第1節

重組DNA技術的基本工具（第2課時）三DNA連接酶---分子縫合針如何將目的外源基因和載體連接形成重組DNA？DNA連接酶的作用展示1兩個DNA片段要具有互補的黏性末端才能連接起來。DNA連接酶→磷酸二酯鍵DNA連接酶→磷酸二酯鍵DNA連接酶可以把平末端之間的縫隙“縫合”起來DNA連接酶的作用展示2DNA連接酶→磷酸二酯鍵DNA連接酶→磷酸二酯鍵DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接兩條”游離“單鏈DNA片段!DNA連接酶對堿基的排列順序沒有要求，只要粘性末端相同都可以連接將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵

1作用：注意：不是連接氫鍵（氫鍵的形成不需要酶的催化）2種類：種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶來源功能縫合

和

；

縫合__________和____________結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端磷酸二酯鍵平末端（連接平末端效率遠低于T4DNA連接酶）平末端DNA連接酶沒有對堿基序列識別特異性旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？▲

DNA復制中DNA聚合酶發揮作用AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶只能將單個核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵。DNA聚合酶作用示意圖：DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈DNA復制、基因工程DNA復制、基因工程在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸連接到已有DNA片段，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶vsDNA聚合酶項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用對象作用結果磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵DNA片段DNA單個的脫氧核苷酸DNADNA將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個的脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈DNA連接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比較E.coliDNA連接酶③

有一個至多個限制酶切割位點質粒、噬菌體、動植物病毒作用部位：種類DNA連接酶切開DNA分子的磷酸二酯鍵主要存在于原核生物中具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對受體細胞無害②

能自我復制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標記基因運載工具條件種類：磷酸二酯鍵限制酶作用部位：來源：特點：作用結果：產生黏性末端或平末端重組DNA技術的基本工具1.根據所學知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵④

圖甲限制酶的選擇技巧①不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ；②應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇EcoRⅠ或PstⅠ1、根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類2、根據質粒的特點確定限制酶的種類圖乙①質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙不能選擇SmaⅠ②所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產生相同的黏性末端方案一：只用PstⅠ切割目的基因和質粒方案二：同時用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和質粒哪種方案更好？用DNA連接酶處理后會出現哪些產物？(只考慮兩兩結合)目的基因自身環化、質粒的自身環化、目的基因與質粒反向連接使用同種限制酶效果一定好嗎？小結(1)獲取目的基因和切割載體時,通常使用同種限制酶,目的是為了：

。但是使用該法缺點是容易發生

以及

，為了避免上述情況發生，可采取的措施是

。產生相同的黏性末端，便于連接目的基因與質粒反向連接目的基因、質粒的自身環化分別使用兩種限制酶（雙酶切法）去切割目的基因和運載體1.選用下圖載體將目的基因導入細菌中并將含有目的基因的細菌篩選出來。（1）在培養細菌的培養基中添加抗生素B，則應該選擇的限制酶為_______。（2）在培養細菌的培養基中添加抗生素A，則應該選擇的限制酶為_____。①或②①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。（一)實驗原理1粗提取DNA的原理2鑒定DNA的原理某種蛋白質的溶解度(2)在一定溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。

四

DNA的粗提取與鑒定(1)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。(二)材料用具1選材豬血（哺乳動物的成熟紅細胞）無細胞核和線粒體，幾乎不含DNA，不適合；雞血中紅細胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。（1）選什么樣的材料實驗更易成功？（2）豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等2試劑研磨液體積分數為95%的酒精2mol/L的NaCl溶液二苯胺試劑試劑蒸餾水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現配現用，棕色試劑瓶存放(P117)研磨液成分作用SDSEDTATris-HCl緩沖液使蛋白質變性與DNA分離抑制DNA酶的作用穩定DNA(三)方法步驟取材研磨過

濾DNA析出DNA鑒定(2)研磨不充分對實驗結果的影響？會使DNA分子從細胞核中釋放出來的少，從而使研磨液中的DNA含量較低，影響最終提取的DNA量。稱取30g洋蔥，切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。(1)目的：破碎細胞，使核物質容易溶解在研磨液中(3)研磨時間不宜太長,不宜太用力防止研磨時產生的熱量影響DNA的提取量(4)在材料處理的過程中加入纖維素酶、果膠酶研磨效果好（有利于充分研磨）取材研磨過

濾DNA析出DNA鑒定方法1：在漏斗中墊上

過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；方法2：將研磨液倒入塑料離心管中離心，取

。紗布上清液上清液(1)過濾的紗布不能用濾紙代替因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失。(2)上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質？可能含有核蛋白、多糖等雜質DNA析出DNA鑒定取材研磨過

濾(1)此步驟的目的使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。(2)酒精預冷的作用（4℃冰箱）①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。（3)攪拌時應輕緩、并沿一個方向目的減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子在上清液中加入體積相等的

溶液,靜置2~3min，溶液中出現的

就是粗提取的DNA。預冷的酒精白色絲狀物實驗組對照組沸水浴加熱DNA析出DNA鑒定取材研磨過

濾加入2mol/L氯化鈉溶液不加入絲狀物加入4ml二苯胺試劑加入2mol/L氯化鈉溶液加入絲狀物加入4ml二苯胺試劑將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。二苯胺2mol/L的NaCl二苯胺試劑鑒定呈現藍色說明實驗基本成功；如果不呈現藍色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。1.提取出絲狀物或沉淀物一定是白色的嗎？用二苯胺試劑鑒定的結果如何？如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多。

可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？3.本實驗的檢測結果藍色較淺的原因可能是什么？①材料中的核物質沒有充分釋放出來，如研磨不充分。②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞。③二苯胺最好現用現配，二苯胺易被空氣氧化，影響鑒定效果。（四)結果分析與評價為了提純DNA，某同學提出以下實驗方案，請分析原因：操作2:上述得到的DNA提取液，緩緩加入蒸餾水，調節NaCl溶液的濃度為0.14mol/L，玻璃棒攪拌，析出DNA。操作1:得到的DNA粗提取物（絲狀物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，過濾，取濾液（DNA提取液）。加2mol/L的NaCl溶液的目的：加蒸餾水的目的：溶解DNA，除掉高鹽溶液中不能溶解的雜質，提純DNA液。降低NaCl溶液濃度，從而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低鹽溶液中的雜質。（五)進一步探究通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去

的多種雜質。與DNA溶解度不同1.如果選用雞血細胞進行實驗，如何快速破碎細胞？將雞血細胞置于蒸餾水中，待細胞漲破后，收集濾液。利用蛋白酶分解雜質蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質分開。2.有時會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？拓展探究：DNA粗提取與鑒定實驗成功的關鍵(1)破碎細胞應徹底充分。(2)對提取的含雜質較多的DNA進行提純時，所用的酒精必須經過充分

預冷后才能使用。(3)實驗過程中攪拌時玻璃棒不能直插燒杯底部，并且攪拌要輕緩，并

沿一個方向攪拌以便獲得較完整的DNA分子。(4)由于玻璃表面帶電荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故實驗中應盡量

不使用或少使用玻璃器皿，這樣可以提取到較多的DNA。(5)二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。1.如圖為雞血細胞中DNA的粗提取和鑒定實驗過程中的部分操作示意圖，請據圖分析，回答下列問題：(1)右述圖示中，該實驗的正確操作順序是__________________________

(用序號與箭頭表示)。(2)步驟④中使用2mol/LNaCl溶液的目的是

。③→②→①→④→⑤溶解DNA鞏固練習(3)步驟①的目的是

，其依據的原理是

。析出并獲得DNADNA不溶于酒精(4)步驟①中所得到的絲狀物為

色，若要鑒定其主要成分為DNA，可滴加________試劑，

后，如果出現

則證明該絲狀物的主要成分為DNA。白二苯胺沸水浴加熱藍色(5)由于雞血較難找到，某學生試圖用豬血代替，結果沒有成功，其原因最可能是_______________________________________________________。豬是哺乳動物，哺乳動物血液中成熟的紅細胞沒有細胞核一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（