團體標準《食品中霉菌和酵母快速檢測-測試片法》編制說明（征求意見稿）一、工作簡況任務來源本標準由中國出入境檢驗檢疫協會提出并歸口。根據中國出入境檢驗檢疫協會團體標準化工作委員會2025年團體標準制修訂計劃（中檢協標［2025］2號，立項號：P/CIOA-216-2025），由山東美正生物科技有限公司，國家食品安全風險評估中心，深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，通標標準技術服務（青島）有限公司，中農孚德檢測技術（北京）有限公司，光明乳業股份有限公司，內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，元氣森林（北京）食品科技集團有限公司，河南雙匯投資發展股份有限公司，北京市食品檢驗研究院，北京美正生物科技有限公司等單位共同參與起草，計劃于2025年8月31日前完成該標準的制定工作。主要工作過程與工作計劃2024年8月：標準提案。提出制定標準項目，并著手進行標準立項征求意見、方法可行性論證、實驗室內驗證和充分的評估工作。2025年2月：標準立項。召開標準立項評估會，發布中檢協標［2025］2號文件“中國出入境檢驗檢疫協會批準《食品中霉菌和酵母快速檢測-測試片法》團體標準立項”，立項通過批準，立項號P/CIQA-216-2025。2025年3月-4月：方法驗證。在實驗室內驗證的基礎上，參照ISO16140-2進行實驗室間驗證和用戶應用測試，并形成驗證報告。2025年4月：標準起草。進行前期調研、存在問題分析和相關資料收集整理等準備工作，擬定了標準“編制說明”，并起草了“標準草案”；根據專家意見和起草組內部征求意見修改標準草案和編制說明，形成標準“征求意見稿”。2025年5月：征求意見，協會發文公開征求各方意見。2025年6月：計劃對征求到的意見進行分類采納處理，填寫《CIQA標準征求意見稿反饋意見匯總表》，并形成“標準送審稿”。2025年6月-7月：計劃召開標準審定會，根據與會專家的意見，對標準送審稿進行完善，形成標準報批稿，將標準報批稿和標準編制說明一并上報中國出入境檢驗檢疫協會審批。3、主要參加單位和工作組成員及其所做的工作等項目責任單位：山東美正生物科技有限公司。項目參與單位：國家食品安全風險評估中心，深圳海關食品檢驗檢疫技術中心，通標標準技術服務（青島）有限公司，中農孚德檢測技術（北京）有限公司，光明乳業股份有限公司，內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，元氣森林（北京）食品科技集團有限公司，河南雙匯投資發展股份有限公司，北京美正生物科技有限公司。本標準主要起草人：陶文靖，王偉，王琦，付敏，呂敬章，肖晶，賈晨，許冉冉，李志君，王丹，孫丹丹，張娜，董彬，王劍銘，蘇政，孫宏偉，吳萍，劉磊，曲連海，凌空，劉赫東，周琦等。北京美正生物科技有限公司陶文靖負責團體標準制定的整體規劃、立項、組織協調，標準文本和編制說明等文件撰寫，方法體系的可行性評估并組織開展方法驗證工作，驗證評價結果的匯總分析等；國家食品安全風險評估中心王偉、肖晶承擔本方法在《電商方便食品風險偵測、溯源及控制關鍵技術研究》項目中的應用研究，并方法的前期評估和標準起草；北京美正生物科技有限公司賈晨、凌空等按照方法開發要求進行方法可行性驗證；通標標準技術服務（青島）有限公司王琦和蘇政負責實驗室間方法驗證及結果分析；中農孚德檢測技術（北京）有限公司付敏和孫宏偉，光明乳業股份有限公司許冉冉、董彬、王劍銘、吳萍協助進行實驗室間方法驗證，并提供實驗室間驗證樣品；深圳海關食品檢驗檢疫技術中心呂敬章負責實驗室內及實驗室間驗證方案的指導；內蒙古伊利實業集團股份有限公司李志君、內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司王丹、河南雙匯投資發展股份有限公司孫丹丹、元氣森林（北京）食品科技集團有限公司張娜等對本標準方法進行了應用測試；各單位的相關起草人都在標準制定過程中提供了合理化建議并參與了標準草案、征求意見稿、送審稿、報批稿等內部意見反饋和討論工作。二、標準編制原則和主要研究內容1、編制原則全國人大常委會在2017年11月4日審議通過新修訂的《標準化法》，該法第二條規定：“標準包括國家標準、行業標準、地方標準和團體標準、企業標準”。從法律上進一步明確了團體標準地位。我國現行的法規體系中，國家標準、行業標準、地方標準屬于政府標準，由政府主導制定；團體標準和企業標準屬于市場標準，由市場自主制定。政府標準與市場標準協同發展、協調配套。市場標準除了快速反應市場需求外，其承載的一個重要功能就是創新。本標準立足國內食品安全發展實際，在符合國家食品安全相關法律法規、標準要求的前提下，引入國際上最新的微生物檢測方法，完成本土吸收轉化后，制定出具有較大行業影響力的、規范嚴謹、可行性強的標準檢驗方法文件。同時，標準制定工作還遵循“面向市場、服務產業、自主制定、適時推出”的原則，將標準制定、試驗驗證、應用推廣相結合，統籌推進。標準的編寫結構和內容編排等方面依據GB/T1.1《標準化工作導則》、GB/T20000《標準化工作指南》等系列標準的要求，重點對標準適用范圍、檢驗步驟等關鍵要素進行了明確，以突出標準的科學性、可靠性和合理性的特點。霉菌和酵母廣泛分布于自然界，如空氣、水和土壤。其中有些霉菌和酵母對人類是有益的，常被用于釀造、發酵食品等工業。但在某些情況下，霉菌和酵母也可造成食品腐敗變質，有的還能產生真菌毒素，霉菌和酵母是評價食品衛生質量的指示菌。根據國家食品安全標準，有18類（種）食品規定了霉菌限量要求，8類（種）食品規定了酵母限量要求。基于國家標準的要求，本標準在制定的過程中，結合相關使用單位的生產現狀，綜合研究了霉菌和酵母檢驗的各類快速檢驗方法，其中食品中霉菌和酵母快速檢測-測試片法（以下簡稱“MicroFast霉菌酵母測試片法”）省去了平板培養法培養基制備的繁瑣步驟，減少環境污染，且其采用新的指示技術使菌落更容易分辨，從樣品準備到結果報告僅需48小時。可以幫助企業提高檢測效率、縮短檢測時間、加快產品放行，同時操作更為簡便、更加節省空間，從而減少誤差和降低能耗。本標準將基于測試片技術，建立適用于不同類型食品中霉菌和酵母快速檢測的方法體系，針對常規食品樣品和具有挑戰性的樣品（牛油果、蝦等），制定詳細的操作流程和測試片驗收指南。設計科學充分的方法驗證方案來保證方法的嚴謹性、準確性和普適性，以滿足食品生產加工過程及終產品快速放行、及時糾偏的需求。本標準的提出和制定，填補了方法空白，同時有利于協調統一該標準在技術上的先進性、經濟上的合理性以及應用中的適用性。2、主要研究內容MicroFast霉菌酵母測試片法的技術原理是：MicroFast霉菌酵母測試片法是用一種預先制備的含有指示劑及冷水可溶性凝膠的培養基系統進行微生物培養的方法。培養基中含有霉菌和酵母生長的主要營養物質和功能性物質（如顯色底物、冷水可凝膠等）。霉菌和酵母生長過程中代謝產生的酶與測試片中的顯色底物發生反應，隨著不斷釋放的顯色基團的累積，顯色效應逐漸增強，最終形成可見光下可計數的藍綠色菌落。本標準的驗證參照ISO16140-2:2016Microbiologyofthefoodchain-MethodvalidationPart2:Protocolforthevalidationofalternative(proprietary)methodsagainstareferencemethod，以GB4789.15第一法作為參考方法，對MicroFast霉菌酵母測試片法的包容性、排他行、準確度和相對正確度等方面進行了研究。分別進行了方法可行性研究驗證、實驗室內驗證、實驗室間驗證和應用測試。MicroFast霉菌酵母測試片法與GB4789.15第一法相比，在檢測時間上大約只需48h，而GB4789.15第一法需要5天左右。MicroFast霉菌酵母測試片法在檢測時間上可以縮短3天。兩種方法在其他方面的比較見表1。本標準的制定旨在幫助食品企業和檢驗機構建立食品中霉菌和酵母的快速檢測方法，本標準檢驗方法適用于食品中霉菌和酵母的快速、定量檢驗。表1MicroFast霉菌酵母測試片法與GB4789.15-2016第一法的比較比較項目MicroFast霉菌酵母測試片法GB4789.15方法檢測時間2天5天操作復雜程度即用型，直接接種、培養后判讀結果；培養基配置操作流程繁瑣挑戰性樣品基質適用性食品、低菌含量飲料、生物酶活性高樣品（如牛油果、蝦等）廣泛適用誤差使用簡單方便，實驗步驟少，因此誤差少；可避免培養基傾注造成的熱損傷。實驗步驟多而復雜，誤差來源多空間利用體積小，節省空間，提高設備利用率，從而創造良好的實驗環境平板體積大，占用較大空間和設備質量控制給出詳細驗收規范符合GB4789.28三、主要試驗（或驗證）情況3.1方法可行性評估3.1.1驗證依據測試片法與參比方法對霉菌和酵母菌株、實際樣品及人工污染樣品的檢測結果，進行T檢驗和線性回歸分析，通過統計學結果分析，評價結果一致性。3.1.2參比方法GB4789.15-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》第一法T/CBIA005-2019《飲料中微生物的檢驗（濾膜前處理法）》3.1.3驗證參數及結果3.1.3.1包容性和排他性選擇了53株霉菌和酵母標準菌株及分離株進行包容性驗證，選擇了30株非霉菌和酵母的排他性菌株進行排他性驗證。目標菌株在霉菌酵母測試片上顯示特定的菌落形態，非目標菌株在測試片上無菌落生長（詳細結果見方法可行性驗證報告）。3.1.3.2準確性驗證（結果一致性）本次驗證的所有的樣品，包括標準菌株，乳及乳制品，肉制品，糕點及烘焙食品，堅果及籽類制品，蜜餞和果脯制品，果汁和飲料制品，面粉和調味制品，其他制品（包括淀粉、谷物、蜂蜜、即食藻類干制品、食用油脂、果凍、沙拉醬、三文魚、北極貝和鮮甜蝦）和人工污染樣品在內的共計236份樣品采用MicroFast霉菌酵母測試片法與國標法檢測的霉菌酵母計數結果進行T檢驗，P=0.95318＞0.05，兩種檢測結果差異不顯著，具有很好一致性。MicroFast霉菌酵母測試片法與國標法檢測本次驗證樣品霉菌酵母共選取124個有效數據，其線性回歸如圖1所示。圖1兩種方法驗證樣品霉菌酵母的線性回歸對比3.1.3.3含較高活性酶樣本（牛油果、生鮮蝦魚等）中霉菌和酵母的檢測以牛油果、生魚蝦等含較高活性酶的樣本為檢測對象，曲霉和釀酒酵母混合菌作為人工污染加標菌，同時對應樣本檢測時添加專用補充劑，不添加專用補充劑的為對照。不同樣本添加專用補充劑前后的檢測對比結果見表2.表2不同樣本專用添加補充劑前后的檢測對比樣品添加專用補充劑前添加專用補充劑后蛋黃粉鮮牛油果（加標）生羅氏蝦（整蝦）（加標）注：“加標”指人工污染霉菌和酵母，蛋黃粉自身含有霉菌。綜上所述，MicroFast霉菌酵母測試片與國標法（GB4789.15-2016）的檢測結果一致性較好，同時在飲料需要膜過濾檢測情況下，MicroFast霉菌酵母測試片與T/CBIA005-2019檢測結果也具有很好一致性。對于含較高活性酶樣本（牛油果、生鮮蝦魚等）中霉菌和酵母的檢測，添加專用補充劑后，能夠消除這些特定樣本的基質等影響，實現正常霉菌和酵母的檢測。3.2.實驗室內驗證3.2.1驗證實驗室選擇通標標準技術服務有限公司（SGS總部）3.2.2驗證依據ISO16140-2:2016Microbiologyofthefoodchain-MethodvalidationPart2:Protocolforthevalidationofalternative(proprietary)methodsagainstareference3.2.3參比方法GB4789.15-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》第一法3.2.4驗證參數及結果3.2.4.1基質和污染水平設計在與GB4789.15-2016第一法平板計數法進行一致性比對試驗中，選用5大類食品類型，每個大類選擇6種樣品，每種樣品做5個重復測試。采用人工污染的方式，每個大類均涵括低、中、高三種污染水平。具體見表3。序號食品大類食品子類樣品名稱制備方式染菌濃度1乳制品乳粉全家營養高鈣奶粉人工添加低全脂羊奶粉奶油及干酪制品黃油人工添加中奶酪棒巴殺奶鮮牛奶人工添加高A2酪蛋白有機鮮牛奶2糧食制品餅干咸味蘇打餅干人工添加低夾心餅干牛奶味谷物制品早餐黑芝麻糊人工添加中燕麥片糕點蓮蓉餅人工添加高福字餅3飲料茶飲料青梅綠茶人工添加低原味奶茶碳酸飲料可樂人工添加中雪碧0糖果汁及其飲料荔枝汁人工添加高橙汁4果蔬制品水果干葡萄干人工添加低山楂條蔬菜白菜人工添加中蘿卜新鮮水果蘋果人工添加高哈密瓜5堅果與籽類熟制堅果與籽類混合堅果人工添加低瓜子仁避風塘蟹黃味新鮮堅果與籽類花生仁人工添加中核桃仁堅果與籽類的泥（醬）花生醬人工添加高純芝麻醬表3一致性試驗樣品基質注：1.飲料、果蔬制品、新鮮堅果與籽類添加的菌種為未加熱處理的，其他經過熱加工工藝的樣品添加的菌種為經過熱處理的菌種。本次驗證針對飲料產品類別，選擇2種樣品，每種樣品做5個重復測試。均采用人工添加菌種方式，接種低污染水平的霉菌酵母菌混合菌液。具體見表4。表4膜過濾適用性試驗樣品基質樣品類型樣品接種濃度接種方式樣品數量每個樣品接種體積（mL）茉莉蜜茶低濃度（2~8CFU/100mL)人工添加5400冰紅茶低濃度（2~8CFU/100mL)人工添加54003.2.4.2相對正確度驗證對MicroFast霉菌酵母菌測試片法的性能指標進行驗證，驗證試驗的結果表明：MicroFast霉菌酵母菌測試片法在相對正確度方面150個樣品中超出差值的總平均值的95%置信區間的樣品個數為5個，比例為1:30，滿足ISO16140-2:2016中要求的不得高于1:20的比例，如圖2所示。圖2差值平均值散點圖3.2.4.3準確度驗證通過比較GB4789.15-2016第一法平板計數法和MicroFast霉菌酵母測試片法結果，進行準確度分析。對每種樣品的5個平行測試結果取中間值，按照如下公式計算MicroFast霉菌酵母菌測試片法的結果對數值（yi）的β-期望容忍區間（β-ETI）。其中差值Bi為MicroFast霉菌酵母菌測試片法的結果對數值的中間值（yi）減去GB4789.15-2016第一法平板計數法的結果對數值的中間值（xi）,具體計算結果見表5。表5準確度分析結果序號基質類別樣品名稱GB方法中位值xi測試片中位值yi偏倚Biasβ-ETI上限Uiβ-ETI下限Li可接受性限值上限可接受性限值下限yi-xi1乳制品全家營養高鈣奶粉2.02-0.043-2.063-0.1450.0580.5-0.5全脂羊奶粉2.04-0.196-2.236-0.297-0.0950.5-0.5黃油2.830.013-2.817-0.0880.1140.5-0.5黃油2.83-0.013-2.843-0.1140.0880.5-0.5鮮牛奶3.580.022-3.558-0.0790.1230.5-0.5A2酪蛋白有機鮮牛奶3.52-0.013-3.533-0.1140.0880.5-0.52糧食制品咸味蘇打餅干2.08-0.058-2.138-0.1190.0030.5-0.5夾心餅干牛奶味2.04-0.041-2.081-0.1020.0190.5-0.5早餐黑芝麻糊2.630.020-2.61-0.0410.0800.5-0.5燕麥片2.77-0.055-2.825-0.1150.0060.5-0.5蓮蓉餅3.68-0.101-3.781-0.162-0.0410.5-0.5福字餅3.69-0.047-3.737-0.1070.0140.5-0.53飲料青梅綠茶2.080.035-2.045-0.0360.1050.5-0.5原味奶茶1.880.000-1.88-0.0710.0710.5-0.5可樂2.820.032-2.788-0.0390.1020.5-0.5雪碧0糖2.700.079-2.6210.0080.1500.5-0.5荔枝汁3.940.000-3.94-0.0710.0710.5-0.5橙汁3.880.011-3.869-0.0590.0820.5-0.54果蔬制品葡萄干2.060.036-2.024-0.0630.1360.5-0.5山楂條1.98-0.048-2.028-0.1480.0510.5-0.5土豆2.71-0.064-2.774-0.1640.0350.5-0.5蘿卜2.710.000-2.71-0.1000.1000.5-0.5蘋果3.85-0.006-3.856-0.1060.0930.5-0.5哈密瓜3.820.007-3.813-0.0930.1060.5-0.55堅果與籽類混合堅果2.02-0.021-2.041-0.1020.0600.5-0.5瓜子仁避風塘蟹黃味1.900.097-1.8030.0160.1780.5-0.5花生仁（散裝）2.85-0.038-2.888-0.1190.0420.5-0.5核桃仁2.450.015-2.435-0.0660.0960.5-0.5花生醬3.83-0.048-3.878-0.1290.0330.5-0.5純芝麻醬3.79-0.045-3.835-0.1260.0360.5-0.5以GB4789.15-2016第一法平板計數法的結果對數值的中間值（xi）為橫坐標，以差值Bi為縱坐標，繪制每個食品類型的準確度分布圖，見圖3。根據ISO16140-2:2016的要求，準確度的可接受性限值AL=±0.5對數單位。由表5和圖3可知，所有食品類型的β-期望容忍區間（β-ETI）的上限值均小于0.5對數單位，下限值均大于-0.5對數單位。所以，可以認為MicroFast?霉菌酵母菌測試片法與GB4789.15-2016第一法平板計數法等效。圖3-1乳制品圖3-2糧食制品圖3-3堅果與籽類圖3-4果蔬制品圖3-5飲料圖3各類型食品準確度分布圖同時，對于低污染水平的飲料產品，采取膜過濾的方式進行處理，分別用MicroFast霉菌酵母菌測試片法和GB4789.15-2016的方法進行測試，兩個方法對于霉菌酵母菌的檢出情況一致，滿足應用檢測的預期。見表6。表6膜過濾適用性驗證試驗結果樣品類型接種濃度平行測試結果YM測試片GB方法茉莉蜜茶2~8CFU/100mL134232344433523冰紅茶2~8CFU/100mL1322343454335323.3.實驗室間驗證3.3.1驗證實驗室選擇（有效數據）實驗室1：通標標準技術服務（青島）有限公司實驗室2：中農孚德檢測技術（武漢）有限公司實驗室3：光明乳業股份有限公司華東中心工廠3.3.2驗證依據ISO16140-2:2016Microbiologyofthefoodchain-MethodvalidationPart2:Protocolforthevalidationofalternative(proprietary)methodsagainstareference3.3.3參比方法GB4789.15-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》3.3.4驗證參數及結果3.2.4.1基質和污染水平設計本次實驗室間驗證采用4種樣品類型，包括乳制品、糧食制品、堅果及籽類制品和飲料類產品。乳制品、糧食制品、堅果及籽類制品類，每一類選擇3種代表性樣品基質，進行低、中、高3個不同污染水平的人工污染實驗，以及基質空白陰性對照；飲料樣品根據實際應用需求選擇1種樣品基質進行低污染水平添加測試和基質空白陰性對照測試。對于人工污染添加陽性菌的樣品，測試2個平行樣，4種樣品類型每家實驗室共需測試30個樣品。具體樣品信息見如下表7。表7污染水平及樣品信息樣品基質樣品名稱污染水平(CFU/g)測試樣品數量實驗室1實驗室2實驗室3乳制品純鮮巴氏殺菌奶空白陰性對照111低濃度(10~100)222優倍純牛奶空白陰性對照111中濃度(100~1000)222濃醇鮮牛奶空白陰性對照111高濃度(1000~10000)222糧食制品蛋糕空白陰性對照111低濃度(10~100)222面包空白陰性對照111中濃度(100~1000)222餅干空白陰性對照111高濃度(1000~10000)222堅果及籽類扁桃仁空白陰性對照111低濃度(10~100)222腰果空白陰性對照111中濃度(100~1000)222瓜子空白陰性對照111高濃度(1000~10000)222飲料茉莉蜜茶空白陰性對照111低濃度(1~10CFU/100mL)2223.3.4.2準確度驗證3家實驗室間驗證的結果見表8。根據ISO16140-2:2016，準確度的可接受性限值AL=±0.5對數單位。由表9和圖4可知，本次實驗室間驗證的所有食品類型的β-期望容忍區間（β-ETI）的上限值均小于0.5對數單位，下限值均大于-0.5對數單位，符合ISO16140-2:2016規定的實驗室間驗證準確度的要求。表8實驗室間測試結果食品類型污染水平實驗室GB參考方法結果(CFU/g)測試片方法結果(CFU/g)平行-1平行-2平行-1平行-2乳制品空白陰性對照1＜10/＜10/2＜10/＜10/3＜10/＜10/低濃度1120606090250807070340505060中濃度139037043031023102802402303400300450450高濃度138003100330036002230023002800310032300260040004000糧食制品空白陰性對照1＜10/＜10/2＜10/＜10/3＜10/＜10/低濃度1608050100280504045380657060中濃度142047032026023503003103003350250450550高濃度135004000440039002320031004100290033700310044004700堅果及籽類制品空白陰性對照1＜10/＜10/2＜10/＜10/3＜10/＜10/低濃度1160120110100290705560380808090中濃度1400410420440232032036038032