NK細胞培養過程中貼壁細胞來源及其潛在影響在滋養層法擴增NK細胞的過程中，培養瓶底部常常出現的貼壁細胞可能涉及多種來源，其性質和影響需根據具體情況進行分析。一、貼壁細胞的來源與鑒定1.常見貼壁細胞類型-外周血中的單核細胞/巨噬細胞-來源：初始分離的PBMC中含有部分CD14+單核細胞，在培養早期（24-48小時）貼壁分化成巨噬細胞或樹突狀細胞。-鑒定：通過流式檢測CD14、CD11b、CD68等標志物確認。-成纖維細胞或其他基質細胞-來源：罕見，可能因操作污染（如血清或試劑污染）引入。-鑒定：形態學（長梭形）結合Vimentin、α-SMA等標志物檢測。-NK細胞亞群貼壁-來源：某些激活的NK細胞（尤其是CD56bright亞群）可能短暫貼壁，但比例極低。-鑒定：流式檢測CD56、CD16、CD3排除T細胞污染。2.與滋養層細胞無關-輻照后的K562細胞為懸浮生長，不會貼壁，若發現貼壁細胞，可排除滋養層殘留。二、貼壁細胞對NK擴增的潛在影響1.負面影響（需重點關注）-競爭資源：-單核/巨噬細胞消耗培養基中的營養成分（如葡萄糖、谷氨酰胺）和生長因子（如IL-2、IL-15），降低NK細胞擴增效率。-分泌抑制性因子：-單核細胞可能分泌IL-10、TGF-β或前列腺素E2（PGE2），抑制NK細胞活化與細胞毒性（如降低IFN-γ和穿孔素表達）。-物理屏障效應：-貼壁細胞占據培養表面，阻礙NK細胞與懸浮滋養層細胞的接觸，削弱共刺激信號傳遞。-非特異性炎癥干擾：-巨噬細胞可能分泌TNF-α、IL-6等促炎因子，改變培養微環境，導致NK細胞功能紊亂。2.中性或潛在正面作用（罕見）-抗原提呈輔助：若貼壁細胞為樹突狀細胞，可能通過MHC-I/II分子提呈抗原，增強NK細胞適應性免疫應答（需實驗驗證）。-細胞因子補充：某些基質細胞可能分泌少量SCF或FLT3L，輔助造血細胞存活（但對NK擴增作用微弱）。三、是否需去除貼壁細胞1.建議去除的情況-單核/巨噬細胞污染明顯：若貼壁細胞占比>5%（通過鏡檢或流式評估），需及時清除；-NK擴增效率顯著下降：如擴增倍數低于預期50%以上，且伴隨抑制性因子（IL-10）升高；-臨床級生產要求：需高度純凈的NK細胞產品時，貼壁細胞可能被視為雜質。2.去除方法-物理轉移法：在培養24-48小時（單核細胞貼壁高峰期），將懸浮細胞（含NK及滋養層）輕柔轉移至新培養瓶；（2）原瓶保留貼壁細胞繼續觀察，若為雜質可廢棄。-梯度離心輔助：-使用Ficoll或Percoll梯度離心，富集懸浮的NK細胞并去除貼壁成分。-選擇性清除：-添加CD14微磁珠分選或塑料貼壁法預處理PBMC，從源頭減少單核細胞污染。3.無需去除的情況-貼壁細胞比例極低（<1%）：對NK擴增無明顯干擾；-研究性實驗容忍雜質：若關注NK功能而非絕對純度，可忽略少量貼壁細胞。四、預防貼壁細胞產生的關鍵措施1.優化PBMC分離-密度梯度離心法升級：-使用淋巴細胞分離液（如Lymphoprep?）嚴格按標準流程操作，減少單核細胞殘留；-單核細胞主動去除：-分離后PBMC在培養瓶靜置2小時，棄去貼壁細胞后再收集懸浮細胞用于NK擴增。2.調整培養條件-無血清培養基：-改用無血清培養基，抑制單核細胞貼壁分化；3.功能驗證-流式監控：定期檢測CD14+細胞比例，確保<1%；-功能對比實驗：平行比較去除/保留貼壁細胞的NK擴增效果（擴增倍數、CD107a脫顆粒率）。五、典型案例與解決方案案例1：單核細胞殘留導致NK擴增失敗-現象：培養第3天貼壁細胞占比30%。-解決：第3天進行換液換瓶處理，此種方法能夠有效去除貼壁細胞。案例2：基質細胞污染干擾-現象：長期傳代培養中出現成纖維樣貼壁細胞，NK細胞活性下降。-解決：更換血清批次并徹底消毒操作臺，污染消除后NK功能恢復。總結1.貼壁細胞多為殘留單核/巨噬細胞，對NK擴增通常有害，建議通過轉移懸浮細胞或預處理PBMC去除；2.操作核心：從