3本標準根據國標委公布的2024年第一批國家標準計劃項目（國標委綜合[2024]16本標準由全國生化檢測標準化技術委員會（SAC/TC387）提出并歸口。國酶學及酶制品等產業起步晚，當前國內生物酶處于性化檢測涉及的生物酶品種多且性能要求高，因而大部分標準，因此阻礙了生物酶的發展，急需建立生物酶檢測檢測技術通則的問題，也可以解決核心原料檢驗技術受術通則工作將有利于提高生物酶及相關生物醫藥、洗滌（1）2022年6月至2022年10月，標準起草單位組織相關技術人員對通則》標準項目進行了預研，課題組成員廣泛收集了國（2）2022年11月至2023年4月相關技術人員撰寫了《生物酶質量評全體專家一致通過，同意牛剛任專家組組長。標4術路線說明、主要技術指標的確定等。專家工作組討論稿進行了討論和質詢，同時對標準可能存物酶的質量進行評價。標準規定了生物酶的質量評價致性、保質期、文件要求）評價方法，評價內容等。作組還需按審查委員會提出的意見建議對標準進行修改14.3“活（性）力”統一參數統一為“活力”，工業上稱為“活力”24.3“85%~115%”不合理在貨架期內，應不低于標示值。酶活力隨著時間的延長或降低。34.4“90%~110%”沒有科學依據“生物酶的純度應不低于標示值”。產品的純度應有個確定值。44.8“85%”不科學去掉“85%”。保質期內實測酶活力不應低于標示值。5/工作要做深入選取代表性試劑，開展相關指標評價工作。6/無安全性指標增加安全性指標（5）2024年4月收到全國生化檢測標準化技術委員會[2024]5號文件關于下達2024年準委關于下達2024年第一批國家標準制修訂計劃的通知》立項文件，計劃編號：點在檢測技術上，對應之前版本的質量檢測指標，建檢測技術，酶活力檢測技術主要有光譜法、電化學方技術和其他方法（等離子共振法、偶聯測定法等光譜法主要分為吸光光度法、熒光光5毛細管電泳雜質檢測主要有化學法、光譜法、色譜法等；安全性檢測中的重金屬檢測主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦和等離子體發射光譜測主要有高效液相色譜法、質譜法、免疫法等；微生物檢測參考食品微生物針對生物酶重要檢測技術進行驗證，如活力、純度等，選取代表性生物酶如激酶等進行驗證。技術通則》標準的起草工作，與會專家就《生物酶術通則》標準進行了修改和完善。完成了《生物酶國生化檢測標準化技術委員會提交了《生物酶檢測技術通則》檢驗規則等）及其確定依據（包括試驗、統計數據修訂國家標準時2）本標準嚴格遵循現行相關法律法規和其他標準，確保在各個層面上與現有規范協3）在標準的編制過程中，嚴格按照GB/T1.1-2020等系列標準的規定，對標準的結構編排、編寫格式和內容表達方法等進行統一2、確定國家標準主要內容（如技術指標、參數、6質量指標以及檢測方法，因此生物酶質量評價通則的質量指標，主要有外觀、酶活力、比活力、質期等，因此綜合以上指標確定生物酶的質量評價雜質、安全性、批內、批間差異、保質期，后面標類型標準編號標準名稱發布日期實施日期國家標準GB/T36755-2018BSTDNA聚合酶2018-09-172019-04-01國家標準GB/T36757-2018M-MLV反轉錄酶2018-09-172019-04-01國家標準GB/T36389-2018T4DNA連接酶2018-06-072019-01-01國家標準GB/T36390-2018工具酶溶菌酶2018-06-072019-01-01國家標準GB/T35542-2017TaqDNA聚合酶2017-12-292018-07-01國家標準GB/T35540-2017限制性凝血酶2017-12-292018-07-01國家標準GB/T35543-2017核糖核酸酶A2017-12-292018-07-01國家標準GB/T35539-2017限制性核酸內切酶BamHI2017-12-292018-07-01國家標準GB/T35541-2017pfuDNA聚合酶2017-12-292018-07-01國家標準GB/T34793-2017蛋白酶K2017-11-012018-05-011酶的活力和比活力光譜法（吸光光度法、熒光光譜法、濁度測定類型標準編號標準名稱檢測技術國家標準GB/T36756-2018工具酶活性測定通用要求/國家標準GB/T41906-2022超氧化物歧化酶活力檢測方法-分光光度法分光光度法國家標準GB/T41712-2022脫氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及雜質檢測方法分光光度法國家標準GB/T5521-2008糧油檢驗谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定分光光度法國家標準GB/T41907-2022腸激酶活性檢測方法分光光度法國家標準GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及雜質檢測方法瓊脂糖電泳國家標準GB/T34222-2017核糖核酸酶活力檢測方法分光光度法國家標準GB/T34801-2017脫氧核糖核酸酶活力檢測方法分光光度法國家標準GB/T33410-2016生化試劑中蛋白酶K活性檢測方法分光光度法國家標準GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及雜質檢測方法分光光度法國家標準GB/T30990-2014溶菌酶活性檢測方法分光光度法7國家標準GB/T32131-2015辣根過氧化物酶活性檢測方法比色法分光光度法國家標準GB/T33409-2016β-半乳糖苷酶活性檢測方法分光光度法分光光度法國家標準GB/T34795-2017谷氨酰胺轉胺酶活性檢測方法分光光度法國家標準GB/T34799-2017幾丁質酶活性檢測方法分光光度法行業標準NY-3799-2020生乳及其制品中堿性磷酸酶活性的測定發光發光法國家標準GB/T8622-2006飼料用大豆制品中尿素酶活性的測定電化學方法1.1反應條件的選擇要點反應條件對酶活力測定結果影響很大，反應條1.1.1底物類型和濃度（2）對于專一性不強可使用多種底物的酶，所選用的底物必須有足夠的特異性，通常選底物濃度的確定：米氏常數(Km值)是用mol/L表示，對于單底物酶促反應，應選擇底物濃度為Km的（10~20）倍。雙底物酶促反應速度達到最大反應速度的程度一般要求為1.1.2反應溫度對多數酶，其酶活最適宜溫度在（37~40）℃,但有些生物機體相當低的溫度下工作。多數哺乳動物來源的酶，1.1.3反應pH值會降低酶活性。主要表現在兩個方面：①改變底物和底物的結合；②過高或過低的pH都會影響酶的穩定性，進而配制同一pH的緩沖液常常可使用多種化學試劑，此時不僅要考慮試劑的pKa值，以保證有足夠的緩沖能力，還要考慮試劑本身是否具有抑制或根據酶在不同pH條件下的活性繪制曲線，1.1.4反應時間在一定的時間范圍內，最終產物的生成量是與酶活件確定的情況下，可以通過試驗得到反應時間和產物濃1.1.5緩沖液和離子強度在方法設計時，選完緩沖物后，還必須了解不言，隨緩沖液濃度增加，電解質干擾酶和底物結合，濃度時，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度對于生物緩沖液，如三羥甲基氨基甲烷、三乙將pH調到要求范圍。不控制溫度，不用pH計盲目進行配1.1.6其他因素輔助因子是與酶蛋白疏松結合的小分子量的輔基多為金屬離子，如K+、Na+、Ca），9值得注意的是，很少量的激活劑或抑制劑就和抑制劑不是絕對的，有些物質在低濃度時為某種酶抑制劑。例如，氯化鈉達到三分之一飽和度時就可值得注意的是，酶活性的發揮與介質有關，經常測定結果并不會成正比例地改變，可能與激活劑、等因素有關。因此，樣品與反應液總量的比例一當的波長，測定反應過程中反應進行的情況。該方法變化，已成為酶活力測定中一種重要地方法之一。幾1.2紫外-可見分光光度法可見光部分的光吸收度的不同，選擇一適當的波長，測方法可以連續地讀出反應過程中光吸收的變化，已成為酶活力測定中一種重要得方法之一。表3可見現有的國家標準中酶活性的檢測方法幾乎都用的此方法，該方法特別適用于含有不飽和鍵，尤其是含有共軛體系的化合物的分析和測定手段，幾乎所有的氧化還原酶都可以采用此法進行光光度法。如蛋白酶類（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性/堿性/酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶）、溶菌酶、a-淀粉酶（中溫、耐高溫）、纖維素酶、果膠酶、乳糖酶、谷氨酰蔗糖酶，血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和γ-谷氨酰基轉移酶的參考測量方法中，均采用紫外-可見分光光度法，紫外-可見吸光光度設備價格相對低廉，成本較低，操作簡便，應用范圍廣泛，可檢測到nmol·L-1水平的變化；該方法的1.3熒光分光光度法有高靈敏度和高專一性的優點，如可用來測定端1.4色譜技術底物或產物可以通過其物理性質的不同進行分離鑒），分離色譜法、凝膠過濾色譜法、氣相色譜法等，這些相色譜法因其高效、快速、高靈敏度等特點在酶活1.5質譜技術質譜技術用于生物酶活性的檢測，是對游離酶質譜對產物或底物進行測定，是常用的質譜檢測生以是有機物，也可以是無機物，被分析的樣品形態可敏度、高通量和高選擇性的優點，樣品用量少，能夠1.6其他技術2生物酶的純度生物酶的純度，是從生物酶樣品中確定目標類型標準編號標準名稱檢測技術國家標準GB/T40174-2021工具酶純度的檢測方法國家標準GB/T34223-2017核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶純度檢測方法2.1.1光譜掃描法一種純度的生物酶溶液在一定的波長范圍內進行光譜掃描就會得到一個特征吸收光譜，可以根據掃描光譜的吸收曲線的形狀，吸收峰的位用紫外吸收光譜測定生物酶的純度，既方便2.1.2光吸收比值法一種純物質在紫外光區有其最大吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白類生物酶的最大吸收峰在280nm，同一溶液在這兩種波長下測得的光吸收值是不同的，利用在280nm和260nm處測得的光吸收值之比，即可得到蛋白類生物酶的純度，如純核酸的標準特點：僅限于蛋白類生物酶溶液中含有核酸或核2.2.1保留值法在一定的層析條件下各種生物酶組分在層析柱內的如：排阻層析根據生物酶不同的分子量可得到不同2.2.2基準物標定法2.2.3層析的模式層析分析鑒定法的方法很多，但根據層析的分離機制來分2.2.4幾種層析方法的比較表5常見的層析方法電泳鑒定生物酶純度的方法有：凈電荷電泳（PAGE）、SDS-電泳（SDS）、等電聚焦電泳（IEF）、雙向電泳（2D-PA），表6常見的電泳方法3生物酶的雜質類型標準編號標準名稱檢測技術國家標準GB/T34776-2017T4DNA接酶酶活及雜質檢測方法國家標準GB/T34800-2017蛋白酶K酶活力及雜質檢測方法分光光度法國家標準GB/T41712-2022脫氧核糖核酸酶Ⅰ酶活及雜質檢測方法分光光度法生物酶的雜質主要有工藝相關的雜質和產品響生物酶純度的主要因素，如果生物酶中含有生物酶中雜質的分析技術包括化學法、光譜降解產物的特性采用不同的檢測技術，對于生物酶中法主要為高效液相色譜法、氣相色譜法和毛酸酶和/或RNase殘留等雜質，通常采用酶與核酸底物孵育，瓊脂糖凝膠電泳的方式檢通過檢測核酸底物的降解情況，判斷核酸酶的殘留情測宿主細胞核酸(HCD)和宿主細胞蛋白（HCP）殘留。宿主細胞核酸檢測可采用DNA探針雜交法、熒光染色法或定量PCR法；宿主細胞蛋白可采用酶聯免疫吸附法、質譜分析法、4批內、批間差異檢測批內差異檢測是相同測量程序、相同操作者、相同點，在短時間段內對一批內樣品進行重復測量，至少進同測量程序、相同操作者、相同測量系統、相同操作條件和相同地點，3個不同批號的生物酶制品，每個批號重復測量3次，計算均值，同時按以下公式計算相對極差，則為生物1N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽234RO水調零，使用磷酸鹽緩沖液或底物原液調節溶液吸于0.585應逐步添加約0.5mL～1mL磷酸鹽緩沖液以確保在吸光度范圍內，配表9主要測定儀器(分光光度計)和主要輔助儀器列表名稱要求電子天平精度0.00001紫外-可見分光光度計恒溫水浴pH計移液器200uL、1000uL、5mL點式溫度計表10胰蛋白酶活性測定條件參數指標溫度25℃±0.1℃波長光徑10.00mm±0.1mm測定時間讀數(測定點)②將底物工作液和酶溶液在25℃±0.5℃平衡。③取光程為1cm的帶蓋石英比色皿，用5mL移液器加入底物溶液（恒溫于25.0℃±0.5℃)3.0mL放入分光光度計比色池，用點式溫度計測量比色皿內溫度，待溫度恒定至25.0℃±0.1℃時，用200μL移液器加入0.001mol/L鹽酸溶液200μL，攪拌混勻，作為空即計時，每隔30s讀取吸光度，共5min。記錄每個時間點下的吸光度值，每30s吸光度的P=對胰蛋白酶活性測定方法線性范圍、準確度、精密本研究胰蛋白酶活性測定方法中胰蛋白酶工作濃度為50U/mL-60U/mL，因此將標準測定方法重復測定活性3次，繪制不同酶濃度與吸光度變化平均值的關系圖并計算線性回吸光度變化值及活性數據如表5所示，不同酶濃度與吸光度變化平=0.0003x-0.0008，r=0.9948知，本方法在25U/mL～250U/mL范圍內測出的活性相對標準偏差為3.44%，表明在此范圖1不同酶濃度與吸光度變化平均值的線性圖濃度（U/mL）吸光度變化值吸光度變化平均值0.007424.7250.00850.00790.01730.008228.327.830.555.0550.01580.01570.02120.016553.854.554.895.20.02130.02140.028795.295.796.70.04480.04500.04580.05970.04522000.05770.05700.07750.058258.32500.08050.07900.079268.3263.3263.3用0.001mol/LHCl將胰蛋白酶稀釋至66U/mL、55回收率=高（1.2:1）、中（1:1）、低（0.8:1）胰蛋白酶濃度下的試驗數據如表6所示，結果顯及AOAC《GuidelinesforSingleLaboratory活性（U/mL）平均活性（U/mL）回收率（%）平均回收率（%）66554465.766.765.755.053.854.843.843.046.266.054.544.3100.0099.15100.6899.94依法測定胰蛋白酶活性，重復測定6次，計算6次重復性試驗結果如表7所示，結果顯示重復性試驗的相對標準偏差為1.76%，表明表13重復性試驗結果重復次數活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1230203307330171.76429935295662974換一個操作人員，換一臺設備采用相同方法測6次再現性試驗結果如表8所示，結果顯示再現試驗的相對標準偏差為1.76%，表明此表14再現性試驗結果重復次數活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）1234320756糜蛋白酶是與胰蛋白酶作用、用途相似的酶，能迅取過程中容易殘留的雜質，因此將建立的胰蛋胰蛋白酶溶液在不同廠家的設備上測定活性，重復測定3次，計算相對標準偏差。不表15不同設備試驗結果設備名稱活性（U/mg）平均活性（U/mg）RSD（%）譜析-單光束320131714.13譜析-雙光束島津-雙光束3147316533293456342034763133303831123165葡萄糖脫氫酶（GDH）以D-葡萄糖（D-Glucose）為底物，將D-葡萄糖氧化，同時還原吩嗪硫酸甲酯（Phenazinemethosul（Sodium2,6-dichloroindophenolatehydrate,DCIP）進一步氧化還原反應的DCIP，此過程中DCIP的顏色由藍色轉為無色，氧化態DCIPpMS?p.PMS(還原態)+DCIP—→PMS+DCIP(還原態)①試劑Ⅰ：50mMPIPES-NaOH配制完成后6小時內使用完畢）議配制完成后6小時內使用完畢）將1mg/mL的供試品用冰預冷的酶稀釋液在冰上進一步稀釋約4000-8000倍（稀釋至ΔA—酶促反應進行每分鐘的吸光值變化，ΔAdf—稀釋倍數；16.8—2,6-二氯靛酚鈉鹽在600nm處的微摩爾消光系數，單位為平方厘米每微摩爾內，測得活性RSD在實際測量值與標稱值差實際測量值與標稱值差 在0.05-0.20U/mL范圍內，測得葡萄糖脫氫酶的活性RSD在表17線性范圍驗證結果樣品名稱稀釋酶活梯度測得酶活性（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脫氫酶0.20U/mL14567.1714782.4820.10U/mL14604.100.05U/mL15176.16果如下表所示。結果表明，所有的葡萄糖脫氫酶均因此標稱活性與本檢測結果也會存在差異。這也進表18準確度驗證結果樣品名稱廠家標稱酶活性（U/mL）測得酶活性（U/mL）測得酶活性/標稱酶活性（%）葡萄糖脫氫酶Av2000021994.59葡萄糖脫氫酶Bh50004510.9290葡萄糖脫氫酶Cx2027414506.6172葡萄糖脫氫酶Dd1000010735.06表19精密度（重復性）驗證結果樣品名稱酶活性1（U/mL）酶活性2（U/mL）酶活性3（U/mL）平均酶活性（U/mL）RSD（%）葡萄糖脫氫酶A20104.8321938.4723940.4621994.599葡萄糖脫氫酶B4390.774760.364381.634510.925葡萄糖脫氫酶C14371.6014835.5714312.6614506.612葡萄糖脫氫酶D10442.6610660.7710735.063測定原理CUNG，尿嘧啶-DNA糖基化檢測到熒光，且熒光值與DNA量在一定范圍內成正比。此實驗過程移液器、掌上離心機、微孔板離心機、渦旋混勻③PicoGreen染色液：按100μL1×TE+0.5μLpicogreen體系配制工作液表20反應體系試劑體積(μl）DDWto5010×Taq緩沖液5dUTPmix1UDNA-F(10μM)2UDNA-R(10μM)2LamdaDNA(1ng/μl)1TaqDNA聚合酶(5U/μl）2.5表21反應體系組分體積μlDDW10×Taq緩沖液2UDNA驗證結果表22驗證結果項目可接受標準驗證結果結論精密度重復性：測定3次的數據CV≤10.0%中間精密度：三個分析人員重復性：一個人測定3次的數據CV為4.39%。中間精密度：三個分析人員合格線性范圍1.線性驗證：曲線上下平臺至少2個點，指數增長期至少3個點。2.R2≥0.991.S曲線的上平臺和下平臺有3個點，指數增長期有3個點2.R2＞0.99合格在0.017-100mU/μL范圍內，測定酶濃度與雙鏈DNA熒光值的關系，擬合非線性回歸曲線，R2＞0.99。見下表表23線性范圍驗證結果熒光值酶濃度mU/μL實驗1實驗2實驗356635545.4545454559716120.661157027591789.3914350114.2688340962682982561.9403791354415014440.8819905166547596610.400904788299738640.182229445103011089880.0828315661076115510680.0376507121117120510860.01711396113212291090上平臺點數333下平臺點數333指數增長期666ES501.1