ICS11.220B41DB22吉林省地方標準DB22/T2012—2014福氏阿米巴原蟲檢測方法DetectionofNaegleriafowleri吉林省質量技術監督局發布DB22/T2012—2014前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規則起草。本標準由吉林省畜牧業管理局提出并歸口。本標準起草單位：吉林省畜牧獸醫科學研究院。本標準主要起草人：曹利利、姚新華、苑淑賢、程榮華。IDB22/T2012—2014福氏阿米巴原蟲檢測方法警告─使用本標準的人員應有正規實驗室工作的實踐經驗。本標準并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當的安全和健康措施，并保證符合國家有關法規規定的條件。1范圍本標準規定了水環境中福氏阿米巴原蟲的分離鑒定和聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法的技術要求。本標準適用于生活用水、畜舍蓄水池中福氏阿米巴原蟲的檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1耐格里屬阿米巴屬于雙鞭毛阿米巴科原蟲，多孳生于淡水中，有滋養體和包囊2個生活階段，滋養體呈長阿米巴型，大小為7×20μm，在不良環境中可形成有2根鞭毛的滋養體；包囊圓形，直徑9μm，單核?，F知該屬有5個種N．gruberi,N．foweri，N．lovaniensis，N．jadini和N.austratiensis，其中能致病的以福氏耐格里阿米巴原蟲（N．fowleri）為主。人或動物接觸污染水體或在游泳池游泳，福氏耐格里阿米巴滋養體可侵入鼻腔增殖后穿過鼻粘膜和篩狀板，經嗅神經上行入腦部寄生，引起急性原發性阿米巴腦膜腦炎，因此又被稱作“食腦蟲”。體外培養invitroculture將寄生蟲活體結構或活蟲從寄生體內或外部環境中分離出來，放在類似的生存環境（模擬體內溫度，濕度，營養條件），讓蟲體生長發育的方法并維持其結構和功能。1DB22/T2012—2014聚合酶鏈反應（PCR）是一種級聯反復循環的DNA合成反應過程。一般由三個步驟組成：模板的熱變性，寡核苷酸引物復性到單鏈靶序列上以及由熱穩定DNA聚合酶催化的復性引物引導的新生DNA鏈延伸聚合反應的過程。4試劑與材料4.1引物引物序列如下，引物濃度為15pmol/μL。上游引物：5’-GTGAAAACCTTTTTTCCATTTACA-3’下游引物：5’-AAATAAAAGATTGACCATTTGAAA-3’4.2試劑除另有規定，本標準所用試劑均為分析純，水應符合GB/T6682中4.2二級水要求。4.2.1阿米巴生理鹽水(AmebicSaline,簡稱AS)（見附錄A.1）4.2.2阿米巴無營養瓊脂平板(NonnutrientAgar,簡稱NNA)（見附錄A.2）4.2.3滅活大腸桿菌溶液（見附錄A.3）4.2.4阿米巴培養緩沖溶液（見附錄A.4）4.2.5真核細胞DNA提取試劑盒4.2.6標準分子量DL2000Marker4.2.7PCR反應試劑盒4.2.101.0%瓊脂糖凝膠（見附錄A.7）4.2.11電泳上樣緩沖液（見附錄A.8）4.3材料4.3.6吸頭:10μL、200μL、1000μL；4.3.7瓊脂平板。5儀器設備2DB22/T2012—20145.7倒置顯微鏡；5.8恒溫水浴鍋：30-100℃；5.9恒溫培養箱；5.10分析天平：感量0.1g；5.11接種環；5.12接種涂布器；5.134℃冰箱。6樣品6.1采集6.1.1采樣地點畜禽飲用水源、畜舍蓄水池等邊緣。6.1.2采樣位置水面至水面下40㎝。6.1.3采樣方法用無菌試劑瓶直接取指定位置待檢水樣1000mL。6.1.4運輸保存6.2.1待檢水樣經單層紗布初步過濾，去除大的雜質物。6.2.2初過濾完的水樣經5μm濾膜孔的Millipore水過濾系統進行負壓過濾，留濾膜待用。7檢測水樣過濾完后，將濾膜翻轉后蓋于表面涂布滅活大腸桿菌的NNA培養基上，接種后置于28℃培養24h，倒置顯微鏡下觀察滋養體生長情況以判斷培養結果。在20倍或40倍倒置顯微鏡下,檢查NNA平板上的蟲體集落并標記,然后在涂有經滅活大腸桿菌的NNA平板反復轉接培養直至無菌。刮取蟲體,放入盛有0.2mL蒸餾水的1.5mL的離心管中，室溫放置1h，混勻后取少量用100倍顯微鏡觀察鞭毛體。3DB22/T2012—20147.2PCR鑒定7.2.1模版制備刮取集落蟲體，按DNA提取試劑盒說明書操作。7.2.2陽性及陰性對照陽性對照：福氏耐格里阿米巴標準蟲株（例如福氏耐格里阿米巴MW4U株），DNA提取按DNA提取試劑盒說明書操作。陰性對照：用滅菌蒸餾水做相同處理，作為標準陰性對照以及陰性模板。7.2.3PCR反應體系PCR為50μL體系：a)滅菌雙餾水：26μL；b)10倍PCR緩沖液：5μL；c)dNTPs：4μL；d)上游引物：2μL；e)下游引物：2μL；f)模板：10μL；g)TaqDNA聚合酶：1μL。在0.5mL反應管中按上述列表依次加入上述試劑，同時設立標準陰、陽性對照樣品組和待檢樣品組，做好標記。94℃預變性5min；94℃變性30s，52℃復性30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸7min；4℃保存10min。取8μLPCR產物，與2μL上樣緩沖液混合，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。同法加入陰、陽性對照PCR產物及標準分子量DL2000Marker。用紫外凝膠成像儀觀察結果。8結果判定4DB22/T2012—20148.1耐格里阿米巴分離鑒定8.1.1生長軌跡特征在NNA平板上呈放射性生長并在倒置顯微鏡下可見噬菌空斑的，可初步判定為樣品中存在阿米巴原蟲（參考附錄B.5）。8.1.2滋養體形態學特征倒置顯微鏡下可見滋養體呈長圓形，外壁光滑，可初步判定為耐格里阿米巴原蟲（參考附錄B.4）。8.1.3鞭毛體特征顯微鏡下可見一對或多根鞭毛的蟲體，可初步判定為耐格里阿米巴屬原蟲（參考附錄B.6）。8.2PCR鑒定PCR產物電泳后，可見311bp條帶，且陰、陽性對照成立，可判定為福氏耐格里阿米巴原蟲（參考附錄B.7）。9廢棄物處理和防止污染的措施9.1檢測過程中分區操作，防止交叉污染。9.2檢測廢棄物高壓滅菌等無害化處理。9.3實驗前后，實驗室用紫外線消毒。5DB22/T2012—2014AA附錄A（規范性附錄）福氏阿米巴原蟲檢測試劑的配置A.1阿米巴生理鹽水(AS)——NaCl：120mg；——MgSO4.7H2O：4mg；——CaCl.2H2O：4mg；——Na2HPO4：142mg；——KH2PO4：136mg；——蒸餾水：1000mL。121℃15min滅菌，pH=6.8，4℃可保存6個月。A.2無營養瓊脂平板（NNA）——阿米巴生理鹽水：100mL；——瓊脂粉：1.5g；121℃15min滅菌，60℃澆瓊脂平板。制備大腸桿菌液體培養基（LB）1L：——胰蛋白胨：10g；取5mLLB培養基，接種單菌落大腸桿菌，37℃震蕩過夜培養。大腸桿菌溶液121℃高壓10min,冷卻，4℃保存備用。6DB22/T2012—2014A.6TAE電泳緩沖液制備A.6.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液配制（pH8.0）?！叶@四乙酸二鈉：18.6g；——滅菌蒸餾水：80mL；——氫氧化鈉（1mol/LNaOH）調pH值至8.0；——滅菌蒸餾水加至100mL。A.6.250倍TAE電泳緩沖液配制——三羥甲基氨基甲烷（Tris）：242g；——冰乙酸：57.1mL；——0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH值8.0）：100mL；——滅菌蒸餾水加至1000mL。作電泳液使用時，用雙餾水50倍稀釋。A.71.0%瓊脂糖凝膠板制備——瓊脂糖：1g；——50倍TAE電泳緩沖液：2mL；——滅菌蒸餾水：98mL。微波爐中完全融化，待冷卻至50-60℃時，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。溴酚藍0.2g，加10mL滅菌蒸餾水過夜溶解。50g蔗糖加入50mL滅菌蒸餾水溶解后，移入已溶解的溴酚藍溶液中，搖勻定容至100mL。7DB22/T2012—2014BB附錄B（資料性附錄）結果圖示和目的片段序列B.1耐格里阿米巴形態示意圖圖B.1B.2培養陽性結果（滋養體以及包囊×400）圖B.2圖B.3（注：n為細胞核；f為鞭毛）B.4福氏阿米巴原蟲標準株PCR鑒定陽性結果圖8DB22/T2012—2014圖B.4（注：1為DL2000;2為福氏阿米巴原蟲陽性PCR擴增結果）B.5目標片段序列Gtgaaaaccttttttccatttacaaaaaataactctgtgcaatggagcacacggctcgtgtatcgatgaagcccgcggcaaaaagcgatatgtaatgagattcgttagcctcgagattcatcaaattggtgaacacagtctggacctcgcaaga