應檢測抗體基因表達產物。(

)4.可利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導入受體細胞。(

)××√√思維探究?考教銜接PCR擴增過程如圖所示,若一個Bt毒蛋白基因在PCR中經過n輪循環,得到2n個DNA分子。(1)完善下表中相關內容:含引物的DNA分子數

含引物A(或B)的DNA分子數同時含兩種引物的DNA分子數消耗引物數量含不等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子數等長脫氧核苷酸鏈的DNA分子數

(2)要得到等長的雙鏈DNA分子,至少需要經過

次循環。

2n

2n-12n-22n+1-22n2n-2n3考法練透?素養提升考法一

基因工程的操作程序1.(2024·河北保定三模)番茄在低溫下運輸、儲存的過程中,容易出現凍傷,影響番茄的品質?？茖W家利用基因工程技術將AFPs抗凍基因轉入番茄植株,培育抗凍番茄。下列敘述錯誤的是(

)A.篩選與獲取AFPs抗凍基因是培育抗凍番茄的首要步驟B.基因表達載體中的啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點C.AFPs抗凍基因可通過農桿菌轉化法轉移至雙子葉植物細胞中D.抗凍番茄培育成功的標志是檢測出番茄細胞中含AFPs基因D解析

基因工程的基本操作程序包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒定,故篩選和獲取AFPs抗凍基因是培育抗凍番茄的首要步驟,A項正確;基因表達載體中的啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點,能控制轉錄的開始,B項正確;將目的基因導入植物細胞最常用的方法是農桿菌轉化法,C項正確;只有番茄具有抗凍性才能代表抗凍番茄培育成功,含有的AFPs基因若不表達,也不會形成抗凍番茄,D項錯誤。2.研究人員將GNA基因和ACA基因連接成融合基因后再與pBI121質粒載體結合并導入玉米細胞,最終獲得了抗蚜蟲玉米新品種,部分操作如圖所示。下列相關敘述錯誤的是(

)A.提取GNA基因和ACA基因至少需要兩種限制酶,①②過程均需要使用DNA連接酶B.為了保證基因轉錄方向正確,需要用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體C.只要檢測出玉米細胞中含有融合基因,就說明抗蚜蟲玉米培育成功D.在加入了卡那霉素的培養基上存活下來的玉米細胞可能成功導入了重組載體答案

C

解析

GNA和ACA基因兩側的酶切位點不同,因此提取GNA基因和ACA基因至少需要兩種限制酶,①過程為獲得融合基因,②過程為構建基因表達載體,兩過程均需要使用DNA連接酶,A項正確;限制酶KpnⅠ和XhoⅠ作用位點不同,用KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體,只有基因方向正確才能形成重組載體,從而保證基因轉錄方向正確,B項正確;檢測出玉米細胞中含有融合基因,不一定能說明抗蚜蟲玉米培育成功,因為融合基因可能不能正常表達,還需作修飾處理,C項錯誤;在加入卡那霉素的培養基上存活下來的細胞,可能是成功導入重組載體的細胞,也可能是導入含有卡那霉素抗性基因的非重組載體的細胞,D項正確。3.(2025·八省聯考陜西卷)科研人員基于合成生物學原理在大腸桿菌中構建了合成產物Z的完整途徑,其基因表達載體如圖(a),基因1、2和3為該途徑的必需基因,基因大小分別為2650bp、1240bp和3476bp?；卮鹣铝袉栴}。圖(a)圖(b)(1)圖(a)中,構建基因表達載體時用到的酶是

,片段X是

。

(2)基因表達載體導入大腸桿菌前,需要用Ca2+處理大腸桿菌使其處于一種

的生理狀態,導入后在含卡那霉素的培養基上篩選到3個抗性菌落,分別對其所含DNA進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖(b)。據圖可知,PCR時選用的引物對是圖(a)中的

,選擇該引物對進行鑒定的原因是

;菌落B中未檢測到目標條帶,其原因是

。

限制酶、DNA連接酶

復制原點能吸收周圍環境中DNA分子引物2和引物5

兩種引物擴增的區段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段菌落B中導入的是普通質粒而非重組質粒(3)工程菌株合成產物Z的產量受到溫度、pH和溶解氧等發酵條件的影響,請針對其中任一因素,探究其對產物Z產量的影響,寫出簡要的實驗思路。將工程菌株隨機分成若干份,分別培養在一系列不同溫度(或pH或溶解氧)的培養液中,其他環境條件相同且適宜,一段時間后測定產物Z的產量。解析

(1)構建基因表達載體時用到的酶是限制酶、DNA連接酶,利用限制酶切割質粒和目的基因所在的DNA片段獲得相同的黏性末端,然后利用DNA連接酶連接質粒和目的基因獲得重組DNA分子。質粒上一般包含啟動子、終止子、復制原點、標記基因(抗性基因),結合圖(a)分析,片段X是復制原點。(2)基因表達載體導入大腸桿菌前,需要用Ca2+處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態,這樣有利于重組DNA分子的導入。導入后在含卡那霉素的培養基上篩選到3個抗性菌落,分別對其所含DNA進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖(b)。電泳檢測的目的是判斷3個抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3),電泳結果顯示,菌落A和C電泳條帶顯示擴增片段的大小介于2

000~3

000

bp之間,結合目的基因上的引物分析,應該選擇引物2和引物5,兩種引物擴增了基因2(1

240

bp)以及基因1和基因3的部分片段,擴增片段的大小在2

000~3

000

bp之間,而且可以判斷大腸桿菌中是否成功導入了目的基因。菌落B中未檢測到目標條帶,即不含目的基因但含抗性基因,其原因是菌落B中導入的是普通質粒而非重組質粒。(3)本實驗的實驗目的是探究溫度、pH和溶解氧等發酵條件對產物Z產量的影響,實驗自變量是溫度或pH或溶解氧,檢測指標是產物Z產量。因此簡要的實驗思路是將工程菌株隨機分成若干份,分別培養在一系列不同溫度(或pH或溶解氧)的培養液中,其他環境條件相同且適宜,一段時間后測定產物Z的產量?？挤ǘ?/p>

PCR技術4.(2025·廣東揭陽模擬)利用PCR獲得目的基因后,用限制酶EcoRⅠ同時處理目的基因與質粒,拼接后可得到重組基因表達載體,其部分DNA片段如下圖所示。下列有關引物的分析正確的是(

)A.通過PCR獲取目的基因時,所選的引物可為引物2和引物3B.檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時,應選用引物1和引物4進行PCRC.若設計的引物與模板不完全配對,可適當提高PCR復性的溫度D.DNA聚合酶能與引物結合,并從引物的5'端連接脫氧核苷酸A解析

引物結合在模板鏈的3'端,通過PCR獲取目的基因時,所選的引物可為引物2和引物3,A項正確;引物結合在模板鏈的3'端,檢測目的基因是否插入質粒且方向是否正確時,應選用引物2和引物4進行PCR,B項錯誤;若設計的引物與模板不完全配對,可適當降低PCR復性的溫度,以便引物與模板鏈結合,C項錯誤;DNA聚合酶能與引物結合,并從引物的3'端連接脫氧核苷酸,D項錯誤?？键c三實驗:DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定夯實基礎?精研教材1.DNA的粗提取與鑒定(1)實驗原理酒精NaCl溶液2mol/L藍色(2)實驗步驟

研磨上清液95%一個方向2mol/L二苯胺5min藍色2.DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗基礎相反大小和構象(2)PCR實驗操作步驟和電泳鑒定

微量移液器離心管底部(3)DNA的測定:凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為

的紫外燈下被檢測出來。

300nm教材深挖1.(選擇性必修3

P85結果分析與評價)電泳鑒定時未出現特異性條帶的原因有哪些?2.(選擇性必修3

P85結果分析與評價)如何來評價擴增的效果?模板DNA出現污染;Taq

DNA聚合酶出現質量問題;引物特異性不強(如與非目的基因的核苷酸序列有同源性)或形成引物二聚體;復性時的溫度過低;PCR循環次數過多等觀察DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果

易錯排查1.配制PCR反應體系時,加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴增原料。(2024·河北卷)(

)2.利用添加核酸染料的凝膠對PCR產物進行電泳后,在紫外燈下觀察結果。(2024·河北卷)(

)3.在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶。(

)4.PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應。(

)×√√×考法練透?素養提升考法一

DNA的粗提取與鑒定1.(2024·山東卷)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗,下列說法正確的是(

)A.整個提取過程中可以不使用離心機B.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后,應充分搖勻再倒入燒杯中C.鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發生改變D.僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾A解析

組織研磨液中上清液的獲取可以采用低溫靜置法或離心法,A項正確;研磨液在4

℃冰箱中放置幾分鐘后,取上清液,其中含有DNA,不能再搖勻,B項錯誤;鑒定過程中需要沸水浴加熱,會導致DNA變性,DNA的雙螺旋結構發生改變,C項錯誤;僅設置一個只加2

mol/L的NaCl溶液的對照組即可排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾,D項錯誤?？挤ǘ?/p>

DNA片段的擴增及電泳鑒定2.(2024·湖南卷)最早的雙脫氧測序法是在PCR反應體系中,分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子鏈延伸時,雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則,以加入ddATP的體系為例:若配對的為ddATP,延伸終止;若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP),繼續延伸;PCR產物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列,結果如圖所示。下列敘述正確的是(

)A.上述PCR反應體系中只加入一種引物B.電泳時產物的片段越小,遷移速率越慢C.5'-CTACCCGTGAT-3'為對照個體的一段序列D.患者該段序列中某位點的堿基C突變為G答案

AC

解析

利用雙脫氧測序法時,PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA,故只需加入一種引物,A項正確;電泳時產物的片段越大,遷移速率越慢,B項錯誤;對照個體測序結果為5'-CTACCCGTGAT-3',患者個體測序結果為5'-CTACCTGTGAT-3',對比可知,患者該段序列中某位點的堿基C突變為T,C項正確,D項錯誤。3.(2024·黑吉遼卷)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實驗,下列敘述正確的是(

)A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.在同一電場作用下,DNA片段越長,向負極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來A解析

瓊脂糖凝膠的密度對其中DNA分子的遷移和分辨率有影響。根據所需分離的DNA片段大小,通常會選擇適當濃度的瓊脂糖凝膠。對于大型DNA片段(如基因組DNA或質粒DNA),一般選擇低濃度瓊脂糖凝膠,以便實現高效遷移所需較大孔徑;對于小型DNA片段(如PCR產物或酶切片段),則需要選擇高濃度瓊脂糖凝膠以提供更好的分辨率和分離效果,A項正確。凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是用于確定樣品