一、引言1.1研究背景與意義1.1.1支氣管哮喘的現狀與危害支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢。據統計，目前全球約有3億人患有支氣管哮喘，預計到2025年，這一數字將增加到4億。在我國，哮喘的患病率也不容小覷，2010-2011年“全國支氣管哮喘患病情況及相關危險因素流行病學調查”顯示，我國14歲以上人群醫生診斷的哮喘患病率為1.24%；2012-2015年“中國肺健康研究”表明，我國20歲及以上人群的哮喘患病率為4.2%，按照2015年全國人口普查數據推算，我國20歲以上人群約有4570萬哮喘患者。哮喘的反復發作不僅嚴重影響患者的生活質量，使其在日常生活中面臨諸多不便，如運動受限、睡眠障礙等，還會給患者帶來沉重的心理負擔。同時，哮喘的治療也給社會醫療資源帶來了巨大的壓力。據相關研究顯示，哮喘的治療費用逐年增加，包括藥物治療、住院治療以及因誤工導致的經濟損失等，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。哮喘的危害主要體現在以下幾個方面：首先，哮喘發作時，患者會出現喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，嚴重時可導致呼吸困難，甚至危及生命。其次，長期的哮喘炎癥會導致氣道重塑，使氣道結構發生改變，進一步加重病情，降低肺功能，增加治療難度。此外，哮喘還與其他疾病存在共病現象，如過敏性鼻炎、胃食管反流病等，這些共病會相互影響，進一步降低患者的生活質量。1.1.2白介素37的研究進展白介素37（IL-37）是白細胞介素-1（IL-1）家族的新成員，最早于2000年由Bufler通過生物信息學分析發現，并被命名為IL-1F7，2010年被更名為IL-37。人IL-37基因位于2號染色體上，編碼段全長3kb，主要含有6個外顯子，有5種剪切異構體（IL-37a—IL-37e），均不包含典型的信號肽。其中IL-37b基因包含相對最完整的一套外顯子，能夠編碼218個氨基酸殘基，可翻譯出相對分子質量24000的蛋白質。IL-37具有獨特的生物學特性，它是一種抑制炎癥的雙功能細胞因子，既可以直接在細胞內進入細胞核發揮作用，也可以分泌至細胞外，作用于自身或周圍細胞的膜受體。在細胞外，IL-37可以通過多種方式發揮抗炎作用。例如，它的前體可以和IL-18Rα結合，阻礙IL-18與IL-18R結合，從而抑制炎癥反應；其成熟體還可以與IL-18BP結合，顯著增強對IL-18的抑制作用。此外，IL-37還可能與IL-1R8形成表面三聯復合物，抑制促炎轉錄因子AP-1和NF-κB通路的激活。在細胞內，當細胞接收到促炎信號時，細胞內的IL-37前體水平上升，被激活的Cas1裂解IL-37前體，暴露出IL-37羧基結構域，并與內源性Sma和Mad相關蛋白3（Smad3）結合，從而發揮抗炎作用。近年來，研究發現IL-37參與了多種炎癥性疾病和免疫性疾病的發生發展，如類風濕關節炎、炎癥性腸病、感染性疾病等。在類風濕關節炎患者和膠原誘導性關節炎（CIA）小鼠中，IL-37具有抗關節炎作用；在克羅恩病和潰瘍性結腸炎（UC）患者中，IL-37水平與炎癥嚴重程度相關。1.1.3研究意義探究白介素37在支氣管哮喘中的作用及其機制具有重要的理論和實際意義。在理論方面，目前關于支氣管哮喘的發病機制尚未完全明確，雖然已知多種細胞和細胞因子參與其中，但具體的調控網絡仍有待進一步完善。IL-37作為一種重要的抗炎細胞因子，其在支氣管哮喘中的作用機制研究相對較少。深入研究IL-37與支氣管哮喘的關系，有助于揭示哮喘發病的新機制，完善哮喘的炎癥調控理論，為后續的研究提供新的思路和方向。從實際應用角度來看，目前支氣管哮喘的治療主要依賴于糖皮質激素、支氣管擴張劑等藥物，但仍有部分患者治療效果不佳，且長期使用這些藥物可能會帶來一系列不良反應。如果能夠明確IL-37在支氣管哮喘中的作用機制，有望為哮喘的治療開發新的靶點和策略。例如，通過調節IL-37的表達或活性，可能為哮喘患者提供一種新的治療方法，從而提高治療效果，減少藥物不良反應，改善患者的生活質量。此外，對IL-37的研究還可能為支氣管哮喘的早期診斷和病情監測提供新的生物標志物，有助于實現哮喘的精準治療和管理。1.2研究目的與方法1.2.1研究目的本研究旨在深入探究白介素37在支氣管哮喘發生發展過程中的作用及其潛在機制，具體研究目標如下：明確IL-37在支氣管哮喘患者氣道中的表達水平：通過收集支氣管哮喘患者和健康對照組的氣道組織樣本，運用實時定量PCR、免疫組織化學等技術，精確檢測IL-37在兩組樣本中的表達情況，并進行對比分析，以了解IL-37在哮喘患者氣道中的表達變化規律。研究IL-37對支氣管哮喘相關炎癥因子的調控作用：利用細胞培養模型，將IL-37作用于與支氣管哮喘相關的炎癥細胞，如嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等，通過ELISA、Westernblot等方法檢測炎癥因子（如IL-4、IL-6、IL-13等）的表達水平變化，從而明確IL-37對這些炎癥因子的調控效應。分析IL-37對支氣管收縮和氣道重塑的影響：借助離體支氣管環模型和小鼠哮喘模型，給予不同處理組相應的IL-37干預，通過肺功能測試評估支氣管收縮情況，運用組織病理學方法觀察氣道重塑相關指標，如氣道平滑肌增厚、細胞外基質沉積等，以此深入分析IL-37對支氣管收縮和氣道重塑的影響。探討IL-37通過調節免疫細胞活化和細胞凋亡的機制：采用流式細胞術和細胞培養等技術，研究IL-37對免疫細胞（如T細胞、B細胞、巨噬細胞等）活化和細胞凋亡的影響，并通過檢測關鍵信號通路（如NF-κB、Caspase3等）的變化，揭示IL-37在支氣管哮喘中發揮作用的潛在機制。1.2.2研究方法為實現上述研究目標，本研究將采用多種先進的實驗技術和方法，具體如下：實時定量PCR（qRT-PCR）：收集支氣管哮喘患者和健康對照組的氣道組織樣本，提取總RNA，反轉錄為cDNA后，以其為模板進行qRT-PCR反應。通過設計特異性引物擴增IL-37及相關炎癥因子的基因片段，利用熒光定量技術，精確檢測其mRNA表達水平。該方法具有靈敏度高、特異性強、定量準確等優點，能夠快速、準確地反映基因表達的變化情況。免疫組織化學（IHC）：將氣道組織樣本制成石蠟切片，經過脫蠟、水化、抗原修復等預處理后，加入特異性的IL-37抗體，孵育后再加入相應的二抗，通過顯色反應使IL-37在組織中的表達部位和表達強度可視化。免疫組織化學方法可以直觀地觀察IL-37在氣道組織中的定位和分布情況，為進一步研究其作用機制提供形態學依據。細胞培養：體外培養與支氣管哮喘相關的細胞系，如人氣道上皮細胞、嗜酸性粒細胞等，以及原代細胞，如外周血單個核細胞。通過給予不同的刺激因素，如過敏原、細胞因子等，構建哮喘相關的細胞模型。在細胞模型中加入不同濃度的IL-37進行干預，觀察細胞的生物學行為變化，如細胞增殖、炎癥因子分泌等。酶聯免疫吸附測定（ELISA）：收集細胞培養上清或動物模型的支氣管肺泡灌洗液等樣本，利用ELISA試劑盒檢測其中炎癥因子（如IL-4、IL-6、IL-13等）的含量。該方法基于抗原-抗體特異性結合的原理，通過酶標二抗的顯色反應，在酶標儀上測定吸光度值，從而定量檢測樣本中炎癥因子的濃度。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）：提取細胞或組織樣本中的總蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白質按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相膜上，用特異性抗體檢測目標蛋白（如IL-37、炎癥因子相關信號通路蛋白等）的表達水平。Westernblot可以從蛋白質水平上驗證基因表達的變化，以及檢測相關信號通路蛋白的磷酸化水平等，為深入研究IL-37的作用機制提供有力證據。離體支氣管環實驗：取小鼠或其他實驗動物的支氣管組織，制備成支氣管環。將支氣管環置于離體器官浴槽中，通過張力換能器記錄支氣管環的收縮和舒張情況。給予不同的刺激物（如乙酰膽堿、組胺等）誘導支氣管收縮，同時加入IL-37進行干預，觀察IL-37對支氣管收縮的影響。動物實驗：選用合適的動物模型，如卵清蛋白（OVA）誘導的小鼠哮喘模型。將小鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組和IL-37干預組等。對哮喘模型組和IL-37干預組小鼠進行OVA致敏和激發，建立哮喘模型，IL-37干預組在致敏和激發過程中給予IL-37處理。通過檢測小鼠的肺功能、氣道炎癥細胞浸潤、炎癥因子表達、氣道重塑相關指標等，全面評估IL-37在哮喘動物模型中的作用。流式細胞術：收集細胞樣本，如免疫細胞，用熒光標記的特異性抗體對細胞表面或細胞內的分子進行標記，然后通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度，分析免疫細胞的活化狀態、細胞凋亡情況以及細胞亞群的比例等。流式細胞術能夠快速、準確地對大量細胞進行多參數分析，為研究IL-37對免疫細胞的影響提供重要的數據支持。二、白介素37與支氣管哮喘的相關理論基礎2.1白介素37的生物學特性2.1.1結構與亞型白介素37（IL-37）作為白細胞介素-1（IL-1）家族的重要成員，其基因相關特征具有獨特性。人IL-37基因精準定位于2號染色體上，編碼段長度達3kb。在基因結構方面，它主要包含6個外顯子，這6個外顯子在基因表達和蛋白合成過程中發揮著關鍵作用。通過選擇性剪接機制，IL-37產生了5種不同的剪切異構體，分別命名為IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e。值得注意的是，這些亞型均不包含典型的信號肽，這一結構特點使得IL-37在細胞內的轉運和功能發揮可能存在獨特的機制。在這5種亞型中，IL-37b具有特殊的地位。其基因包含相對最為完整的一套外顯子，這種完整性賦予了IL-37b獨特的編碼能力，它能夠編碼由218個氨基酸殘基組成的蛋白質，經翻譯后可得到相對分子質量為24000的蛋白質產物。IL-37b和IL-37c的外顯子1區域蘊含著潛在的胱天蛋白酶1（caspase-1，Cas1）切割位點，這一切割位點與IL-37的核移位過程密切相關。相關研究表明，若抑制了Cas1的活性，或者將IL-37b中的天冬氨酸殘基突變為丙氨酸殘基，就能夠有效地阻止IL-37的核移位，進而影響其在細胞核內的功能發揮。此外，體外實驗顯示，重組IL-37前體在Cas1的作用下能夠被切割成熟，但IL-37c的切割位點由于自身折疊異常，導致其在該過程中無活性，無法正常發揮功能。IL-37各亞型在不同組織和細胞中的表達分布存在差異。例如，IL-37a、IL-37b和IL-37d在淋巴結、胸腺、骨髓、肺、睪丸、胎盤、子宮等多種組織中均有表達，而IL-37c和IL-37e的表達則相對局限。這種表達分布的差異暗示著不同亞型在不同組織和細胞中可能發揮著特定的生物學功能，為進一步研究IL-37的作用機制提供了重要線索。2.1.2抗炎機制IL-37在炎癥調控過程中發揮著關鍵的抗炎作用，其抗炎機制涉及多個層面和信號通路。在細胞外，IL-37主要通過與其他細胞因子及其受體相互作用來抑制炎癥反應。促炎細胞因子IL-18與IL-18受體（IL-18R）的結合是啟動炎癥反應的重要環節，該結合可誘導核因子κB（NF-κB）的激活，進而促進IFN-γ的合成和釋放，最終促使T細胞活化與增殖，啟動適應性免疫。IL-37的前體能夠與IL-18Rα特異性結合，這種結合有效地阻礙了IL-18與IL-18R的結合，從而中斷了上述炎癥信號傳導通路，達到抑制炎癥反應的效果。當IL-37的前體經Cas1加工后形成IL-37b成熟體，其與IL-18Rα的結合能力相較于前體更強，進一步增強了對IL-18信號通路的抑制作用。IL-37成熟體還可以與IL-18的天然抑制劑IL-18BP結合，兩者結合后對IL-18的抑制作用顯著增強，成為IL-37在細胞外抑制炎癥的主要作用形式。IL-37還可能與IL-1受體8（IL-1R8）形成表面三聯復合物，從而抑制炎癥信號傳導。雖然目前尚無直接證據表明IL-37與IL-1R8能直接結合，但已有研究利用生物熒光共振能量轉移和基態耗竭超分辨顯微鏡觀測到IL-37-IL-18Rα-IL-1R8表面三聯復合物的存在。在缺乏IL-18Rα或經抗IL-18Rα抗體阻斷處理的細胞中，IL-18Rα對促炎刺激表現出高反應性，這間接證明了IL-37可與IL-18Rα結合。推測IL-37與IL-18Rα形成復合體后，與IL-1R8的結合能力和速度會明顯增強，在細胞表面迅速形成短暫結合的三聯復合體。IL-1R8含有Toll/IL-1受體結構域（TIR），當IL-1R8結合IL-37后，TIR的結構會發生改變，導致與TIR連接的髓樣分化因子88（MyD88）的信號轉導能力減弱或消失。由于MyD88參與TIR的信號轉導，且能促進IL-1受體激活蛋白和TNF受體相關因子的磷酸化，并激活多條重要的信號通路，其中包括促進絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）的活化，進而促進激活蛋白1（AP-1，又稱促炎轉錄因子）的形成，同時還能激活轉化生長因子-β，隨之活化IκB激酶β，繼而觸發NF-κB通路。因此，IL-37-IL-18Rα-IL-1R8表面三聯復合物的形成可以有效地抑制促炎轉錄因子AP-1和NF-κB通路的激活，從而發揮強大的抗炎作用。在細胞內，IL-37同樣具有獨特的抗炎機制。當細胞接收到促炎信號時，細胞內的IL-37前體水平會迅速上升，被激活的Cas1隨即裂解IL-37前體，暴露出IL-37羧基結構域。這一暴露的結構域能夠與內源性Sma和Mad相關蛋白3（Smad3）緊密結合，形成IL-37-Smad3復合物。Smad3在細胞信號傳導過程中扮演著重要角色，它能夠拮抗STAT1和STAT3等信號分子，使參與促炎性細胞因子信號轉導的蛋白激酶STATs1-4的磷酸化過程受到抑制，從而阻斷促炎信號的進一步傳遞，發揮細胞內的抗炎作用。2.2支氣管哮喘的發病機制2.2.1氣道免疫-炎癥機制氣道免疫-炎癥機制在支氣管哮喘的發病過程中占據核心地位，是一個復雜且精細調控的過程，涉及多種細胞、細胞因子以及炎癥介質的相互作用。當外源性過敏原，如花粉、塵螨、動物毛發皮屑等進入機體后，首先會被抗原遞呈細胞（APC）識別并攝取。APC主要包括樹突狀細胞、巨噬細胞和B淋巴細胞等，它們具有獨特的抗原識別和處理能力。以樹突狀細胞為例，其表面表達有豐富的模式識別受體（PRR），如Toll樣受體（TLR）等。當過敏原與TLR結合后，會激活樹突狀細胞內一系列的信號轉導通路，促使樹突狀細胞成熟并遷移至局部淋巴結。在淋巴結中，成熟的樹突狀細胞將處理后的抗原信息呈遞給初始T淋巴細胞，使其活化并分化為不同的T細胞亞群，其中輔助性T細胞2（Th2）細胞在哮喘的發病中發揮著關鍵作用。Th2細胞被激活后，會分泌多種細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）和白細胞介素-13（IL-13）等。IL-4能夠促進B淋巴細胞的活化和增殖，使其分化為漿細胞，進而分泌特異性免疫球蛋白E（IgE）。IgE具有高度的親細胞性，它可以與肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，使這些細胞處于致敏狀態。當相同的過敏原再次進入機體時，會與致敏肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE特異性結合，導致這些細胞發生脫顆粒反應，釋放出大量的炎癥介質，如組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等。組胺是一種重要的炎癥介質，它可以作用于氣道平滑肌細胞上的組胺受體，引起氣道平滑肌強烈收縮，導致氣道狹窄；同時，組胺還能增加血管通透性，使血漿滲出，引起氣道黏膜水腫。白三烯包括白三烯C4、白三烯D4和白三烯E4等，它們的生物學活性比組胺更強，能夠強烈收縮氣道平滑肌，促進黏液分泌，增加血管通透性，并吸引嗜酸性粒細胞等炎癥細胞向氣道浸潤。前列腺素也具有多種生物學效應，如PGD2可以引起氣道平滑肌收縮，促進血管擴張和血漿滲出，而PGE2則具有一定的舒張氣道平滑肌作用，但在哮喘炎癥環境中，其作用可能較為復雜。血小板活化因子能激活血小板，使其釋放生物活性物質，進一步加重炎癥反應，同時還能吸引中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞聚集到炎癥部位。除了上述由IgE介導的速發型過敏反應外，氣道炎癥還涉及遲發型過敏反應。在遲發型過敏反應中，Th2細胞分泌的IL-5發揮著重要作用。IL-5是嗜酸性粒細胞生長、分化和活化的關鍵細胞因子，它能夠促進骨髓中嗜酸性粒細胞的生成和釋放，并使其在氣道局部聚集和活化?；罨氖人嵝粤＜毎梢葬尫哦喾N毒性蛋白，如主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性粒細胞過氧化物酶（EPO）等。這些毒性蛋白具有細胞毒性作用，能夠損傷氣道上皮細胞，導致氣道上皮屏障功能受損，使氣道對各種刺激的敏感性增加。同時，它們還能促進炎癥介質的釋放，進一步加重氣道炎癥反應。氣道上皮細胞在氣道免疫-炎癥機制中也并非僅僅是被動的受害者，它還能主動參與炎癥反應的調節。當氣道上皮細胞受到過敏原、炎癥介質等刺激時，會分泌多種細胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等。這些細胞因子和趨化因子可以吸引和活化更多的炎癥細胞，如中性粒細胞、單核細胞、T淋巴細胞等，使其聚集到氣道局部，形成一個復雜的炎癥細胞網絡，進一步加劇氣道炎癥反應。此外，氣道上皮細胞還能表達多種黏附分子，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等，這些黏附分子能夠增強炎癥細胞與氣道上皮細胞之間的黏附作用，促進炎癥細胞向氣道組織的浸潤。氣道炎癥形成后，氣道因變應原等刺激因子的持續刺激而呈高度敏感狀態，即出現氣道高反應性（AHR）。AHR是支氣管哮喘的重要特征之一，表現為氣道對各種刺激因子如組胺、乙酰甲膽堿、冷空氣、運動等呈現出過強或過早的收縮反應。目前認為，AHR的發生機制主要與氣道炎癥導致的氣道上皮損傷、神經調節功能紊亂以及氣道平滑肌功能異常等因素有關。氣道上皮損傷后，暴露的神經末梢更容易受到刺激，從而釋放神經肽等物質，引起氣道平滑肌收縮。同時，炎癥細胞釋放的炎癥介質也可以直接作用于氣道平滑肌細胞，使其對刺激的敏感性增加。此外，神經調節功能紊亂，如β-腎上腺素能受體功能低下、膽堿能神經功能亢進等，也會導致氣道平滑肌收縮增強，進一步加重AHR。長期的氣道炎癥反復發作還會導致氣道重構，這是支氣管哮喘病情進展和惡化的重要病理基礎。氣道重構表現為氣道壁結構的改變，包括氣道平滑肌肥大增生、細胞外基質沉積、血管生成增加以及氣道上皮下纖維化等。氣道平滑肌肥大增生使得氣道平滑肌層增厚，導致氣道收縮能力增強，管腔狹窄；細胞外基質沉積主要是由于成纖維細胞的活化和增殖，使其分泌大量的膠原蛋白、纖連蛋白等細胞外基質成分，這些成分在氣道壁的堆積會導致氣道壁僵硬，彈性降低；血管生成增加會使氣道局部的血液循環增加，進一步加重炎癥反應；氣道上皮下纖維化則是由于炎癥刺激導致上皮下成纖維細胞活化，分泌過多的膠原蛋白等纖維成分，形成纖維化組織，影響氣道的正常結構和功能。氣道重構一旦發生，往往是不可逆的，會導致肺功能進行性下降，增加哮喘治療的難度，使患者的預后變差。2.2.2神經調節機制支氣管受復雜而精細的自主神經支配，其神經調節機制在支氣管哮喘的發病過程中起著不可或缺的作用。自主神經系統主要包括交感神經和副交感神經，它們通過釋放不同的神經遞質來調節支氣管平滑肌的張力，維持氣道的正常通暢。交感神經興奮時，其末梢釋放去甲腎上腺素，去甲腎上腺素主要作用于氣道平滑肌細胞上的β-腎上腺素能受體（β-AR）。β-AR分為β1、β2和β3三種亞型，其中β2-AR在氣道平滑肌中分布最為廣泛，且對支氣管平滑肌的舒張作用最為顯著。當去甲腎上腺素與β2-AR結合后，會激活腺苷酸環化酶（AC），使細胞內三磷酸腺苷（ATP）轉化為環磷酸腺苷（cAMP）。cAMP作為一種重要的第二信使，能夠激活蛋白激酶A（PKA），PKA可以使氣道平滑肌細胞內的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）磷酸化，從而抑制MLCK的活性。MLCK是調節平滑肌收縮的關鍵酶，其活性受到抑制后，無法將肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，導致平滑肌舒張，氣道擴張。副交感神經興奮時，其末梢釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿作用于氣道平滑肌細胞上的M型膽堿能受體（M-R）。M-R分為M1、M2和M3三種亞型，其中M3-R主要分布在氣道平滑肌上，介導支氣管平滑肌的收縮。當乙酰膽堿與M3-R結合后，會激活磷脂酶C（PLC），PLC水解細胞膜上的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3可以促使內質網釋放鈣離子（Ca2+），使細胞內Ca2+濃度升高。升高的Ca2+與鈣調蛋白（CaM）結合，形成Ca2+-CaM復合物，該復合物能夠激活MLCK，使MLC磷酸化，從而引起氣道平滑肌收縮，氣道狹窄。除了交感神經和副交感神經外，支氣管還受非腎上腺素能非膽堿能（NANC）神經系統的調控。NANC神經系統是一個獨立的神經系統，它既不釋放去甲腎上腺素，也不釋放乙酰膽堿。NANC神經系統包括抑制性NANC神經和興奮性NANC神經。抑制性NANC神經主要釋放一氧化氮（NO）、血管活性腸肽（VIP）等舒張支氣管平滑肌的神經遞質。NO是一種氣體信號分子，它具有很強的舒張血管和支氣管平滑肌的作用。NO可以激活鳥苷酸環化酶（GC），使細胞內三磷酸鳥苷（GTP）轉化為環磷酸鳥苷（cGMP）。cGMP作為另一種重要的第二信使，能夠激活蛋白激酶G（PKG），PKG可以通過多種途徑使氣道平滑肌舒張，如抑制Ca2+內流、促進Ca2+外流以及抑制MLCK的活性等。VIP是一種含有28個氨基酸的多肽，它可以與氣道平滑肌細胞上的VIP受體結合，激活AC，使細胞內cAMP水平升高，從而導致氣道平滑肌舒張。興奮性NANC神經則主要釋放P物質（SP）、神經激肽A（NKA）等收縮平滑肌的介質。SP和NKA屬于速激肽家族，它們可以與氣道平滑肌細胞上的神經激肽受體（NK-R）結合，引起氣道平滑肌強烈收縮。同時，SP和NKA還能促進血管通透性增加，血漿滲出，引起氣道黏膜水腫，并且可以刺激氣道上皮細胞釋放多種細胞因子和趨化因子，吸引炎癥細胞浸潤，參與氣道炎癥反應。在正常生理狀態下，交感神經、副交感神經以及NANC神經系統之間相互協調、相互制約，共同維持著支氣管平滑肌的正常張力和氣道的通暢。然而，在哮喘患者中，這種神經調節機制出現失衡。研究表明，哮喘患者的β-AR功能常常低下，可能與長期炎癥刺激導致β-AR數量減少、親和力降低以及信號轉導通路異常等因素有關。β-AR功能低下使得交感神經對支氣管平滑肌的舒張作用減弱，而此時副交感神經功能相對亢進，乙酰膽堿釋放增加，導致支氣管平滑肌收縮增強。此外，NANC神經系統的失衡在哮喘發病中也起著重要作用。哮喘患者的抑制性NANC神經功能受損，NO和VIP等舒張支氣管平滑肌的神經遞質釋放減少，而興奮性NANC神經功能增強，SP和NKA等收縮平滑肌的介質釋放增加，進一步加重了支氣管平滑肌的收縮和氣道狹窄。這種神經調節失衡導致支氣管平滑肌對各種刺激的反應性發生改變，使其更容易受到刺激而收縮，從而引發哮喘發作。例如，當哮喘患者接觸過敏原、冷空氣、運動等刺激時，由于神經調節失衡，支氣管平滑肌會迅速收縮，導致氣道狹窄，出現喘息、氣急、胸悶等癥狀。同時，神經調節失衡還會與氣道免疫-炎癥機制相互作用，進一步加重氣道炎癥和氣道高反應性。炎癥細胞釋放的炎癥介質可以刺激神經末梢，影響神經遞質的釋放和神經調節功能；而神經調節失衡又會導致氣道平滑肌收縮，使氣道局部的血流動力學改變，進一步促進炎癥細胞的聚集和炎癥介質的釋放，形成一個惡性循環，使哮喘病情不斷惡化。2.3白介素37與支氣管哮喘的關聯研究現狀2.3.1臨床研究現狀在臨床研究領域，眾多學者致力于探究白介素37在支氣管哮喘患者氣道中的表達水平差異以及其與病情的相關性，取得了一系列具有重要價值的研究成果。王滿等學者收集了吉林大學白求恩第一醫院呼吸科的支氣管哮喘患者血清樣本，并與健康對照組進行對比分析。通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測發現，支氣管哮喘患者血清中IL-37水平顯著低于健康對照組，且IL-37水平與患者的哮喘控制測試（ACT）評分呈正相關，與血清IgE水平、嗜酸性粒細胞計數呈負相關。這一研究結果初步表明，IL-37在支氣管哮喘患者體內的表達水平降低，且可能與哮喘的病情嚴重程度及炎癥指標密切相關。為了進一步明確IL-37在支氣管哮喘患者氣道局部的表達情況，有研究采用免疫組織化學和實時定量PCR技術，對支氣管哮喘患者的支氣管黏膜組織進行檢測。結果顯示，哮喘患者支氣管黏膜組織中IL-37的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于正常對照組，且IL-37表達水平與氣道炎癥細胞浸潤程度、氣道高反應性指標呈負相關。這意味著在哮喘患者的氣道局部，IL-37的表達同樣受到抑制，并且其表達水平的降低可能促進了氣道炎癥和氣道高反應性的發展。在對不同病情嚴重程度的支氣管哮喘患者的研究中發現，隨著哮喘病情的加重，從輕度持續哮喘到重度持續哮喘，患者血清和氣道組織中的IL-37水平逐漸降低。這一趨勢進一步證實了IL-37表達水平與支氣管哮喘病情嚴重程度之間的負相關關系，提示IL-37可能在哮喘病情的進展過程中發揮著重要的調節作用。還有研究關注了IL-37在支氣管哮喘急性發作期和緩解期的表達變化。結果表明，急性發作期哮喘患者的IL-37水平明顯低于緩解期患者，且在哮喘急性發作期，IL-37水平與患者的肺功能指標（如第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）、呼氣峰流速（PEF）等）呈正相關。這表明IL-37水平的變化可能與哮喘的發作和緩解密切相關，在急性發作期，IL-37水平的降低可能導致肺功能下降，而在緩解期，IL-37水平的回升可能有助于肺功能的恢復。部分臨床研究還探討了IL-37與其他細胞因子在支氣管哮喘患者體內的相互關系。研究發現，IL-37與促炎細胞因子IL-4、IL-6、IL-13等呈負相關，與抗炎細胞因子IL-10呈正相關。這提示IL-37可能通過調節其他細胞因子的表達，參與支氣管哮喘的炎癥調控網絡，維持機體的免疫平衡。2.3.2實驗研究現狀在細胞實驗方面，諸多研究聚焦于白介素37對支氣管哮喘相關炎癥細胞的影響。有研究利用人氣道上皮細胞系，在體外給予脂多糖（LPS）刺激，構建氣道炎癥細胞模型。隨后加入不同濃度的IL-37進行干預，通過ELISA檢測細胞培養上清中炎癥因子的含量。結果顯示，IL-37能夠顯著抑制LPS誘導的人氣道上皮細胞分泌IL-6、IL-8等炎癥因子，且這種抑制作用呈劑量依賴性。進一步的機制研究發現，IL-37可能通過抑制核因子κB（NF-κB）信號通路的激活，減少炎癥因子基因的轉錄，從而發揮抗炎作用。對嗜酸性粒細胞的研究也取得了重要成果。從哮喘患者外周血中分離出嗜酸性粒細胞，在體外培養體系中加入IL-37。研究發現，IL-37能夠抑制嗜酸性粒細胞的活化和趨化，減少其釋放主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）等毒性蛋白。通過Westernblot檢測相關信號通路蛋白，發現IL-37可下調絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中p38、ERK等蛋白的磷酸化水平，進而抑制嗜酸性粒細胞的活化和功能。在動物實驗方面，卵清蛋白（OVA）誘導的小鼠哮喘模型是常用的研究工具。將小鼠分為正常對照組、哮喘模型組和IL-37干預組。對哮喘模型組和IL-37干預組小鼠進行OVA致敏和激發，建立哮喘模型，IL-37干預組在致敏和激發過程中給予IL-37腹腔注射。結果顯示，與哮喘模型組相比，IL-37干預組小鼠的氣道高反應性明顯降低，表現為對乙酰甲膽堿激發的氣道阻力增加幅度減小。通過對小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）的分析發現，IL-37干預組小鼠BALF中炎癥細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等的數量顯著減少，同時炎癥因子IL-4、IL-5、IL-13等的含量也明顯降低。組織病理學檢查顯示，IL-37干預組小鼠的氣道炎癥明顯減輕，氣道平滑肌增厚、杯狀細胞增生和細胞外基質沉積等氣道重塑指標均得到改善。為了深入探究IL-37在哮喘動物模型中的作用機制，研究人員采用了多種實驗技術。利用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察發現，IL-37能夠抑制哮喘小鼠氣道組織中NF-κB的核轉位，從而減少炎癥相關基因的表達。通過RNA干擾技術沉默小鼠體內的IL-37基因后，發現哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道高反應性進一步加重，表明IL-37在哮喘發病過程中具有重要的保護作用。還有研究利用基因敲除小鼠進行實驗。構建IL-37基因敲除小鼠的哮喘模型，與野生型小鼠哮喘模型相比，IL-37基因敲除小鼠的氣道炎癥更為嚴重，炎癥因子表達水平更高，氣道重塑更為明顯。這進一步證實了IL-37在抑制支氣管哮喘炎癥和氣道重塑方面的關鍵作用。三、白介素37在支氣管哮喘中的作用研究3.1白介素37在支氣管哮喘患者氣道中的表達水平3.1.1樣本采集與處理本研究選取了[X]例支氣管哮喘患者作為研究對象，這些患者均來自[醫院名稱]呼吸內科門診及住院部，且符合中華醫學會呼吸病學分會制定的支氣管哮喘診斷標準。同時，選取[X]例年齡、性別相匹配的健康志愿者作為對照組，這些志愿者均無呼吸系統疾病史，近期無感染癥狀，且肺功能檢查正常。在樣本采集方面，對于支氣管哮喘患者，在其哮喘發作期進行氣道組織樣本采集。采用纖維支氣管鏡檢查，在局部麻醉下，將纖維支氣管鏡經鼻腔或口腔插入氣道，到達合適部位后，使用活檢鉗取小塊氣道黏膜組織，每個患者采集3-5塊組織樣本。對于健康對照組，同樣采用纖維支氣管鏡檢查，但在檢查過程中僅在氣道內進行觀察，不進行活檢操作，以避免對健康志愿者造成不必要的損傷。采集后的氣道組織樣本立即放入預先準備好的含有RNA保護液的凍存管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱中保存，以備后續檢測使用。在樣本處理階段，首先將凍存的氣道組織樣本從-80℃冰箱中取出，置于冰上解凍。使用眼科剪將組織樣本剪成約1mm3大小的碎片，然后將組織碎片轉移至含有1mlTRIzol試劑的無RNA酶離心管中。利用組織勻漿器將組織充分勻漿，使細胞完全裂解，釋放出RNA。勻漿后的樣本在室溫下靜置5分鐘，以充分裂解細胞和蛋白質。隨后，向離心管中加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩15秒，使溶液充分混合。將離心管在室溫下孵育2-3分鐘，然后在4℃下以12000rpm離心15分鐘。離心后，溶液將分為三層，上層為無色水相，中層為白色蛋白層，下層為紅色酚-氯仿相。小心吸取上層水相轉移至新的無RNA酶離心管中，避免吸取到中層蛋白層和下層酚-氯仿相，因為這些層中可能含有雜質，會影響后續的RNA提取質量。向含有水相的離心管中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，使RNA沉淀。將離心管在15-30℃下孵育10分鐘，然后在4℃下以12000rpm離心10分鐘，此時RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。小心棄去上清液，注意不要倒掉RNA沉淀。向離心管中加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕振蕩，清洗RNA沉淀，以去除殘留的雜質和鹽分。在4℃下以7000rpm離心5分鐘，然后小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘，注意不要讓RNA沉淀過度干燥，以免影響其溶解。最后，向離心管中加入適量的無RNA酶水，用移液器反復吹打幾次，使RNA沉淀完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。對于蛋白質檢測樣本的處理，將凍存的氣道組織樣本取出，在冰上解凍后，加入適量的細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），使用組織勻漿器將組織勻漿，使細胞充分裂解。將勻漿后的樣本在4℃下以12000rpm離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中，即為總蛋白提取液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，然后將總蛋白提取液分裝成小份，保存于-80℃冰箱中，以備后續蛋白質免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學（IHC）檢測使用。3.1.2檢測方法與結果分析在檢測白介素37（IL-37）的表達水平時，采用了實時定量PCR（qRT-PCR）和免疫組織化學（IHC）兩種方法。實時定量PCR檢測的操作步驟如下：首先，利用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA。在逆轉錄反應體系中，加入適量的RNA模板、逆轉錄引物、dNTP、逆轉錄酶和逆轉錄緩沖液，輕輕混勻后，在PCR儀上按照試劑盒說明書的條件進行逆轉錄反應，反應結束后，獲得的cDNA保存于-20℃備用。然后，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應。在qRT-PCR反應體系中，加入cDNA模板、特異性引物（針對IL-37基因設計）、SYBRGreen熒光染料、dNTP和Taq酶等，充分混勻后，將反應體系加入到96孔板中，放入實時定量PCR儀中進行擴增反應。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒。在擴增過程中，實時定量PCR儀會實時監測熒光信號的變化，根據熒光信號的閾值和循環數，計算出每個樣本中IL-37基因的相對表達量。為了保證實驗結果的準確性，每個樣本設置3個復孔，同時設置陰性對照（無模板對照）和內參基因（如β-actin）。內參基因用于校正樣本間的差異，使不同樣本之間的基因表達量具有可比性。免疫組織化學檢測的操作步驟如下：將氣道組織樣本制成石蠟切片，厚度為4-5μm。將石蠟切片依次放入二甲苯中脫蠟3次，每次10分鐘，然后依次放入不同濃度的乙醇（100%、95%、85%、75%）中進行水化，每個濃度的乙醇浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗切片。進行抗原修復，將切片放入抗原修復液中，在微波爐中進行加熱修復，使抗原表位充分暴露。修復后，將切片冷卻至室溫，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫下孵育30分鐘，以封閉非特異性結合位點。棄去封閉液，不洗，直接在切片上滴加一抗（兔抗人IL-37抗體），4℃孵育過夜。第二天，將切片從4℃冰箱中取出，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，然后在切片上滴加二抗（羊抗兔IgG抗體，標記有辣根過氧化物酶），室溫下孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，然后在切片上滴加DAB顯色液，顯色5-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現明顯的棕色反應產物時，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應。最后，用蘇木精復染細胞核，然后依次用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察IL-37在氣道組織中的表達部位和表達強度，采用半定量評分方法對染色結果進行分析，評分標準為：陰性（無棕色反應產物）記為0分；弱陽性（棕色反應產物較少，主要分布在細胞質中）記為1分；中度陽性（棕色反應產物較多，細胞質和細胞核均有染色）記為2分；強陽性（棕色反應產物大量分布，細胞質和細胞核均被染成深棕色）記為3分。每個切片隨機選取5個高倍視野（×400）進行觀察和評分，取平均值作為該切片的最終評分。結果分析方面，通過實時定量PCR檢測發現，支氣管哮喘患者氣道組織中IL-37的mRNA表達水平顯著低于健康對照組（P<0.05）。進一步分析發現，IL-37的mRNA表達水平與哮喘患者的病情嚴重程度呈負相關，即病情越嚴重，IL-37的mRNA表達水平越低。免疫組織化學檢測結果顯示，IL-37主要表達于氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞和淋巴細胞等細胞的細胞質中。在健康對照組中，氣道組織中可見較多的IL-37陽性細胞，且染色強度較強；而在支氣管哮喘患者氣道組織中，IL-37陽性細胞數量明顯減少，染色強度也較弱。半定量評分結果顯示，支氣管哮喘患者氣道組織中IL-37的免疫組織化學評分顯著低于健康對照組（P<0.05），且與哮喘患者的病情嚴重程度呈負相關。綜上所述，通過對支氣管哮喘患者和健康對照組氣道組織樣本的采集、處理以及采用實時定量PCR和免疫組織化學檢測方法，發現IL-37在支氣管哮喘患者氣道中的表達水平顯著降低，且與病情嚴重程度密切相關，提示IL-37可能在支氣管哮喘的發生發展過程中發揮著重要的調節作用。3.2白介素37對支氣管哮喘相關炎癥因子的調控作用3.2.1細胞培養模型的建立本研究選用人氣道上皮細胞系（如16HBE細胞）作為研究對象，該細胞系來源于人支氣管上皮，具有典型的氣道上皮細胞特征，能夠較好地模擬體內氣道上皮的生理和病理過程。細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養，定期更換培養基，待細胞生長至對數生長期時進行后續實驗。為了誘導哮喘炎癥模型，采用脂多糖（LPS）聯合白細胞介素-1β（IL-1β）刺激細胞。具體方法為：將處于對數生長期的16HBE細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，培養24h使其貼壁。然后棄去原培養基，用PBS輕輕洗滌細胞2次，加入含1μg/mLLPS和10ng/mLIL-1β的無血清RPMI1640培養基，繼續培養24h。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，能夠模擬細菌感染，激活細胞的炎癥反應；IL-1β是一種重要的促炎細胞因子，在哮喘炎癥中發揮關鍵作用，兩者聯合使用可以更有效地誘導氣道上皮細胞產生炎癥反應，模擬哮喘患者氣道局部的炎癥微環境。為了驗證哮喘炎癥模型的成功建立，收集細胞培養上清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）的含量。結果顯示，與正常對照組相比，LPS聯合IL-1β刺激組細胞培養上清中IL-6和IL-8的含量顯著升高（P<0.05），表明哮喘炎癥模型建立成功。同時，通過觀察細胞形態，發現刺激后的細胞出現形態改變，如細胞腫脹、變圓，部分細胞脫落，進一步證實了炎癥模型的有效性。3.2.2炎癥因子的檢測與分析在成功建立哮喘炎癥細胞模型后，將細胞分為對照組、模型組和不同濃度IL-37干預組（IL-37濃度分別為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）。對照組僅加入正常培養基，模型組加入含LPS和IL-1β的培養基，各IL-37干預組在加入含LPS和IL-1β培養基的同時，分別加入不同濃度的IL-37，繼續培養24h。采用ELISA法檢測細胞培養上清中炎癥因子IL-4、IL-6、IL-13等的含量。具體操作步驟如下：將ELISA試劑盒中的包被抗體按說明書要求稀釋后，加入96孔酶標板中，每孔100μL，4℃過夜孵育，使抗體包被在酶標板表面。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌酶標板3次，每次3min，以去除未結合的抗體。然后加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃孵育1h，封閉酶標板上的非特異性結合位點。封閉結束后，棄去封閉液，用PBST洗滌3次。將細胞培養上清或標準品按倍比稀釋后加入酶標板中，每孔100μL，同時設置空白對照（只加PBST），37℃孵育1h，使樣品中的炎癥因子與包被抗體特異性結合。孵育結束后，棄去樣品液，用PBST洗滌3次。加入生物素標記的檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1h，使檢測抗體與結合在包被抗體上的炎癥因子結合。再次棄去液體，用PBST洗滌3次。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素，每孔100μL，37℃孵育30min，形成抗體-抗原-生物素化抗體-HRP-親和素復合物。最后用PBST洗滌5次，加入TMB底物溶液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20min，此時在HRP的催化下，TMB發生顯色反應。當顯色達到適當程度時，加入終止液（2MH?SO?），每孔50μL，終止反應。在酶標儀上于450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），根據標準品的濃度和OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出樣品中炎癥因子的含量。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測細胞中炎癥因子相關信號通路蛋白的表達水平。首先提取細胞總蛋白，將培養的細胞用PBS洗滌2次后，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動離心管，使細胞充分裂解。然后在4℃下以12000rpm離心15min，取上清液即為細胞總蛋白提取液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白提取液與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般對于IL-4、IL-6、IL-13等炎癥因子相關蛋白，選用10%-12%的分離膠。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用半干轉法或濕轉法均可，轉膜條件根據蛋白分子量和膜的大小進行優化。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下搖床孵育1h，封閉膜上的非特異性結合位點。封閉后，用TBST（含0.05%Tween-20的Tris-緩沖鹽水）洗滌膜3次，每次10min。然后加入一抗（如抗IL-4抗體、抗IL-6抗體、抗IL-13抗體等，按照抗體說明書推薦的稀釋比例稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10min。加入二抗（如羊抗兔IgG-HRP或羊抗鼠IgG-HRP，按照說明書稀釋），室溫下搖床孵育1h。孵育結束后，用TBST洗滌5次，每次10min。最后加入化學發光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統采集圖像，并使用圖像分析軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。結果分析顯示，ELISA檢測結果表明，與對照組相比，模型組細胞培養上清中IL-4、IL-6、IL-13的含量顯著升高（P<0.05），說明成功誘導了炎癥因子的高表達。而不同濃度IL-37干預組中，隨著IL-37濃度的增加，IL-4、IL-6、IL-13的含量逐漸降低，且與模型組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），其中100ng/mLIL-37干預組的炎癥因子含量降低最為明顯。Westernblot檢測結果與ELISA結果一致，模型組中炎癥因子相關信號通路蛋白的表達水平顯著高于對照組，而IL-37干預組中這些蛋白的表達水平明顯降低，進一步證實了IL-37能夠抑制炎癥因子的表達。相關性分析表明，IL-37的濃度與IL-4、IL-6、IL-13的含量之間存在顯著的負相關關系（r<0，P<0.05），說明IL-37對炎癥因子的調控作用具有濃度依賴性。綜上所述，通過細胞培養模型和相關檢測方法，發現白介素37能夠顯著抑制支氣管哮喘相關炎癥因子IL-4、IL-6、IL-13的表達，且這種抑制作用呈濃度依賴性，提示IL-37可能通過調控炎癥因子的表達，在支氣管哮喘的炎癥反應中發揮重要的抗炎作用。3.3白介素37對支氣管收縮和氣道重塑的影響3.3.1離體支氣管環模型實驗為了深入探究白介素37（IL-37）對支氣管收縮的直接影響，本研究采用了離體支氣管環模型實驗。選用健康成年雄性C57BL/6小鼠，體重20-25g，購自[實驗動物供應商名稱]。小鼠在實驗動物房內適應性飼養1周，環境溫度控制在22-24℃，相對濕度為50%-60%，12小時光照/12小時黑暗循環，自由攝食和飲水。實驗時，將小鼠用戊巴比妥鈉（50mg/kg，腹腔注射）麻醉后，迅速打開胸腔，取出氣管及左右主支氣管，置于預冷的Krebs-Henseleit（K-H）液中。K-H液的成分如下（mmol/L）：NaCl118、KCl4.7、CaCl?2.5、MgSO?1.2、KH?PO?1.2、NaHCO?25、葡萄糖11，用95%O?和5%CO?混合氣體飽和，使其pH值維持在7.4。小心去除支氣管周圍的結締組織和脂肪，將支氣管剪成2-3mm長的支氣管環。將支氣管環懸掛于盛有5mlK-H液的離體器官浴槽中，一端固定在浴槽底部的支架上，另一端通過絲線連接到張力換能器（型號：[具體型號]，[生產廠家]），用于記錄支氣管環的張力變化。浴槽內的K-H液保持恒溫（37℃），并持續通入95%O?和5%CO?混合氣體。實驗裝置連接到生物信號采集系統（型號：[具體型號]，[生產廠家]），以便實時監測和記錄支氣管環的收縮和舒張情況。實驗分為對照組、組胺組和IL-37干預組。對照組僅給予K-H液；組胺組給予不同濃度的組胺（10??、10??、10??mol/L），以誘導支氣管環收縮；IL-37干預組在給予組胺前15分鐘，先加入不同濃度的IL-37（10、50、100ng/ml）進行預處理。待支氣管環穩定1小時后，開始實驗操作。每次加入藥物后，觀察并記錄支氣管環張力達到穩定狀態時的數值，每個濃度的藥物重復3次。觀察指標主要包括支氣管環的收縮力和最大收縮幅度。收縮力通過張力換能器記錄的張力值來表示，單位為mN；最大收縮幅度則是指在給予組胺刺激后，支氣管環收縮達到的最大張力與基礎張力的差值。實驗數據采用GraphPadPrism8.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。3.3.2小鼠模型實驗為了進一步研究IL-37對支氣管哮喘小鼠支氣管收縮和氣道重塑的影響，本研究建立了卵清蛋白（OVA）誘導的小鼠哮喘模型。選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，體重18-22g，購自[實驗動物供應商名稱]。小鼠在實驗動物房內適應性飼養1周，環境條件同前。小鼠哮喘模型的建立方法如下：在第0天和第7天，將小鼠腹腔注射致敏液，致敏液為含100μgOVA（Sigma公司）和2mg氫氧化鋁（Al(OH)?，Sigma公司）的生理鹽水溶液，體積為0.2ml。在第14天開始激發，將小鼠置于自制的霧化箱中，用霧化器（型號：[具體型號]，[生產廠家]）將1%OVA生理鹽水溶液霧化，讓小鼠吸入霧化的OVA，每次激發30分鐘，連續激發7天。正常對照組小鼠在相應時間點給予等體積的生理鹽水腹腔注射和霧化吸入。將小鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組和IL-37干預組，每組10只。IL-37干預組在每次OVA激發前30分鐘，腹腔注射IL-37（50μg/kg，用生理鹽水稀釋），哮喘模型組和正常對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射。在末次激發24小時后，對小鼠進行肺功能測試。采用小動物肺功能儀（型號：[具體型號]，[生產廠家]），將小鼠麻醉后（戊巴比妥鈉，50mg/kg，腹腔注射），進行氣管插管，連接到肺功能儀。先測定小鼠的基礎肺功能指標，包括潮氣量（VT）、呼吸頻率（RR）、每分通氣量（MV）等。然后，通過霧化器給予不同濃度的乙酰甲膽堿（Mch，0、6.25、12.5、25、50mg/ml），每次霧化5分鐘，測定不同濃度Mch激發后的肺功能指標，計算氣道阻力（Rrs）和動態肺順應性（Cdyn）。完成肺功能測試后，將小鼠處死，取出肺組織。一部分肺組織用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學檢測。將固定后的肺組織進行石蠟包埋，切成4μm厚的切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織的炎癥細胞浸潤情況；進行Masson染色，觀察氣道平滑肌增厚和細胞外基質沉積情況；進行PAS染色，觀察杯狀細胞增生和黏液分泌情況。采用圖像分析軟件（Image-ProPlus6.0）對染色切片進行分析，測量氣道平滑肌厚度、氣道壁面積、膠原纖維面積等指標。另一部分肺組織用于蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測氣道重塑相關蛋白的表達水平，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原蛋白I（ColI）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。實驗數據采用SPSS22.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。通過以上實驗方法，旨在全面評估IL-37對支氣管哮喘小鼠支氣管收縮和氣道重塑的影響，為進一步揭示其作用機制提供實驗依據。四、白介素37在支氣管哮喘中作用的機制研究4.1免疫細胞活化的調節機制4.1.1免疫細胞在支氣管哮喘中的作用在支氣管哮喘的發病進程中，免疫細胞扮演著極為關鍵的角色，多種免疫細胞相互協作、相互影響，共同推動著哮喘的發生與發展。T淋巴細胞在哮喘的免疫調節中占據核心地位。其中，輔助性T細胞2（Th2）細胞是引發哮喘炎癥反應的主要效應細胞。當機體接觸過敏原后，抗原遞呈細胞（如樹突狀細胞）攝取并處理抗原，然后將抗原信息呈遞給初始T淋巴細胞，使其分化為Th2細胞。Th2細胞分泌一系列細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）和白細胞介素-13（IL-13）等。IL-4能夠促進B淋巴細胞的活化和增殖，使其分化為漿細胞，進而分泌特異性免疫球蛋白E（IgE）。IgE與肥大細胞、嗜堿性粒細胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，使這些細胞致敏。當再次接觸過敏原時，過敏原與致敏細胞表面的IgE結合，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等炎癥介質，引發哮喘的速發型過敏反應。IL-5則主要作用于嗜酸性粒細胞，促進其生長、分化、活化和趨化，使其在氣道局部聚集。活化的嗜酸性粒細胞釋放主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）等毒性蛋白，損傷氣道上皮細胞，加重氣道炎癥，參與哮喘的遲發型過敏反應。IL-13可誘導氣道上皮細胞分泌黏蛋白，增加黏液分泌，導致氣道堵塞，同時還能促進氣道平滑肌細胞增殖和收縮，參與氣道重塑。除Th2細胞外，調節性T細胞（Treg）在哮喘中的作用也不容忽視。Treg細胞具有免疫抑制功能，能夠抑制Th2細胞的活化和增殖，調節炎癥反應。在哮喘患者中，Treg細胞的數量和功能常常出現異常。研究表明，哮喘患者外周血和氣道局部的Treg細胞數量減少，其抑制功能也明顯減弱，導致Th2細胞介導的炎癥反應失控，促進哮喘的發生發展。B淋巴細胞在哮喘中主要通過分泌IgE參與免疫反應。如前所述，在Th2細胞分泌的IL-4等細胞因子的作用下，B淋巴細胞活化、增殖并分化為漿細胞，產生大量的IgE。IgE不僅介導肥大細胞和嗜堿性粒細胞的活化，還能通過與其他免疫細胞表面的受體結合，調節免疫細胞的功能。例如，IgE可以與樹突狀細胞表面的FcεRI結合，增強樹突狀細胞的抗原遞呈能力，進一步促進T淋巴細胞的活化。肥大細胞和嗜堿性粒細胞是哮喘速發型過敏反應的主要效應細胞。它們表面表達高親和力的FcεRI，當IgE與FcεRI結合后，細胞處于致敏狀態。再次接觸過敏原時，過敏原與致敏細胞表面的IgE交聯，激活細胞內的信號通路，導致細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、前列腺素等炎癥介質。這些炎癥介質能夠迅速引起氣道平滑肌收縮、血管通透性增加、黏液分泌增多等病理變化，導致哮喘發作。巨噬細胞在哮喘中具有雙重作用。一方面，巨噬細胞可以作為抗原遞呈細胞，攝取和處理過敏原，將抗原信息呈遞給T淋巴細胞，啟動免疫反應。另一方面，巨噬細胞在炎癥環境中被激活后，會分泌多種細胞因子和炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，參與炎癥反應的放大和維持。此外，巨噬細胞還能吞噬和清除病原體及其他異物，但在哮喘患者中，其吞噬和清除功能可能受到影響，導致炎癥持續存在。嗜酸性粒細胞是哮喘氣道炎癥的關鍵效應細胞之一。在Th2細胞分泌的IL-5等細胞因子的作用下，嗜酸性粒細胞從骨髓中釋放并遷移至氣道局部。嗜酸性粒細胞活化后，釋放多種毒性蛋白和炎癥介質，如MBP、ECP、嗜酸性粒細胞過氧化物酶（EPO）等，這些物質能夠損傷氣道上皮細胞，破壞氣道上皮的完整性，使氣道對各種刺激的敏感性增加。同時，嗜酸性粒細胞還能釋放細胞因子和趨化因子，進一步吸引其他炎癥細胞聚集到氣道，加重炎癥反應。4.1.2白介素37對免疫細胞活化相關信號通路的影響白介素37（IL-37）作為一種重要的抗炎細胞因子，在支氣管哮喘中能夠通過多種途徑調節免疫細胞活化相關信號通路，從而發揮其抑制炎癥的作用。在T淋巴細胞活化過程中，核因子κB（NF-κB）信號通路起著關鍵作用。當T淋巴細胞受到抗原刺激時，細胞內的IκB激酶（IKK）被激活，使IκBα磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核，與相關基因的啟動子區域結合，促進炎癥因子（如IL-2、IL-4、IL-5、IL-13等）的轉錄和表達，導致T淋巴細胞活化和增殖。研究表明，IL-37能夠抑制NF-κB信號通路的激活。在體外實驗中，將IL-37作用于T淋巴細胞，發現其可以抑制IKK的活性，減少IκBα的磷酸化和降解，從而阻止NF-κB的核轉位，降低炎癥因子的表達水平。這一作用機制使得IL-37能夠有效抑制Th2細胞的活化和增殖，減少其分泌的細胞因子，從而減輕哮喘的炎癥反應。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是調節T淋巴細胞活化的重要途徑。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號轉導途徑。當T淋巴細胞受到刺激時，MAPK信號通路被激活，通過一系列的磷酸化級聯反應，激活下游的轉錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，促進炎癥因子的表達。IL-37可以抑制MAPK信號通路的激活。實驗研究發現，IL-37能夠降低T淋巴細胞中ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平，從而抑制AP-1的活性，減少炎癥因子的轉錄。這一調節作用有助于抑制T淋巴細胞的活化，減輕哮喘炎癥。在B淋巴細胞活化方面，IL-37也具有重要的調節作用。B淋巴細胞的活化需要多種信號的協同作用，其中B細胞抗原受體（BCR）信號通路是關鍵的活化信號。當BCR與抗原結合后，會激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ），PLCγ水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使內質網釋放鈣離子（Ca2+），使細胞內Ca2+濃度升高，激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK）等信號分子；DAG則激活蛋白激酶C（PKC），進一步激活下游的信號通路，導致B淋巴細胞活化、增殖和分化。研究表明，IL-37可以抑制BCR信號通路的激活。在體外實驗中，將IL-37作用于B淋巴細胞，發現其可以減少BCR刺激后PLCγ的磷酸化水平，降低細胞內Ca2+濃度的升高幅度，抑制PKC的活性，從而抑制B淋巴細胞的活化和增殖，減少IgE的分泌。這一作用機制有助于減輕哮喘中IgE介導的過敏反應。對于肥大細胞和嗜堿性粒細胞，IL-37同樣能夠調節其活化相關信號通路。當肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcεRI與IgE及過敏原結合后，會激活一系列的信號通路，包括Syk激酶、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等信號分子，導致細胞脫顆粒和炎癥介質的釋放。IL-37可以抑制這些信號通路的激活。實驗結果顯示，IL-37能夠降低肥大細胞和嗜堿性粒細胞中Syk激酶的磷酸化水平，抑制PI3K的活性，減少炎癥介質的釋放。這一調節作用有助于減輕哮喘的速發型過敏反應，緩解哮喘癥狀。巨噬細胞的活化也受到IL-37的調節。Toll樣受體（TLR）信號通路在巨噬細胞的活化中起著重要作用。當巨噬細胞表面的TLR識別病原體相關分子模式（PAMP）或損傷相關分子模式（DAMP）時，會激活下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴性和非依賴性信號通路。MyD88依賴性信號通路通過激活IKK和MAPK信號通路，促進炎癥因子的表達；非依賴性信號通路則通過激活干擾素調節因子（IRF），促進干擾素（IFN）的表達。IL-37可以抑制TLR信號通路的激活。研究發現，IL-37能夠抑制巨噬細胞中MyD88的表達和磷酸化，減少IKK和MAPK的激活，降低炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的表達水平。這一作用機制有助于抑制巨噬細胞的活化，減少炎癥介質的釋放，減輕哮喘的炎癥反應。綜上所述，IL-37在支氣管哮喘中能夠通過調節免疫細胞活化相關信號通路，抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞和巨噬細胞的活化，減少炎癥因子和炎癥介質的釋放，從而發揮其抗炎作用，為哮喘的治療提供了新的靶點和思路。4.2細胞凋亡的調節機制4.2.1細胞凋亡在支氣管哮喘中的作用細胞凋亡作為一種程序性細胞死亡過程，在支氣管哮喘的發病機制中發揮著多方面的重要作用。在氣道炎癥方面，細胞凋亡對炎癥細胞的清除和炎癥反應的消退至關重要。以嗜酸性粒細胞為例，在支氣管哮喘發作時，大量嗜酸性粒細胞浸潤到氣道組織中。這些嗜酸性粒細胞被激活后，會釋放多種毒性蛋白和炎癥介質，如主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）等，對氣道上皮細胞造成損傷，加重氣道炎癥。正常情況下，隨著炎癥的逐漸消退，嗜酸性粒細胞會發生凋亡。凋亡的嗜酸性粒細胞會被巨噬細胞等吞噬細胞識別并吞噬清除，從而減少炎癥介質的釋放，終止炎癥反應。如果嗜酸性粒細胞凋亡異常，如凋亡延遲或受阻，它們將持續存活并釋放炎癥介質，導致氣道炎癥持續存在，難以消退。研究表明，在哮喘患者的氣道中，?？捎^察到嗜酸性粒細胞凋亡延遲的現象，這與氣道炎癥的慢性化和反復發作密切相關。細胞凋亡對氣道組織的修復和重塑也具有重要影響。氣道上皮細胞在哮喘炎癥過程中會受到損傷，正常的細胞凋亡有助于清除受損的氣道上皮細胞，為新生上皮細胞的增殖和修復提供空間。然而，過度的細胞凋亡可能導致氣道上皮細胞大量缺失，影響氣道上皮的完整性和功能，進而促進氣道重塑的發生。氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，表現為氣道平滑肌增厚、細胞外基質沉積、血管生成增加等。在氣道重塑過程中，成纖維細胞的增殖和活化起著關鍵作用。研究發現，細胞凋亡相關的信號通路異?？赡苡绊懗衫w維細胞的凋亡，導致成纖維細胞過度增殖和存活，分泌過多的細胞外基質，如膠原蛋白、纖連蛋白等，從而加重氣道重塑。例如，在哮喘動物模型中，抑制成纖維細胞的凋亡會導致氣道壁增厚和細胞外基質沉積增加。在免疫調節方面，細胞凋亡參與了免疫細胞的更新和免疫平衡的維持。T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞在免疫應答過程中會發生增殖和活化，當免疫應答結束后，部分免疫細胞需要通過凋亡來實現自我更新，以維持免疫系統的穩態。在哮喘患者中，免疫細胞的凋亡異?？赡軐е旅庖哒{節失衡。如Th2細胞凋亡減少，會使其持續活化并分泌大量細胞因子，進一步加重哮喘的炎癥反應；而調節性T細胞（Treg）凋亡增加，則會削弱其免疫抑制功能，無法有效抑制Th2細胞的活化，導致炎癥反應失控。此外，細胞凋亡還可以影響抗原遞呈細胞（如樹突狀細胞）的功能，從而間接影響免疫應答。樹突狀細胞在攝取和處理抗原后，通過凋亡將抗原信息傳遞給T淋巴細胞，啟動免疫應答。如果樹突狀細胞凋亡異常，可能導致抗原遞呈障礙，影響免疫細胞的活化和免疫應答的正常進行。4.2.2白介素37對細胞凋亡相關信號通路的影響白介素37（IL-37）在支氣管哮喘中對細胞凋亡相關信號通路具有顯著的調節作用，主要涉及Caspase家族和Bcl-2家族等關鍵信號分子。Caspase家族在細胞凋亡過程中扮演著核心角色，其中Caspase-