親和純化高等生物別離工程一、親和層析(一)親和層析的原理(二)親和層析的特點(三)親和層析的根本概念(四)親和層析的根本操作(五)親和層析的應用與實例二、金屬鰲合層析三、親和膜本章主要內容酶與輔酶或酶與底物〔產物或競爭性抑制劑等〕抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結合蛋白，凝集素與多糖〔或糖蛋白、細胞外表受體〕核酸與互補鏈〔或組蛋白、核酸多聚酶、結合蛋白〕細胞與細胞外表特異蛋白〔或凝集素〕等。親和層析

AffinityChromatography許多物質都具有和某化合物發生特異性可逆結合的特性親和層析法就是利用化學方法將可與待別離物質可逆性特異結合的化合物〔稱配體或配基〕連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結合而留在柱上，其他物質那么被沖洗出去。然后再用適當方法使這種生物大分子從配體上別離并洗脫下來，從而到達別離提純的目的。〔一〕親和層析的原理配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯試劑載體配體載體與配體交聯體雜質游離配體雜質親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連，作為固定相吸附劑當含有混合組份的樣品(流動相)通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結合，其它沒有親和力的無關組份就隨流動相流出

然后改變流動組成份，將結合的親和物洗脫下來(一)親和層析的原理親和結合包括以下幾個方面的相互作用:

靜電作用親和作用分子對的結合部位上帶有相反電荷時,產生靜電引力。氫鍵如果親和作用分子對的一方分子中含有氧原子或氮原子,結合部位之間可以產生氫鍵作用。疏水性相互作用如果親和作用分子對的一方分子上含有芳香環或烴基鏈等疏水基,另一方的結合部位上也含有疏水區,那么兩者之間可發生疏水性相互作用。配位鍵如果親和作用分子對均與同一金屬原子配位,那么兩者之間可以通過金屬配位鍵間接結合。弱共價鍵結合力較弱的可逆共價鍵。(一)親和層析的原理(二)親和層析的特點純化過程簡單、迅速，且別離效率高31純化倍數大，產物純度高33必須針對某一別離對象制備專一的配基及尋求穩定的層析條件34特別適用于別離純化一些含量低、穩定性差的生物大分子32親和層析載體的選擇具有多孔的立體網狀結構，能使被親和吸附的大分子自由通過具有良好機械性能的均勻珠狀顆粒，具有良好的流速具有惰性，盡量減少非專一性吸附具有相當量的易活化的基團，在溫和的條件下能與配基共價和偶聯在偶聯、吸附和洗脫時，有較好的物理化學穩定性

(三)親和層析的根本概念親和層析載體的性質與選擇常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠

瓊脂糖凝膠

多孔玻璃珠1〕纖維素：自然界中數量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其結構緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。活化后常帶有電荷，非特異性吸附較強，加上空間位阻等原因，其應用不如凝膠載體廣泛。目前主要用于別離與核酸有關的物質。2〕瓊脂糖凝膠：用于親和層析的主要為交聯珠狀凝膠。這類載體能使吸附物質保持活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑大，流速快。常用的親和層析載體親和層析載體的性質與選擇常用的親和層析載體親和層析載體的性質與選擇5〕多孔玻璃珠：化學和物理穩定性好，機械強度高，不但能抵御酶及微生物的作用，還能耐受高溫滅菌和較劇烈的反響條件。缺點：親水性不強，對蛋白質尤其是堿性蛋白質有非特異性吸附，而且可供連接的化學活性基團也少。改進方法：用葡聚糖包被玻璃珠，那么可改善其親水性并增加化學活性基團。用抗原涂布的玻璃珠已成功地別離了免疫淋巴細胞，在DNA連接的玻璃珠上純化了大腸桿菌的DNA和RNA聚合酶。常用的親和層析載體親和層析載體的性質與選擇純化對象和配體之間必須有較強的親和力但親和力太高也是有害的，因為在解離配體復合物時所需的條件就要強烈，這樣可能使生物分子變性配體必須具有適當的化學基團，這種基團不參與配體與生物分子之間特異結合，但可用于和載體相連，同時又不影響配體與生物分子之間的親和力親和層析配體的性質與選擇親和層析配體的選擇親和層析配體的性質與選擇配體的偶連酸酐法疊氮化作用復原性烷基化合物〔西夫堿〕的形成1,非特異性洗脫通常采用改變pH、離子強度、離子種類或者溫度等使與固定配體結合的生物大分子的構象發生變化，降低其親和力，但使用較廣泛的是改變溶液的離子強度。非專一性洗脫劑的作用并不是使被吸附的生物大分子的構象發生變化，而是洗脫劑中的某一組分與固定配體形成復合物，使固定化的配體對相應的生物大分子的親和力降低。(四)親和層析的根本操作洗脫類型

(一)2,特異性洗脫使用特異的配體作為洗脫劑使用含有與親和配體或目標產物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配體或目標產物的競爭性結合來洗脫目標產物(四)親和層析的根本操作3,特殊性洗脫親和雙方吸附能力很強，可以用專一的化學方法裂解配體與載體的連接鍵，獲得的配體-蛋白絡合物后，再除去配體。實際上特殊性洗脫法也是一種非特異性洗脫方法。(四)親和層析的根本操作洗脫方式(二)1,一步洗脫屬于非選擇性洗脫方法，應用于高度特異性吸附劑的結合，經過一次洗脫將被吸附物質全部洗脫下來，就可得到較純的別離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強度、溫度和介電常數等因素的影響，有效的洗脫液既能改變被吸附蛋白質的構象以降低蛋白質與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質和親和吸附劑的穩定性。2,分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應用于基團特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡相同的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。3,梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附能力逐漸增強，對吸附性質相同、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可能得到較純的別離對象。此方法需要有梯度混合儀來實現洗脫液的梯度變化。(四)親和層析的根本操作(四)親和層析的根本操作1溫度2抑制氫鍵形成的物質3離子強度pH4影響親和層析的主要因素(三)5鰲合劑1離子強度如果親和作用主要源于靜電引力,那么提高離子強度無疑會減弱甚至完全破壞親和作用。氫鍵的形成同樣基于靜電引力,因此提高離子強度也會降低或消除氫鍵作用。疏水性相互作用隨離子強度提高而增大。許多親和吸附的目標蛋白可用高濃度鹽溶液洗脫,說明靜電引力在親和作用中占有重要地位。由于溫度升高使得分子和原子的熱運動加劇,結合部位的靜電作用、氫鍵以及金屬配位鍵減弱,但可使疏水性相互作用增強。

溫度2

抑制氫鍵形成的物質3脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵的形成。但是,脲和鹽酸胍是蛋白質的強烈變性劑,高濃度下容易引起蛋白質的變性失活。pH4蛋白質多為兩性電解質,含有許多解離基團,不同解離基團的解離常數不同。如果靜電引力對親和作用的奉獻較大,那么pH將嚴重影響親和作用,即在適當的pH下親和作用效果較強,而在其他pH下親和結合作用減弱或完全消失。在親和別離操作中,溶液pH值的選擇是非常重要的。5鰲合劑1,抗原和抗體

利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行別離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合于親和層析基質上，就可以從血清中別離其對應的抗體。(五)親和層析的應用抗原、抗體間親和力一般比較強，其解離常數10–8-10–12M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強烈的洗脫條件。(五)親和層析的應用3,凝集素和糖蛋白

凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于別離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細胞。(五)親和層析的應用用凝集素作為配體的親和層析是別離糖蛋白的主要方法。4,多核苷酸和核酸

利用poly-U作為配體可以用于別離mRNA以及各種poly-U結合蛋白。poly-A可以用于別離RNA聚合酶以及其它poly-A結合蛋白。以DNA作為配體可以用于別離各種DNA結合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。(五)親和層析的應用5,輔酶

核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應酶的親和力可以對多種酶類進行別離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應用很廣泛，可以用于別離各種激酶和脫氫酶。(五)親和層析的應用6,別離病毒、細胞

利用配體與病毒、細胞外表受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細胞的別離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細胞的別離。

例如各種凝集素可以用于別離紅細胞以及各種淋巴細胞，胰島素可以用于別離脂肪細胞等。(五)親和層析的應用實例1:親和層析法制備谷胱甘肽S-轉移酶(GST)GST參與芳香環氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用。GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與復原型谷胱甘肽〔GSH〕的親核基團GS－反響，中和它們的親電部位，使產物水溶性增加，經過一系列代謝過程，最后產物為巰基尿酸，被排出體外，從而到達解毒目的。親和層析利用GST和其底物GSH的特異性結合來進行GST的別離純化。緩沖液A：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L二硫蘇糖醇〔DTT〕，1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCl緩沖液B：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT注：根據酶的性質在別離純化過程中需要參加適量的金屬鰲合劑、復原劑等，以保持酶的活性。所需試劑1.親和層析介質Sepharose4B-GSH的制備：Sepharose4B在堿性條件下，參加環氧氯丙烷和二氧六環活化將GSH偶聯到載體上，制成專一吸附劑。2.親和層析柱的準備：裝柱:柱床體積約4-6mL〔柱高約2-3cm〕，連接蛋白監測系統，用BufferA平衡〔約10-20mL〕，至記錄儀基線平穩。3.上柱樣品的準備：(1)按照兩組4g兔肝，剪碎，參加約10倍組織重的BufferA，用組織搗碎機勻漿。(2)勻漿液先用低速離心機離心10min，棄沉淀，上清再次離心〔4℃，100000g，40min〕，棄沉淀，濾紙過濾上清液。實驗步驟4.親和層析柱別離GST：(1)上柱：將濾液上柱，流速約4-5秒1滴。(2)平衡：用BufferA洗去雜蛋白至柱中介質變白，記錄儀回到基線(3)洗脫：用BufferB洗脫，流速約4-5秒1滴，收集洗脫峰(約5mL)分裝冷凍。上樣平衡洗脫親和層析分離GST示意圖

實例2:色素親和層析三嗪類色素配基的特點是化學穩定性高,價格廉價,適用范圍廣,親和結合力適中,蛋白質容量大。因此,色素親和層析的操作本錢低廉,有很高的實用價值。基于色素的蛋白質結合作用與鹽濃度的關系,色素親和層析的吸附操作通常在低鹽溶液中進行。用相同的低濃度鹽溶液清洗后,通過逐次或線性提高鹽濃度的梯度洗脫法洗脫目標產物。色素親和層析純化脫氫酶:1)取3L菌體細胞抽提液,用低濃度鹽溶液A清洗,除去未吸附的雜蛋白。2)逐次用高濃度鹽溶液B和輔酶Ⅰ溶液C洗脫,分別獲得羥基酪酸脫氫酶(3-HDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活性峰。3)收集3-HDH活性局部超濾濃縮到200mL后透析脫鹽。4)再參加到另一個色素親和柱,二次純化。經過兩次純化,3-HDH比活提高213倍,第一步34.4倍,第二步6.2倍,最終收率為78%。(孫彥?生物別離工程?P209)金屬螯合層析

(MetalChelatingChromatography)金屬螯合層析技術在現代基因工程中常用于表達蛋白的分離

用基因工程的手段表達蛋白質，必需經過純化才能實現最終目的。不同性質的蛋白質純化條件各不相同太難摸索，這一點和核酸相差甚遠，所以將目的蛋白和一個親和純化標簽融合表達，通過親和純化Tag蛋白來純化目的蛋白，就成為常用的迂回手段。實例2:His-Tag融合蛋白6×組氨酸與Ni-NTA的結合是不受構象影響的,在天然或變形的條件下進行一步純化,使用的是溫和的洗脫液環境，結合、洗滌和洗脫步驟不會對蛋白結構產生影響.6×組氨酸標簽比普通的標簽(Tag)要小得多，純化后蛋白可以直接進行下游操作。6×組氨酸可以用于任何表達系統，包括:細菌、桿裝病毒和哺乳動物。6×組氨酸標簽在生理溶液pH下不帶電荷，標簽不會干預重組蛋白的結構和功能。

6×組氨酸標簽免疫原性差，重組蛋白可以不需要除去標簽直接作為抗原進行免疫。利用Xa因子蛋白酶可以方便地將6×組氨酸標簽有效地切除,去除標簽的蛋白可以用作晶體成像或者核磁共振研究。His-Tag的獨特優勢Ni-NTA親和層析純化His-Tag融合蛋白NH2NH2NiHisHisHisHisprotein該通用系統可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。最終在2.5mL的介質中可獲得高達20mg的目的蛋白。純化根本步驟HisTag序列〔6,8或10個連續的組氨酸殘基)與固定His.Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結合。并回收目標蛋白。His結合樹脂可以